杨德成毕业论文_重组CHO细胞不同接种密度对最终蛋白产量的影响.docx

4杨德成：重组CHO细胞不同接种密度对最终蛋白产量的影响本科毕业论文 题 目 重组CHO细胞不同接种密度 对最终蛋白产量的影响 学 院 生命科学技术学院 专 业 生物技术（制品方向） 毕业届别 2015届 姓 名 杨德成 指导教师 杨志杰 职 称 讲师 目录摘要- 1 -关键词- 1 -Abstract- 1 -Key words- 1 -前言- 2 -1 实验材料与方法- 3 -1.1 实验材料- 3 -1.1.1 实验仪器- 3 -1.1.2 实验材料，试剂- 4 -1.2 实验过程- 4 -1.2.1 重组CHO细胞的准备- 4 -1.2.2 重组CHO细胞的接种- 4 -1.2.3 重组CHO细胞培养过程- 4 -1.2.4 重组CHO细胞的蛋白检测- 5 -1.2.5 对最终产物蛋白的测定- 5 -2 实验结果分析- 5 -2.1 重组CHO细胞不同接种密度的活细胞数- 5 -2.2 重组CHO细胞不同接种密度的活率变化- 6 -2.3 重组CHO细胞不同接种密度的最终蛋白产量变化分析- 6 -3 讨论- 7 -参考文献- 8 -致谢.-9 -重组CHO细胞不同接种密度对最终蛋白产量的影响杨德成（甘肃农业大学生命科学技术学院生物制品专业，甘肃兰州：730070）摘要：目的：研究重组CHO细胞不同接种密度对最终蛋白产量的影响。方法:用分批补料式培养（Fed-Batch）的培养工艺，CD012化学界定培养基，将重组CHO细胞按不同密度接种在50mlTPP管中，工作体积30ml，在细胞生长到4/6/8/10天时，分别加入细胞工作体积的5%/，2%，/5%，/2%的CD Feed002培养液，待细胞活率低于60%，结束实验，测得细胞上清液的蛋白产量。结果：1.0106cells/ml接种密度的重组CHO细胞蛋白产量最高。关键词：重组CHO细胞，不同接种密度，无血清培养基，蛋白产量，Fed-BatchRecombinant CHO cells, the influence of different seeding density on the final protein productionDe-cheng Yang(Gansu agricultural university, college of life science and technology, biological products major, lanzhou, gansu province, 730070)Abstract:objective: To study the recombinant CHO cells the influence of different density on the final protein yield. Method: To use ethe Fed - Batch process, Chemically defined 012 medium, seeding the different density recombinant CHO cells ein 50 ml TPP tube. the work volume is 30 ml,in 4/6/8/10 days, feed 5% 2%, 5%, 2% CD Feed002 culture respectively, when cells viability is lower than 60%, end the experiment,1Then measured the protein production of the cell supernatant . Results: The protein yield of 1.0 x 106 cells/ml seeding density is the highest Keywords: recombinant CHO cells, different density, Chemically defined medium, protein yield, the Fed-Batch前言本次实验所选用的是重组CHO细胞，但是最初的CHO细胞1,2是由1957年美国科罗拉多大学Dr. Theodore T. Puck从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得。CHO细胞是上皮贴壁型细胞，具有不死性，可以传代百代以上，是生物工程上广泛使用的细胞系。CH0细胞在基因工程使用中还有一个优点，该细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，是一种非分泌型细胞，它本身很少分泌CHO内源蛋白，因此对目标蛋白分离纯化工作十分有利。CHO细胞是表达复杂生物大分子的理想宿主。CHO细胞虽可像微生物细胞一样，在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养，但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比，有显著差别： 动物细胞比微生物细胞大得多，无细胞壁，机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差；倍增时间长，生长缓慢，易受微生物污染，培养时须用抗生素；培养过程需氧量少；培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在；代谢产物具有生物活性，生产成本高，但附加值也高。我们实验所用的重组CHO细胞是经过修饰的CHO细胞，可以表达所需蛋白。目前约70%的重组蛋白是药物由CHO细胞生产3。本次试验我们采用分批补料式培养4（Fed-Batch）工艺。此工艺指先将一定量的无血清培养基（无血清培养基相对有血清培养基来说，组成成分相对清楚，制备过程相对简单5，可以避免血清对细胞的毒化作用和血源性污染，避免血清批次间的质量变动6，对于培养细胞来说，无血清培养基能够有效的提高细胞密度，延长细胞存活周期7，并且可以使细胞产品易于纯化，有利于体外培养细胞的分化8）装入合适的细胞培养容器中，在适宜的条件下接种细胞进行培养，使细胞不断生长，产物不断形成，而在此过程中随着无血清培养基中营养物质的不断消耗，不断地向培养容器中补充新的营养成分，使细胞进一步生长代谢，直到整个培养结束后取出产2物。分批补料式培养只是向培养系统补加必要的营养成分，以维持营养物质的浓度不变。其特点就是能够调节培养环境中营养物质的浓度：一方面，它可以避免在某种营养成分的初始浓度过高时影响细胞的生长代谢以及产物的形成；另一方面，它还能防止某些限制性营养成分在培养过程中被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成，所以营养物质的维持是关键9。葡萄糖的浓度对细胞生长，代谢及产物表达也起着重要作用10，细胞的生长受葡萄糖的限制，葡萄糖耗尽后，细胞即停止生长，并逐渐死亡11。在分批补料式培养过程中，按照实验需求，在 CD012无血清培养基的基础上，在重组CHO细胞生长到第4/6/8/10天时加入CD Feed 002，维持细胞的生长。1. 实验材料和方法1.1实验材料1.1.1实验仪器表1.实验仪器仪器名称 生产商家 仪器型号生物安全柜 力新仪器（上海）有限公司 HF safe-900 B2型移液泵 赛默飞世尔科技（中国）有限公司 Finnpipette移液管 赛默飞世尔科技（中国）有限公司 GSP-010-002瑞士阿道夫科耐摇床 科耐公司 ISF1-XCTPP管 科耐公司 87050细胞活力分析仪 Beckman Coulter 细胞活率分析仪 XR分子相互作用平台 艾瑞生物科技（上海）有限公司 Octet超级恒温水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司 HH-501架盘天平天津市 天马仪器厂 HC-TP-12小型台式离心机 SCI LOGEXD 2012台式离心机 贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司 AllegraX-12漩涡混合器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司 VORTEX-5摇瓶 康宁公司 4311453生化分析仪 美国NOVA Biomedical Nova Bioprofile Analyzer 400渗透压 Advanced Instruments.Inc 2020摇床 赛默飞世尔科技（中国）有限公司 416CO2培养箱 赛默飞世尔科技（中国）有限公司 23064冰箱 赛默飞世尔科技（中国）有限公司 REL5004V-20冰箱 赛默飞世尔科技（中国）有限公司 UGL2320V201.1.2 实验材料，试剂重组仓鼠卵巢细胞（重组CHO细胞）（健顺生物科技有限公司）CD012Lot：JSB-0056-002（健顺生物科技有限公司）CD Feed 002Lot：JSB-0056-034（健顺生物科技有限公司）葡萄糖溶液 300g/L (健顺生物科技有限公司)1.2 实验过程1.2.1 重组CHO细胞的准备 将已经传代到第13代的重组CHO细胞在3712,13、5%CO2,80%湿度的CO2培养箱中培养，每隔三天进行一次传代培养，直至实验结束，以便在细胞因人为失误等原因死亡时提供种子细胞。1.2.2 重组CHO细胞的接种 在生物安全柜中，用50ml的TPP管接种30ml工作体积的细胞，细胞密度分别为0.25106cells/ml,0.5106cells/ml,1.0106cells/ml,2.0106cells/ml，每个密度分三个平行分别为S1，S2，S3。在生物安全柜中取0.6ml的第十三代重组CHO细胞，用细胞活力分析仪检测重组CHO 细胞的细胞活率和和活细胞数，按照所需要的接种密度，计算接种所需要的细胞体积，在加入相应体积的CD012无血清培养基。1.2.3 重组CHO细胞的培养过程 每天在生物安全柜中取重组CHO细胞的培养液0.6ml，用细胞活率分析仪检测分析细胞活率和活细胞数。每天用生化分析仪测细胞培养液的葡萄糖浓度，根据TPP管中的实际工4 作体积，计算维持细胞生长的葡萄糖浓度，然后补加葡萄糖浓度达到7g/L，在第4/6/8/10天，补加细胞工作体积5，2，5，2的CD Feed 002溶液。当细胞活率低于60时，结束实验。1.2.4 重组CHO细胞的蛋白检测 从第4天开始，每天从TPP管中取样1ml于EP管中，用小型台式离心机离心4500rpm，7min，保留上清液，于-20保存待测。1.2.5 最终产物蛋白的测定 从-20冰箱中取出第1.2.4步留取的上清液，在室温下使其融化，然后用分子相互作用平台检测最终的蛋白产量。2 实验分析2.1 重组CHO细胞不同接种密度的活细胞数图2.1 重组CHO细胞不同接种密度的活细胞数由图2.1可以看出，在整个的实验中，1.0106cells/ml接种密度的重组CHO细胞最高活细胞密度最大，达到15.96106cells/ml，0.25106cells/ml接种密度的重组CHO细胞最高活细胞密度次之，达到14.91106cells/ml，0.5106cells/ml接种密度的重组CHO细胞最高活细胞密度达到13.925106cells/ml，2.0106cells/ml接种密度的重组CHO细胞最高活细胞密度 最小，是12.09106cells/ml，且在第四天达到最大，第五天就开始死亡。2.2 重组CHO细胞不同接种密度的活率变化图2.2 重组CHO细胞不同接种密度的活率变化由图2.2可以看出，各个接种密度的重组CHO细胞会随着培养时间的增加，细胞的活率会慢慢下降，2.0106cells/ml接种密度的重组CHO细胞活率下降最快，在第4天活率就低于60%，1.0106cells/ml接种密度的重组CHO在第九天活率低于60%，0.5106cells/ml接种密度的重组CHO细胞在第11天活率低于60%，0.25106cells/ml接种密度的重组CHO细胞在第十二天活率低于60%。2.3 重组CHO细胞不同接种密度的最终蛋白产量变化分析6图2.3 重组CHO细胞不同接种密度的最终蛋白产量 由图2.3，我们可以看出在第4天到第五天，重组CHO细胞的蛋白产量按照其接种密度由高到低排列。在第五天，由于2.0106cells/ml接种密度的重组CHO细胞活率低于60%（由图2.2知），所以在第五天到第九天，比较剩余三个接种密度的重组CHO细胞，我们可以看到1.0106cells/ml接种密度的重组CHO细胞每一天的蛋白产量都高于剩余两个接种密度的重组CHO细胞。在第十天，由于1.0106cells/ml接种的密度的重组CHO细胞活率低于60%（由图2.2知），所以剩下两个接种密度的重组CHO细胞，不能够进行比较。3讨论 根据实验数据我们可以看出， 2.0106cells/ml接种密度的重组CHO细胞存活时间太短，不适合我们实际的生产应用，所以高密度的接种并不能够真正的提高我们的蛋白产量。0.25106cells/ml接种密度的重组CHO细胞虽然其维持时间长，但是从蛋白产量曲线，我们可以推测如果延长1.0106cells/ml接种密度的重组CHO细胞的生长时间，其蛋白产量也还是可以高于低密度接种的重组CHO细胞。所以我们可以通过优化我们的培养基，从而达到延长重组CHO细胞生7长时间的问题。而在可以比较的第5天到第9天，我们可以看到1.0106cells/ml接种密度的重组CHO细胞其每天的蛋白产量都高于另外两个接种密度的重组CHO细胞，所以在今后的实际生产中，我们可以采用1.0106cells/ml接种密度的重组CHO细胞，来提高我们的蛋白产量。参考文献1百度百科2Walsh G.Biopharmaceuticals:recent approvals and likely directions.Trend Biotechonl.2005.23;553-5583Jayapal,K.P,Wlaschin,K.F,Yap,M.G.S,and W-S,H.Recombinant protein therapeutics from CHO cells-20years and counting.Chermical Engineering Progress.2007,103(10);40-474百度百科5动物细胞无血清培养基的优势，特点及实验研究 王晓楠，王丽环，高鹏 石家庄以岭药业股份有限