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第二章细胞分离与破碎2 2.2细胞破碎 胞外产品：各种胞外酶、胞外多糖、细胞代谢物 细胞本身： 单细胞蛋白（SCP） 胞内产品:碱性磷酸酯酶，基因工程产物，植物细胞 产物等 1 2 3 2 .2.1 细胞的结构 细菌：肽聚糖，多糖，磷壁酸，主要阻力来自 于肽聚糖的网状结构。 酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质，主要阻 力来自于壁结构交换的紧密程度和厚度。 真菌：多糖，蛋白质，脂类，葡聚糖，几丁质 ，主要阻力来自于壁强度和聚合物网状结构。 细胞壁的组成和破碎阻力细胞壁的组成和破碎阻力 4 5 6 各种微生物细胞壁的结构与组成 7 动物细胞 8 植 物 细 胞 模 式 图 9 细胞对破碎的敏感度 10 2.2.2 细胞破碎和产物释放原理 物理法化学法 固体剪切法(珠磨法)酶溶法 液体剪切法化学降解法（酸碱法） 撞击法表面活性剂法 超声法有机溶剂膨胀法 渗透法萃取法 11 细胞破碎理论 1)、细胞破碎 A 压撞 B 剪切 Ca 渗透 Cb 冻胀 D 破壁破膜 12 剪切力F: 假定细胞直径为d(in: m)，维持球体所需的综合 维持力为(in: N/m)，则破碎细胞所需F(in: Pa)为 如利用流体剪切力(Pa)的作用，则在牛顿流体中 则破碎细胞所需的速度梯度为： 意义：细胞直径，所需压力或剪切力，破碎难度。 细胞破碎理论细胞破碎理论 13 细胞破碎理论 渗透压法：渗透压差()为 c=细胞内外小分子的浓度差，R=气体常数，T = 绝对温度 。 2)、产物释放 如细胞破碎速度与未破碎细胞浓度x成正比，则有 kB为细胞破碎常数 14 细胞破碎理论 如破碎cell产物释放的速度与cell内外的浓度差成正比，则有 cin为破碎的细胞内产物浓度，cm为产物的最大释放浓度，x0 为起始细胞浓度，从上三式得 上式为两步释放的速度方程，如细胞破碎或产物释放的其中 一步很快，则表现为一级动力学释放过程，此时方程为 破碎速度控制过程： 释放速度控制方程： 15 2.2.32.2.3细胞破碎技术细胞破碎技术 2.2.3.1 2.2.3.1 机械破碎机械破碎 主要有高压匀浆、珠磨、撞击破碎和超声波破碎等主要有高压匀浆、珠磨、撞击破碎和超声波破碎等 方法方法 16 2.2.3细胞破碎技术 1)、固体剪切法(珠磨法, c最有效的物理破碎法) 操作简介 17 2.2.3细胞破碎技术 计算 破碎遵循一级动力学定律, 即 对上述方程积分得 对于n次连续搅拌研磨操作，则得蛋白质的物料平衡式 k 破碎速率常数，：平均停留时间，V：磨腔的总体积，Q ：发酵液的流量。 18 2.2.3细胞破碎技术 影响因素 a) 转盘外缘速度(见下图)： 适合条件：圆盘外缘速度 20 m/s, 一般在 5-15 m/s。 b) 珠粒添量和大小 添量：(见上图，添量体积一般占总体积的80-90%) 粒径：一般在0.2mm(实验室), 0.4 mm(工业)。最终由实验确定 19 通常选用的微珠粒径与目标细胞的直径比应在 30-100之间 20 2.2.3细胞破碎技术 c) 温度：温度在5-40C范围内对破碎影响较小。但研磨产热 ，功率 ，温度 。如产物热不稳定，必须控温。 d) 细胞浓度x：最佳x由实验确定。一般产热量随细胞浓度的 降低而下降，但单位细胞重量的能耗 。通常悬液中细菌 细胞质量浓度在60-120g/L、酵母细胞质量浓度在140- 10g/L时破碎效果较理想 e) 破碎效率： R：每kg成品细胞(如酵母)释放的蛋白量，Q：物料流量， P：珠磨机消耗的功率。 f) 流量Q：破碎为一级反应。Q, E，R；Q，E，R 。 21 2.2.3细胞破碎技术 不同流量和搅拌速度下的效率。-20，-50，-100 10-6 m3/s 流量；18， 210， 315， 420 m/s 外缘速度 22 23 2.2.3细胞破碎技术 2)、液体剪切法(最常用的方法之一) 操作 24 高压匀浆器 25 2.2.3细胞破碎技术 计算 服从一级反应定律 式中，R为protein释放量， Rm为pro最大释放量. 影响因素 操作压力p：p, R ;相反, R 。温度 2C /10MPa 。 破碎次数N：N，R 。 温度：比速度k与温度有关，温度25C，k1.5倍。 细胞抗破碎系数a：a酵母=2.9，a大肠杆菌 = 2.1。 细胞种类：影响k值。 细胞浓度： Z：常数，p0：破碎所需的最低压力，：细胞浓度的参数。26 2.2.3细胞破碎技术 阀门底座：刃缘阀座，平边阀座 优点 A、在大规模cell破碎中，高压匀浆机和珠磨机用得最多; B、高压匀浆机最适合于酵母和细菌; C、珠磨机可用于酵母和细菌，但对真菌菌丝和藻类更合适. 27 2.2.3细胞破碎技术 3) 撞击破碎法 操作：细胞喷雾高速冻结 300 m/s氮气流 优点： A、细胞破碎仅发生在撞击的一瞬间，破碎程度均匀，避免 反复和过度破碎； B、破碎的程度可无级调节，避免细胞内部结构的破坏，特 别适合于细胞器的回收； C、实验室和工业规模均可应用，细胞浓度在10-20%，实验 室规模的间歇处理能力在50-500 mL/h，工业规模的连续 处理在 10,000 mL/h 以上。 28 2.2.3细胞破碎技术 4) 超声破碎法(1525kHz) 29 l超声波破碎法（Ultrasonication)利用超声波振 荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮 液。 l超声波振荡器有不同的类型，常用的为电声型， 它是由发生器和换能器组成，发生器能产生高频 电流，换能器的作用是把电磁振荡转换成机械振 动。超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入 介质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。 30 2.2.3细胞破碎技术 机理 在超声作用下产生的空穴化作用(cavitation)，空 穴的形成和闭合产生极大的冲击波和剪切力。 优点：适合于多种细胞的破碎 缺点：A、影响因素多，如振幅、黏度、表面张力 、液体体积和流速、探头材料和形状；B、超声 产生超氧离子毒害作用；C、有效能量的利用率 低；D、产热大，需控温；E、不易放大，仅应用 于实验室规模的细胞破碎。 31 2.2.3细胞破碎技术 2.2.3.2 化学破碎法 酶溶法、酸碱法、有机溶剂胞溶法、表面活性剂法 酶溶法：利用酶分解细胞壁上的化学键，使细胞壁破碎。 优点： A、产品释放的选择性； B、提取速度和收效高； C、产品的破坏小； D、对外界环境，如pH和温度等要求低； E、不残留细胞碎片。 32 2.2.32.2.3细胞破碎技术细胞破碎技术 酶解（酶溶法 Enymatic lysis) l利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受 到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法 破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性。溶 菌酶（lysozyme)适用于革兰氏阳性菌细胞的分解 ，应用于革兰氏阴性菌时，需辅以EDTA使之更有 效地作用于细胞壁。 l真核细胞的细胞壁不同于原核细胞，需采用不同 的酶。 33 l 自溶作用是酶解的另一种方法，利用生物体自身 产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。 l在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水 解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去 。可是，改变其生长环境，可以诱发产生过剩的 这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目 的。 2.2.32.2.3细胞破碎技术细胞破碎技术 34 l酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用 6mol/L HCl。碱和表面活性剂能溶解细胞壁上脂类 物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。天然的表面 活性剂有胆酸盐和磷脂等 l合成的表面活性剂可分离子型和非离子型，离子型 如十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）；十六烷基 三甲基溴化铵（阳离子型）。非离子型如Triton X -100和吐温（Tween）等 l有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 2.2.32.2.3细胞破碎技术细胞破碎技术 35 2.2.3.3 2.2.3.3 物理渗透法物理渗透法 渗透压冲击法渗透压冲击法 l渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞放 在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗糖 溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分便向外 渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快 速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透 压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细 胞快速膨胀而破裂。 2.2.32.2.3细胞破碎技术细胞破碎技术 36 冻结-融化法 l将细胞放在低温下冷冻（约-15），然后在室温 中融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻， 一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加 细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，形成冰 晶粒，引起细胞膨胀而破裂。对于细胞壁较脆弱 的菌体，可采用此法。 2.2.32.2.3细胞破碎技术细胞破碎技术 37 机械法和化学法的比较 机械破碎法缺点： A、高能、高温、高噪音、高剪切力(四高)，易使产品变性 失活； B、非专一性，胞内产物均释放，分离纯化困难； C、细胞碎片大小不一，难分离。 化学破碎法缺点： A、费用高； B、引起新的污染，尤其是其他化学方法； C、一般只有有限的破碎，常需与其他物理法连用。 38 破碎方法的选择 选择的一般原则 A、提取产物在细胞质内，用机械法破碎 B、提取产物在细胞膜附近，用化学法 C、提取产物与细胞膜和细胞壁结合，可采用化学法和机械 法结合的方法 破碎技术杂交研究应注意的问题 A、杂交技术可产生很大优势。 B、破碎技术对下游分离技术的影响。破碎颗粒清除，产物 的分离纯化 C、在发酵阶段，考虑到发酵过程和环境对破碎难易程度的 影响 D、菌种的培育，胞内产物 胞外产物 39 细胞破碎的评价 破碎率定义 N0：原细胞数，N：破碎后残存的正常细胞。N0和N的可 通过直接计数和间接计数法得到。 直接计数法 方法：样本稀释 - 染色 - 上样 计数。 计算：同上。 优点：方法简单。 缺点： A、计数时间长，B、只有活细胞才被计数，误差大，C、细 胞聚集时，不利计数，D、染色误差。 40 细胞破碎的评价 间接计数法 方法：样本离心 - 取上清液 - 测特定蛋白质或酶 - 与理论的最大值比较。 计算： Rm：理论最大值，R：实验测得值。 优点：A、方法客观可靠，尤其对蛋白质和酶，B、有多种 选择的指标，胞内位置(如胞膜、胞壁、近胞膜蛋白等)， 灵活性大。 缺点：影响因素多，如温度、pH值、剪切力、溶液的稀释等 。 解决办法：筛选相对稳定和恒定的指标。41 2.2.4 2.2.4 目标产物的选择性释放目标产物的选择性释放 利用珠磨法破碎酵母细胞时，酵母内各种酶的释 放速率常数不同。一般靠近细胞壁和细胞膜的酶 释放速度快，而细胞内部或细胞器内的酶随破碎 的进行缓慢释放出来。因此，选择发现地释放目 标产物是可能的，关键是要知道目标产物的性质 和在细胞同存在的位置，选择适当的破碎方法和 操作条件。 42 2.2.4 2.2.4 目标产物的选择性释放目标产物的选择性释放 选择性释放目标产物的一般原则 仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围 当目标产物存在于细胞膜附近时，可采用较混和 的方法，如酶溶法（包括自溶法）、渗透