《生化制药基本技术》PPT课件.ppt

生化制药的基本技术 第一节 原料的选择、处理及有效成分的提取 生化药物的提取与分离方法因原材料、药物的种类和性 质不同而存在很大差异。总的来说，其提取纯化一般分为五 个步骤：预处理、固液分离、提取、精制和成品加工（包括 干燥、制丸、挤压、造粒、制片等步骤），如图所示： 生物材料、发酵或培养液 预处理（清洗、加热、调pH、凝聚、絮凝） 细胞分离（沉降、离心、过滤） 细胞 细胞破碎（高压均质处理、研磨、溶菌处理） 收集上清液 初步纯化（沉淀、吸附、萃取、过滤） 高度纯化（离子交换色谱、亲和色谱、疏水色谱、吸附色谱及电泳等） 成品加工（无菌过滤、超滤、浓缩、冷冻干燥、喷雾干燥、结晶等） 图2-1 生化药物提取的一般工艺流程 上清液（含胞外产品） 一、原料的选取与保存 选择原则：有效成分含量高，原料新鲜； 原料来源丰富，易得，原料成本低； 原料中杂质含量较少等。 植物材料确定后，要选择合适的季节、地点、时间后采集 并就地去除不用的部分，将有用的部分保鲜处理。 保存生物材料的方法主要方法有冷冻法，常用-40速冻； 有机溶剂脱水法；防腐剂保鲜法。 二、生化药物提取 1. 物理性质与提取 提取是利用目的物的溶解特性，将其与细胞的固形成分或其 它结合成分分离，使其由固相转入液相或从细胞内的生理状 态转入特定溶液环境的过程。 许多生化药物具有生物活性，其稳定性受pH、温度、离子强 度、金属离子、提取过程中所使用的溶剂等环境因素的影响 。 2. 提取的溶剂系统 （1）对水溶性、盐溶性生物物质的提取 可用酸、碱、盐水溶液为提取剂。 （2）对水、盐系统无法提取的蛋白质或酶的提取 可用表面活性剂或有机溶剂提取，用有机溶剂作为提 取试剂时，根据产物存在的状态可分为液-液提取和固-液 提取。 液-液提取也即萃取，也是利用溶质在互不相溶的两 相中分配系数不同而进行的提取分离的方法。 杂质 溶质 原溶液 萃取剂 Light phase Heavy phase 萃取相 原溶液 t C 在一定温度和压力下，溶质分配在两个互不相溶的溶剂中 达到平衡后，溶质在这两相的浓度比为一常数K，此常数称 为分配系数。 在常温下为常数；的单位通常用mol/L或质量单位/mL 。 工业生产中常用的萃取溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸 乙酯、乙酸丁酯等。 表2 青霉素在不同萃取剂中的分配系数 溶 剂 pH2.5（溶剂/水） pH7.0（溶剂/水） 乙酸戊酯 45/1 1/235 乙酸丁酯 47/1 1/186 乙酸乙酯 39/1 1/260 氯仿 39/1 1/220 三氯乙烯 21/1 1/260 乙醚 12/1 1/190 物理化学方面 有足够的容量 与水溶液不互溶，不发生乳化 对产物有高的分配系数 低黏度 在密度上同水有大的差别 生物学方面在消毒过程中热稳定 经济和毒理方面 对生物催化剂、酶或活细胞无毒性 低成本 能大批供应 对人员无毒 不易燃 表1 在生物转化中萃取溶剂的选择准则 固-液提取也称为浸取。为了高效、快速地从固体中将目 的物浸取出来，同时尽可能将杂质留在固体中，选择合适 的溶剂很重要，溶剂选择的主要依据是“相似相溶”原理。 浸取常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、丁醇等极性溶 剂和乙醚、氯仿、苯等非极性溶剂。 无论采用哪种溶剂系统对目的物进行提取，在提取过程 中都要尽量增加目的物的溶出度，并尽可能减少杂质的 溶出度，同时充分重视目的物在提取过程中的活性变化 。 三、细胞破碎技术 植 物 细 胞 模 式 图 1. 机械法：包括球磨法、高压匀浆法、超声破碎法、X- press等。 JJ-2组织捣 碎匀浆机 超声波破碎仪 2. 非机械法：酶溶法、化学渗透法、反复冻融法、干燥 法等 酶溶法的缺点在于酶的价格昂贵限制了在大规模 生产中的使用，虽然条件温和、具有选择性。细胞悬 浮液中加入酶能迅速和细胞壁反应并破坏它们。酶选 择性的催化细胞壁反应，不破坏细胞内的其它物质。 四、固液分离 固液分离的方法很多，有重力沉降、离心分离和过滤等。 离心：借助离心机旋转所产生的离心力的作用，促使不同大 小，不同密度的粒子分离的技术。 过滤：在一定的压力差下，利用多孔性介质截留固液悬浮液 中的固体粒子，进行固液分离的方法称为过滤。 第二节 沉淀技术 沉淀：是物理环境的变化引起溶质的溶解度降低、生成 固体凝聚物的现象。 根据沉淀机理不同，可分为盐析法、有机溶剂沉淀法和 等电点沉淀法等。 一、盐析法 水溶液中蛋白质的溶解度一般在生理离子强度范围 内（0.150.2mol/L）最大，低于或高于此范围时溶解 度均降低。蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低， 发生沉淀的现象称为盐析。不同蛋白质盐析时所需的盐 的浓度不同，因此调节盐的浓度，可以使混合蛋白质溶 液中的蛋白质分段析出，达到分离纯化的目的。 常用的盐析用盐包括硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯 化钠、磷酸二氢钠等。 二、有机溶剂沉淀法 向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂、降低溶 质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法称为有机溶 剂沉淀法。 许多能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮、甲醇和 乙腈，常用于低盐浓度下沉淀蛋白质。 三、等电点沉淀法 两性电解质在溶液pH处于等电点时，分子表面电 荷为零，导致赖以稳定的电荷层及水化膜的削弱或破坏 ，分子间引力增加，溶解度降低。 调节溶液pH值，使两性溶质溶解度下降，析出沉 淀的操作称为等电点沉淀法。 第三节 色谱技术 色谱：也称层析，是根据混合物中溶质在互不相溶的两 相之间分配行为的差别，引起迁移速度不同而进行分离 的方法。 固定相：固定相是色谱的一个基质。它可以是固体物质 （如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物 质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与 待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。 流动相：在色谱过程中，推动固定相上待分离的物质朝 着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱色 谱中一般称为洗脱剂，薄层色谱时称为展层剂。 一、色谱技术的分类 色谱技术根据流动相的物态不同可以分为气相色谱 法、液相色谱法和超临界流体色谱法。根据固定相的形 状不同，色谱法可分为柱色谱法、纸色谱法和薄层色谱 法。根据分离的机理，可分为吸附色谱法、分配色谱法 、离子交换色谱法、凝胶色谱法和亲和色谱法。 二、柱色谱装置和操作 柱色谱一般由进样器、色谱柱、检测 器、记录仪及部分收集器等部分组成 。 柱的分离效率与柱高成正比，与直径 成反比。 柱色谱操作 （1） 装柱。根据欲分离的物质性质选择适宜的色谱介质， 装柱时，将洗脱剂与一部分缓冲液调成浆料后边搅拌边慢慢 加入，一次用完。然后用几倍柱床体积的缓冲液平衡色谱柱 。 （2）加样。将平衡后的色谱柱从柱顶部或底部进样。 （3）洗涤。用与前组成相同的缓冲液流经色谱柱，将未与 固定相结合的杂质洗涤下来。 （4）洗脱。根据目的物的性质，选用一定组成的洗脱液将 目的物洗脱下来。 （5）再生。目的物洗脱下来后，洗脱液成分及杂质被吸附 在色谱柱中，要进行再生后才能继续使用。 三、吸附色谱 固定相：固体为吸附剂，如硅藻土、硅胶、氧化钙、淀 粉、活性炭等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂 ； 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：利用吸附剂对不同物质的吸附能力不同而使 混合溶液中各组分相互分离的方法。 在吸附色谱中，溶质在色谱柱中的移动情况常以阻滞因 数Rf来表示，是在层析系统中溶质的移动速度和流动相 的移动速度之比。 Rf =溶质的移动速度/流动相的移动速度之比 =溶质的移动距离/流动相的移动距离之比 四、凝胶过滤色谱 原理：按分子大小分离。凝胶为三维网状结构，可对大 小流动产生不同的阻滞作用。小分子可以扩散到凝胶空 隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝 胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快； 溶剂分子小， 故在最后出峰。 1.凝胶过滤色谱的分离机理 固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)； 2. 凝胶的种类和性质 （1）葡聚糖凝胶 商品名为Sephadex，由葡聚糖和环氧氯丙烷在碱性条件 下交联而成。主要型号是G-10G-200。数字是凝胶的吸 水量（每克干胶膨胀时吸水的毫升数）的10倍。 （2）聚丙烯酰胺凝胶 商品名为Bio-gel-P。主要型号有Bio-gel-P-2 Bio-gel-P -300等10种。后面的数字基本代表它们的排阻极限（不能 扩散到凝胶网络内部的最小分子的分子量）的10-3，所以 数字越大，可分离的分子量也就越大。 （3）琼脂糖凝胶 （4）其他 多孔玻璃珠和多孔硅胶等。 3. 凝胶色谱的应用 （1）脱盐及除去小分子杂质和溶液的浓缩。 （2）浓缩。利用凝胶颗粒的吸水性可对大分子样品溶 液进行浓缩。 （3）生物大分子的纯化及生化药物中热源物质的去除 。 （4）分子量测定。在一定范围内，各个组分的洗脱体 积Ve与其分子量的对数成线性关系。 五、离子交换色谱 固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液 ；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液； 基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组 分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存 在形式等有关。亲和力大，保留时间长； 应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。 六、亲和色谱 原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异 性亲和力，进行选择性分离。 先在载体表面键合上一种具 有一般反应性能的所谓间隔 臂(环氧、联胺等)，再连接 上配基(酶、抗原等)，这种 固载化的配基将只能和具有 亲和力特性吸附的生物大分 子作用而被保留。改变淋洗 液后洗脱。 第四节 结晶 一、结晶的原理 1.饱和溶液 2.过饱和溶液 3. 晶核：在过饱和溶液中，最先析出的微小颗粒就是 以后结晶的中心，称为晶核。 结晶的过程 1. 形成过饱和溶液。 2. 晶核的形成。 3. 晶体的生长。 其中，溶液达到过饱和 状态是结晶的前提，过饱和 度是结晶的推动力。 二、结晶的过程 1. 过饱和溶液的形成 （1）热饱和溶液冷却 适合溶解度随着温度降低而显著减小的情况。 （2）部分溶剂蒸发法 蒸发法是使溶液加压、常压或减压下加热，蒸发除去 部分溶剂达到过饱和的结晶方法。 （3）化学反应结晶法 通过加入反应剂或调节pH生成一个新的溶解度更低的物质 ，当其浓度超过它的溶解度时，就结晶析出。 （4）盐析法 2. 晶核的形成 在工业结晶中，有3种不同的起晶方法： 一种是自然起晶法，即在一定温度下使溶液进入不稳定 区，形成符合要求的晶核后加入稀溶液使溶液进入亚稳 定区，溶质在晶核表面长大。 第二种是刺激起晶法，即将溶液蒸发进入亚稳定区后加 以冷却，使之进入不稳定区后产生一定的晶核，晶核析 出后会使溶液浓度降低在进入亚稳定区，在亚稳定区内 使晶体生长。 第三种是晶种起晶法，即将溶液蒸发或冷却至亚稳定区 后投入一定数量和大小的晶种，使溶质在所加晶种表面 长大。 3. 晶体的生长 晶体生长：在过饱和溶液中已有晶核或加入晶种后，以 过饱和度为推动力，晶种或晶核将长大，这种现象称为 晶体生长。 影响晶体生长的主要因素有： 杂质 搅拌 温度 过饱和度 三、晶体质量控制 晶体的质量主要指晶体的大小、形状和纯度三个方面。 重结晶是利用杂质和结晶物质在不同溶剂和不同温度的溶 解度不同，将晶体用合适的溶剂溶解，再次结晶，使其纯 度提高的操作。 四、结晶的应用 工业结晶技术广泛应用于红霉素、四环素、制霉菌素 等抗生素及谷氨酸、赖氨酸等氨基酸的纯化精制。 第五节 电泳 一、电泳原理与分类 将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速 度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度 叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携 带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分 子大小、极性、介质的粘度系数等）。 电泳的类型 电泳主要有区带电泳、等电点电泳和等速电泳等。 二、琼脂糖凝胶电泳 三、聚丙烯酰胺凝胶电泳 四、SD