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第三章初级分离6 3.1 沉淀分级 沉淀（precipitation)是物理环境的变化 引起溶质溶解度降低、由液相变成固相析出生成 固体凝聚物（aggregates)的现象。 常用加入试剂的方法，改变溶剂和溶质的 能量平衡来降低其溶解度，使产物离开溶液生成 不溶性颗粒，沉降析出。沉淀具有浓缩与分离的 双重作用。 162 3.1 沉淀分级 与结晶联系 在本质上都是 新相 析出的过程，主要是物 理变化，当然也存在化学反应的沉淀或结 晶。 区别 结晶为同类分子或离子以有规则 排列形式 析出，沉淀为同类分子或离子以无规排列 形式析出。 262 3.1 沉淀分级 优点 A、设备简单、成本低、放大容易，产物浓度越高沉淀越有 利，收率越高； B、原料液体积很快地减小1050倍，从而简化生产工艺、 降低生产费用； C、使中间产物保持在一个中性温和的环境； D、及早地将目标pro.从其pro.水解酶分离出来，避免pro降 解，提高产物稳定性； E、用沉淀法作为pro色谱分离前处理，可使使用色谱分离的 限制因素降低到最少。 缺点： A、沉淀物可聚集有多种物质，如大量盐类和溶剂，所以沉 淀法所产品纯度通常都比结晶法低； B、过滤较困难 362 3.1.1 蛋白质的表面特性 蛋白质溶解：相似相溶 aa的亲水性和疏水性： 有利因素：亲水性，包括氢键、极 性基团、离子化侧链、亲水aa所 占的比例等。如白蛋白 不利因素：疏水性，包括暴露的疏 水基团、疏水aa所占的比例等。 如纤维蛋白原。 462 蛋白质的溶解与什么 有关呢？ 562 蛋白质的溶解特性 l蛋白质的溶解行为是一个独特的性质，由其 组成、构象 以及分子周围的环境 所决定。 l蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大部 分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。 l一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大 分子蛋白质更易溶解。 662 蛋白质的溶解特性 l 蛋白质是两性高分子电解质（amphoteric polymer），主要由疏 水性各不相同的 20 种氨基酸组成。 l 在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向内部折叠的趋 势，使亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白 质立体结构的外表面。 l 即便如此，一般仍有部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成 疏水区。疏水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。因此 ，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、亲水区和疏水区 构成。 762 蛋白质溶液的稳定因素 l蛋白质周围的水化层（hydration shell)可以使蛋白质形成稳定的胶 体溶液。 l蛋白质分子间静电排斥作用。（存在双电层） l因此，可通过降低蛋白质周围的水化层和双电层 厚度（电位）降低蛋白质溶液的稳定性，实现蛋白质的沉淀。 862 蛋白质溶液的稳定因素 l 蛋白质可以看作是一个表面分布有正、负电荷的球体 ，这种正、负电荷是由氨基和羧基的离子化形成的，换句 话说，该球体是带有均衡电荷分布的胶体颗粒。因此，蛋 白质的沉淀，实际上与胶体颗粒的凝聚和絮凝现象相似。 l 蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电的原因主要是 吸附溶液中的离子或自身基团的电离。因溶液是电中性的 ，水中应有等当量的反离子存在。蛋白质表面的电荷与溶 液中反离子的电荷构成双电层。 962 1062 蛋白质溶液的稳定因素 l吸引力 l颗粒间的相互作用 l颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。 l Van der Waals 力 lKeeson 引力（偶极力） lDebye 引力 （诱导力） lLondon 引力 （色散力）是最重要的一种引力， 因为所有分子都是可以被极化的，所以它是普遍 存在的。 1162 蛋白质溶液的稳定因素蛋白质溶液的稳定因素 1262 蛋白质溶液的稳定因素蛋白质溶液的稳定因素 DLVO理论 颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。 在低离子强度时，颗粒距离处在中间状态，双电 层斥力占优势，可看为一个凝聚的势垒；在高离 子强度时，吸引力超过排斥力，相互间的总位能 表现为吸引位能。 虽然这个理论所假定的条件并不完全适合于 蛋白质分子，但该理论对于理解破坏蛋白质溶液 的稳定性仍有很大帮助，同时还有助于针对具体 蛋白质选择最合适的沉淀剂及技术。 1362 蛋白质溶液的稳定因素蛋白质溶液的稳定因素 带电粒子间的静电相互作用取决于电位（绝对值） 的大小。粒子表面电位一定，分散层厚度越小， 电位越 小；分散层厚度为零，则电位为零，粒子处于等电状态 ，不产生静电作用。 当分散层厚度大，双电层的电位足够大时，静电排 斥作用抵御分子间的相互吸引作用，蛋白质溶液处于稳定 状态。 当分散层厚度小， 电位小，分子间相互吸引作用大 于静电排斥作用，蛋白质产生沉淀。 1462 蛋白质溶液的稳定因素 1)、水化层(hydration shell) tight hydration shell(0.35g water/1g pro) loose hydration shell(2g water /1g pro) 2)、静电排斥 zeta电势 Nernst Potential胶核表面电位(不可测) Stern Potential(不可测) Potential滑面电位(可测,mobility) 电位 Nernst电位 ionic strength 3)、|pH水 pI| Value |pH水 pI| Value zeta电势 水化层 静电排斥 Tight hydration shell Protein core Loose hydration shell 1562 蛋白质沉淀方法分类 1）、盐析法 2）、有机溶剂沉淀法 3）、 |pH水 pI| Value 调节法 4）、亲水聚合物沉淀法 5）、聚电解质絮凝法 6）、高价金属离子沉淀法 7）、亲和沉淀法 1662 3.1.2 盐析沉淀 机理：A、zeta potential；B、hydration shell 1762 盐溶 “盐溶”现象低盐浓度下，蛋白质溶解度增大 1862 盐析 “盐析”现象高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降 Sodium 钠 Sulfate硫酸盐 aggregate聚集 1962 3.1.2 盐析沉淀 计算: Cohn经验公式 式中, S为蛋白质的溶解度(g/L)； I 为离子强度； 值为蛋白质在纯水中(I=0时)的假想溶解度对数值，是是pHpH 值和温度的函数，在蛋白质值和温度的函数，在蛋白质pIpI时最小时最小； Ks为盐析常数，与温度和pH值无关。 ci为离子 i的摩尔浓度；Zi为所带电荷数； 2062 3.1.2 盐析沉淀 计算: Cohn经验公式 有时为简单计，也可以用浓度 代替离子强度，则上式成为 m为盐的摩尔浓度 2162 3.1.2 盐析沉淀 方法: A、 “Ks”分级盐析法：在一 定pH值及温度下，改变盐 浓度（即I）达到沉淀的目 的。 B、“”分级盐析法：在一定 I下，改变溶液的pH值及 温度达到沉淀的目的。 C、应用：一般的初步分离 用第一种方法， 进一步纯化时用第二种方法 。 2262 3.1.2 盐析沉淀 lKs盐析法:由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感 ，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处 理。 l盐析法:由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度 小，因此分辨率更高，常用于初步的纯化。 2362 3.1.2 盐析沉淀 影响因素 A、无机盐种类 一系列盐沉淀蛋白质 的能力进行了测定研究。 阴离子排序为：柠檬酸根3- 酒石酸根3- F- IO-3 H2PO-4 SO-4 CH3COO- Cl- ClO-3 Br- NO-3 ClO-4 I- CNS-; 对阳离子排序为： Al3+ H+ Ba2+ Ca2+ Cs+ NH4+ K+ Na+ Li+ 如何设计实验？ 结论？ 2462 3.1.2 盐析沉淀 结论： a 不同种类的盐主要影响Ks； b 离子半径小，带电多，电荷密度高，盐析效果好。 无机盐的挑选原则： a 较高的盐析效能； b 高溶解度，能配置高离子强度的盐溶液； c 溶解度受温度的影响小； d 盐溶液的密度不高，便于蛋白质沉淀和离心分离； e 不易引起蛋白质的变性； f 价格低廉； 2562 想一想 什么盐溶液适合盐析呢什么盐溶液适合盐析呢 ？ 2662 最常用(NH4)2SO4 l优点：符合上述要求； l缺点：水解后溶液pH降低，在高 pH下产 氨，腐蚀性强，有异味，有毒，终产物必 须除尽。 l次常用Na2SO4。缺点：在400C以下溶解 度较低，主要用于热稳定蛋白。 2762 3.1.2 盐析沉淀 B、无机盐添加方式 2862 3.1.2 盐析沉淀 C、温度T T影响Cohn方程中的值。 T ， ；T ， 。 Why? P39 离子强度较高时，升高温度 有利于蛋白质失水 溶解度下降 2962 3.1.2 盐析沉淀 D、溶液pH pHpH影响影响CohnCohn方程方程 中的中的 值值。 见图 此图有何用？此图有何用？ 3062 pH=pI时，蛋白质溶解度最小（ 值最小） 3162 3.1.2 盐析沉淀 盐析沉淀操作，以硫酸铵为例 在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓 度硫酸铵常用过滤方法，因为高浓度硫酸铵密度太 大，要使蛋白质完全沉降下来需要较高的离心速度 和较长的离心时间。 200C时，硫酸铵的饱和溶解度是761g/L（1L水 加761g硫酸铵），饱和溶液体积为1.425L，饱和浓 度为4.05mol/L (534g/L)，定义为100%饱和度 3262 3.1.2 盐析沉淀 20，硫酸铵添加量计算（M摩尔浓度，S饱和度） 0，硫酸铵添加量计算 3362 25 时 3462 如果要分离一种新的蛋白质质和酶，没有文献数据可以借 鉴鉴，则应则应 先确定沉淀该该物质质的硫酸铵饱铵饱 和度。 具体操作方法见教材40页： 3562 3.1.3 等电点沉淀法 isoelectric point precipitation 3662 等电点沉淀法 在低的离子强度低的离子强度 下，调pH至等 电点，使蛋白 质所带净电荷 为零，降低了 静电斥力，而 疏水力能使分 子间相互吸引 ，形成沉淀的 操作称为等电 点沉淀 pH=pI 3762 l不同的两性电解质具有不同的等电 点，以此为基础可进行分离。 l生产胰岛素时，在粗提液中先调pH8.0去 除碱性蛋白质，再调pH3.0去除酸性蛋白 质。 3862 3.1.3 等电点沉淀法 等电点沉淀法中 的pH值作用于值而 隐含在Cohn公式中， pI值通常在pH46范 围内变化，一般用无 机酸（如盐酸、磷酸 和硫酸）作沉淀剂。 3962 蛋白质疏水性比较大 和结合水比较 小 时这种类型的沉淀更有效。为了提高 等电点法的沉淀能力，常将其与盐析法、 有机溶剂法或其他沉淀法一起使用。 最大缺点：无机酸会引起较大的蛋白 质不可逆变性 的危险。 4062 图16-10表示大豆蛋白的溶解度随pH的变化情况。 等电点沉淀法 4162 利用脂肪酶和淀粉酶的热敏感性 不同， 在4042C温度下处理 2.5h(pH=3.4)， 可将黑曲霉发酵液中90 以上的淀粉酶去处， 从而可以制备较纯 的脂肪酶。 4262 l超氧化物歧化酶热稳定性很好， 对提取 液在60C进行短时间热处理可沉淀20 杂蛋白。 4362 等电点沉淀法 l细胞色素C洗脱液（离交）+ 硫酸胺（饱和度86%） l调pH5.0-5.5，低温离心 上清液调pH4.8- 5.1产物 l 沉淀（杂蛋白） 4462 等电点沉淀法注意事项 F本法适用于憎水性较强憎水性较强的蛋白质，例如酪 蛋白在等电点时能形成粗大的凝聚物。 F但对一些亲水性强的蛋白质。如明胶，则在低 离子强度的溶液中，调 pH在等电点并不产生沉 淀。 F等电点沉淀法往往不能获得高的回收率， 通常与其他沉淀方法结合使用； 4562 F在调节等电点时，如果采用盐 酸、氢 氧化钠等强酸强碱，要注意防止酶的失活 或蛋白变性。为了使pH缓慢变动，也 可用乙酸、碳酸等弱酸和碳酸钠等弱碱。 F中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向 移动，同时最低溶解度会有所增大。 等电点沉淀法注意事项 4662 3.1.4 有机溶剂沉淀法 同盐析一样，随着沉淀 剂有机溶机浓度的 上升，蛋白质溶解度也 呈指数规律下降。 式中, So为当（K/e2） 0时S的外推值；e为水- 有机溶剂混合物的介电 常数；K为常数(水的介 电常数的吸收系数)。 4762 l选择什么有机溶剂合 适呢？ 4862 3.1.4 有机溶剂沉淀法 有机溶剂的种类： 丙酮(首选)、乙醇、甲醇和乙腈，常用于低盐 浓度下沉淀pro。 机理： A、增大静电力 有机溶剂沉淀法的机理是加 入溶剂后，会使水溶液的介电常数降低，而 使pro分子间的静电引力（库仑力）增大，导 致凝集和沉淀。 q1 q2 F = （库仑公式） D r2 4962 B、去水化层 有机溶剂使pro溶剂化，使原 来与pro结合的水被溶剂结合的水被溶剂所取代，从而降低 了pro溶解度。 这种理论不能说明为什么乙醇比丙酮 的亲水性强，丙酮却比乙醇沉淀pro的能力 强，也解释不了丙酮、乙醇之类溶剂在所 谓脱去pro水膜的过程中容易造成pro变性 ，而盐析脱水时不造成pro变性。 C、丙酮、乙醇等不仅是pro的沉淀淀剂，而 且还是一种变性剂，可见作用有机溶剂使 pro在沉淀和变性之间既有区别又相关联。 5062 3.1.4 有机溶剂沉淀法 影响因素及控制 A、 温度T：当乙醇与水混合时，会放出大 量的稀释热，使溶液T显著升高，对不耐热 的pro影响较大。 解决办法：搅拌、少量多次加入，以 避免温度骤然升高损失pro活力。 另一方面温度还会影响有机溶剂对pro 的沉淀能力，一般温度越低，沉淀越完全 ，所以在乙醇沉淀人血浆蛋白时，温度控 制在-10C下进行。 5162 影响因素及控制 B、乙醇浓度：通常随乙醇上升，pro溶解 度下降。如血纤维蛋白原的最大溶解度在 乙醇浓度为8%时达到最大，而当乙醇浓 度为40%时达到最小。 C、pH值：在确定了乙醇以后，pro最低 溶解度出现在pro的pI处，因此可以通过 调节pH值来选择性分离蛋白质。 D、pro：避免使用很稀的浓度，因pro在 高浓度下才较稳定。 5262 1、温度 使用有机溶剂沉淀时，操作必须在低温下进行， u有机溶剂与水混合时，会放出大量的热量，使溶液 的温度显著升高，从而增加有机溶剂对蛋白质的变性 作用，有机溶剂要缓缓加入，防止溶液局部升温。 u温度还会影响有机溶剂对蛋白质的沉淀能力，一般 温度越低，沉淀越完全。 因此，所用的有机溶剂须预先冷却到-10- 20；在使用有机溶剂沉淀生物高分子时，整个操作 过程应在低温下进行 。 有机溶剂沉淀法的影响因素 5362 2、pH值： pH多控制在待沉蛋白质的等电点附近 。 3、样品浓度： 样品较稀时，将增加有机溶剂投入 量和损耗；样品太浓会增加共沉作用 。 一般认为蛋白质的初浓度以0.52为 好，粘多糖则以12较合适。 有机溶剂沉淀法的影响因素 5462 4、中性盐浓度： 较低浓度的中性盐存在有利于沉淀作 用，减少蛋白质变性。一般中性盐浓度以 0.010.05mol/L为好，常用的中性盐为醋 酸钠、醋酸铵、氯化钠等。 5、某些金属离子： 一些金属离子如Ca2+、Zn2+等可与某些 成阴离子状态的蛋白质形成复合物，这种 复合物溶解度大大降低而不影响生物活性 ，有利于沉淀形成，并降低溶剂用量。 有机溶剂沉淀法的影响因素 5562 3.1.4 有机溶剂沉淀法 优点： A、某些蛋白质沉淀的浓度范围相当宽，所得产品的 纯度较高 B、从沉淀的蛋白质中除去有机溶剂很方便，而且有 机溶剂本身可部分地作为蛋白质的杀菌剂； 缺点： A、耗用大量溶剂，而溶剂来源、贮存都比较困难麻烦； B、且沉淀操作需在低温下进行，使用上有一定的局限性； C、收率也比盐析法低； D、试剂易燃，有毒。 5662 3.1.5 热沉淀 利用生物大分子对热的稳定性不同，加热升高温度使某些非 目的生物大分子变性沉淀而保留目的物在溶液中。此方法最 为简便，不需消耗任何试剂，但分离效率较低，通常用于生 物大分子的初期分离纯化。 热沉淀基于蛋白质变性动力学 积分式 kD为变性速率常数，用Arrhenius方程表示 5762 3.1.6非离子型聚合物 用聚乙二醇等非离子性聚合物亦能降 低蛋白质的溶解度，有选择性的沉淀蛋 白质。 机理：与有机溶剂相似，能降低水活 度，破坏蛋白质的水化膜。 常用非离子性聚合物为Polyethylene glycol (PEG)： 是一种水溶性的高分子 聚合物，分子量 4,000 以上的 PEG 可 以用来沉淀蛋白质。 5862 3.1.6非离子型聚合物 优点： 1. 室温 2. 颗粒大，易于收集 3. 提高蛋白质的稳定性 4. PEG 难去除，幸而 PEG 通常一般 不影响下一步的分离。 5962 3.1.6 非离子型聚合物沉淀法 优点： A、体系的温度只需控制在室温条件下； B、沉淀的颗粒往往比较大，产物比较容易收集； C、PEG非但不会使pro变性,而且可以提高它的稳定 性； D、PEG无毒，优先使用在临床产品的加工过程中。 缺点： A、PEG比其他沉淀剂更难从蛋白质溶液中除去为此 需用超滤和液-液萃取来解决； B、价格较昂贵。 6062 选择性沉淀法 概念：选择一定的条件使溶液中存在的 某些杂蛋白等杂质变性沉淀下来，而与目 的物分开。 原理：利用蛋白质、酶和核酸等生物大 分子对某些物理或化学因素敏感性不 同，有选择地使之变性沉淀，以达到分离 提纯的目的。 6162 3.1.6 非离子型聚合物沉淀法 方法： ）利用对热的不稳定性,加热破 坏某些组分，而保存另一些组分； ）酸碱变性。 ）利用表面活性剂(三氯乙酸)或 有机溶剂引起变性； 6262 选择性变性沉淀法是使杂质变性 沉淀，又对目的物没有明显影响，所 以在操作之前要对欲分离的物质中的 杂蛋白等杂质的种类、含量 及其物理化学性质 等有比较全 面的了解。 选择性变性沉淀法 6362 例如对于-淀粉酶等热 稳定性好的酶，可以通过加热 进行热处理，使大多数杂蛋白 受热变性沉淀而被除去。 6462 酚、氯仿、十二烷基磺酸钠等酚、氯仿、十二烷基磺酸钠等 目的是使核酸和蛋白质分离，蛋白质变性目的是使核酸和蛋白质分离，蛋白质变性 沉淀，核酸则存在于水溶液中。沉淀，核酸则存在于水溶液中。 在核酸提取液中加入氯仿-戊醇，振荡一段 时间、使蛋白质在氯仿-水的界面上形成沉淀而被 除去，核酸仍然留在水溶液中。 在DNA、RNA混合溶液中，用异丙醇选择性地 沉淀DNA，而RNA留在溶液中。 选择性沉淀法选择性分离核酸选择性分离核酸 6562 其他沉淀法 聚电解质（polyelectrolytes) 机理：架桥作用 盐析 降低水化度 多价金属离子(polyvalent metal ions) 机理： 与蛋白质分子上某些残基发生相互作用 6662 小结一下： 各种沉淀方法应用范围 6762 各种沉淀方法应用范围 盐析法：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 有机溶剂沉淀法：多用于生物小分子、多糖及 核酸的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。 等电点沉淀法：用于氨基酸、蛋白质等两性物 质的沉淀。多与其它方法结合使用。 非离子多聚体沉淀法：用于分离生物大分子。 生成盐复合物沉淀：用于多种物质(特别是小 分子) 选择性沉淀（热/酸碱变性沉淀）：多用于除 去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋 白。6862 Applications 早在50年前，Edwin Cohnx及其合作者就是用乙醇来完成蛋白质沉淀经 典实验的。他们应用低温乙醇分级沉淀人血浆的办法制备了白蛋白溶 液，并通过冷冻干燥将乙醇从成品中去除，所得产品成功地救治了 1941年珍珠港空袭后的幸存者。除此以外，免疫球蛋白、血纤维蛋白 原等其他许多蛋白质都是利用上述方法进行沉淀的。 6962 等电点沉淀 实例 l从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI8.9， 可先于pH 3.0左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸 性蛋白质(pI=3.0)。工业生产胰岛素(pI5.3)时，先调pH 至8.0除去碱性蛋白质，再调pH至3.0除去酸性蛋白质(同 时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)。 l碱性磷酸酯酶的pI沉淀提取：发酵液调pH 4.0后出现 含碱性磷酸酯酶的沉淀物，离心收集沉淀物。用pH 9.0 的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液重新溶解，加入2040%饱 和度的硫酸铵分级，离心收集的沉淀Tris-HCl缓冲液再 次沉淀，即得较纯的碱性磷酸酯酶。 7062 酵母干粉中加入0.066 mol/L磷酸氢二 钠溶液，37水浴保温2 h，室温搅拌3 h， 离心收集上清液，升温至55，保温20 min后迅速冷却离心去除热变性蛋白，上清 液中多为热稳定性较高的醇脱氢酶。 选择性热变性沉淀实例 7162 3.2 3.2 泡沫分离泡沫分离 3.2.1 泡沫分离原理 3.2.1.1 表面张力与表面吸附 向水中加入表面活性剂，水溶液的表面张力随 表面活性剂浓度的增大而下降。当表面活性剂浓度 达到一定值后，将发生表面活性剂分子的缔合或自 聚集，形成水溶性胶团。 表面活性剂在水溶液中形成胶团的最低浓度称为临 界胶团浓度（CMC） 在气液两相界面处的表面活性物质浓度与主体溶液 不同，这种现象称为表面过剩。 7262 3.2 3.2 泡沫分离泡沫分离 表面过剩量可用Gibbs吸附等温式表达 吉布斯吸附等温式应用于双组分体系稀溶液中的特殊形式 从式中可看出，吸附量 2(1) 的符号取决于表面张力随浓度的 变化率 d/dc，若 d/dc0 ，溶质发生正吸附；这时 溶质在表面上的浓度比溶液内部的大；反之，当 d/dc0 ， 溶质发生负吸附，这时溶质在表面上的浓度比溶液内部的小 ，即溶剂在表面上的含量更多。 7362 3.2 3.2 泡沫分离泡沫分离 在临界胶团浓度以下，表面活性剂溶液的表面张力随表面活 性剂浓度的增大而降低， d/dc0 ，溶质发生正吸 附；这时溶质在表面上的浓度比溶液内部的大；所以表面活 性物质在表面上聚集。 不同溶质的表面活性不同，在界面的浓聚行为不同，因此可 以用泡沫吸附技术进行分级分离。 7462 3.2 3.2 泡沫分离泡沫分离 对于表面活性物质，可借用Langmuir吸附等温式来表示表面 活性物质在溶液表面的吸咐。 k为一经验常数，与溶质的表面活性大小有关。 由这个关系式知： （1） 低浓度时，c很小，kc1，=，饱 和吸附量，再增加浓度，也不会增大，表明溶液表面吸附 达到最大吸附量，不可能有更多的溶质被吸附在溶液表面。 这个吸附量的极限值就称为饱和吸附量。（3） 中等浓度时 ，与c为曲线关系。 7562 3.2 3.2 泡沫分离泡沫分离 3.2.1.2 泡沫的形成和结构 3.2.2 泡沫分离设备和过程 泡沫分离设备主要有泡沫柱和消泡器构成 消泡液回流目标产物浓度较高，纯化倍数也较大，但产品 回收率较低，适用于浓缩纯化；消泡液不回流则相反，适用 于提取回收。 多柱串联可获得较高的收率和分离纯化效果 高速搅拌表面活性剂溶液可制备胶质气体泡沫（CGA）， CGA与液料接触，可吸附分离目标产物 7662 3.2 3.2 泡沫分离泡沫分离 3.2.3 泡沫分离的应用 泡沫分离优势：设备简单，易于放大；操作 简便，能耗低；可连续和间歇操作；可出来 体积庞大的稀料液；可直接用于处理含有细 胞或细胞碎片的料液；可以获得很高分离效 率。 影响分离操作的主要因素：液料性质、表面 活性剂、操作条件、泡沫柱 7762 4、胰蛋白酶的提取 从动物胰脏中提取胰蛋白酶工艺 u胰蛋白酶原的溶解：酸性条件下稳定 u溶解液中含有大量的酸性杂蛋白（pI 10.8) u浓缩分离胰蛋白酶原（盐析） u溶解激活（酶原-酶） u胰蛋白酶的进一步分离：酶溶液中糜蛋白弹性蛋白 等与胰蛋白酶在不同的盐浓度下溶解度不同 7862 胰蛋白酶的提取 （二）胰蛋白酶原激活 o滤饼溶解, 加入无水CaCl2,边加边搅拌,最终含有0.1M CaCl2； o5MNaOH调pH至8.0,加极少量胰酶搅拌，于室温下活化810小时； o活化完成，用2.5M H2SO4调pH至2.5-3.0，抽滤除去CaSO4沉淀。 （一）猪胰蛋白酶原的提取 1.胰脏绞碎加入2倍体积冷乙酸 (pH2.5)低温