实验五ELISA和补体结合.ppt

实验五 1.酶联免疫吸附试验（ELISA) 2.补体结合反应 1.酶联免疫吸附试验（ELISA) 免疫标记技术 定义： 将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素 、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物 ，间接测定未知的抗原或抗体。 分类： 放射免疫测定法：131I，32P 免疫荧光技术：FITC(异硫氰酸荧光素) ， PE(藻红蛋白 ) 免疫酶测定法：HRP，AP Isotype of antibody: Immunize Rabbit Mouse IgG1Mouse IgG1 Rabbit anti-mouse IgG1 Secondary AbSecondary Ab 免疫酶测定法 ( (E Enzyme nzyme I ImmunommunoA Assay,EIAssay,EIA) ) 用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(HRP)(HRP)，碱性磷酸酶，碱性磷酸酶(AP)(AP) 特点：特点： 高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性 高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pgpg水平微量检水平微量检 测测 定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值 分类：分类： 酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体 酶免疫组化法：酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。组织中或细胞表面的抗原。 酶联免疫吸附试验 ( (E Enzyme-nzyme-L Linked inked I ImmunommunoS Sorbentorbent A Assay,ELISAssay,ELISA) ) 用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液 ）中未知抗体或抗原的方法。 1.1.定义定义 2.2.分类分类间接法（间接法（Indirect ELISAIndirect ELISA）：）： 将已知抗原吸附于固相载体，酶标记 二抗 检测液相中未知抗体 双抗体夹心法（双抗体夹心法（Sandwich ELISA)Sandwich ELISA) ： 将已知抗体吸附于固相载体，酶标记 一抗 检测液相中的可溶性抗原 竞争法（竞争法（Competitive ELISA) Competitive ELISA) ： 将已知抗体或抗原吸附于固相载体， 酶标记抗原或抗体 检测液相中的可溶性抗原或抗体 酶联免疫吸附试验 ( (E Enzyme-nzyme-L Linked inked I ImmunommunoS Sorbentorbent A Assay,ELISAssay,ELISA) ) 3. 3. 原理原理（以间接性ELISA为例）： 显色显色 实验内容： 间接法测定溶血素 定性检测 实验材料 脱纤维绵羊红细胞 抗原 兔抗绵羊红细胞抗体（溶血素） 待测兔血清 HRP标记羊抗兔IgG 二抗 包被缓冲液：0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液 洗涤液：含0.05% Tween 20的0.01M pH7.4 PBS 底物缓冲液： pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液 底物溶液：OPD 10mg，底物缓冲液25ml，30% H2O2 40L 酶标板，酶标仪 实验方法 1.抗原的处理： 脱纤维绵羊血脱纤维绵羊血 加加3mL N.S3mL N.S，混匀，混匀 2000rpm2000rpm，5min5min 加加3mL N.S3mL N.S，混匀，混匀 2000rpm2000rpm，5min5min 取取2mL2mL压积红细胞压积红细胞 加入加入2mL2mL蒸馏水，震荡破碎红细胞蒸馏水，震荡破碎红细胞 用包被缓冲液稀释成用包被缓冲液稀释成1 1：400400备用备用 2.包被抗原： 取酶标板，加入取酶标板，加入100L/100L/孔的抗原稀释液孔的抗原稀释液 44，湿盒内，湿盒内，18h18h 取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体 以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次 3.加待测血清 标记各孔，加入相应液体100L/孔 1234 阴 性 空 白 阳 性 待 测 4.加二抗： 37，湿盒内，30min 甩干孔内液体 以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次 各孔加入酶标二抗100L/孔 37，湿盒内，30min 5.显色： 甩干孔内液体 以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次 加入底物溶液100L/孔 避光显色，10min 6.观察结果 实验方法 预期结果预期结果 阳性：显色为黄色 阴性：无色 1 2 3 4 阴性阴性 阳性阳性 注意事项 洗涤彻底，避免交叉污染。 按顺序加样，孔底无气泡。 包被和温育在湿盒内进行。 2.补体结合反应 （Complement fixation Test, CFT） 概念： 补体结合反应： 是指在补体的参与下，以绵羊红细胞 （SRBC）和溶血素（抗SRBC的抗体）作为指 示系统的抗原抗体反应。 补反中包括两个系统五种成分： 待检系统：已知Ag或Ab、待检Ab或Ag 及仅供一组Ag-Ab系统反应的定量补体。 指示系统：绵羊红细胞和溶血素。 原理： 待测系统待测系统 抗原抗原+ +未知血清未知血清 1 2 补体补体 12 Step 1 Step 1 抗原抗体复合物的形成抗原抗体复合物的形成 Step 2Step 2 补体的结合和耗竭补体的结合和耗竭 指示系统指示系统 SRBCSRBC+ +抗抗SRBCSRBC抗体抗体 Step 3Step 3 SRBCSRBC的裂解的裂解 12 1：No Ab； 2：Ab Ag 待测血清 Ab 阳性 No Ab 阴性 Ag Ag Ag 抗原：伤寒菌裂解产物 待测血清：56，30min 补体：豚鼠血清 2%绵羊红细胞 溶血素 材料： 方法： 12345 试验管试验管 血清血清 对照管对照管 抗原抗原 对照管对照管 补体补体 对照管对照管 SRBCSRBC 对照管对照管 待测血清待测血清 0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL 0.2mL0.2mL 0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL 0.2mL0.2mL 0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL 0.2mL0.2mL 0.2mL0.2mL0.4mL0.4mL0.8mL0.8mL 抗原抗原 补体补体 N.SN.S 摇匀，摇匀，3737，水浴，水浴15min15min 溶血素溶血素 SRBCSRBC 0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL 0.2mL0.2mL 0.2mL0.2mL 0.2mL 摇匀