纳米医药第3章-纳米粒子的检测与表征.doc

第3章 纳米粒子的检测与表征纳米粒子的检测与表征技术涉及单一微束或微束与场结合的各种分析手段。这些微束包括：光子、电子、中子、离子束；场包括：热、电、声、磁场；这些结合指发射（激发）、散射、吸收、光电离。目前，发展纳米粒子的检测与表征技术有两个重要途径：一是创造新技术，建立新原理、新方法。扫描隧道显微镜（STM）是其中最具标志性的代表，其检测原理为扫描探针显微技术（SPM），由此已派生出原子力显微镜（AFM）、磁力显微镜（MFM）等；二是对传统分析技术的改造。光子相关光谱（PCS）和高分辨透射电镜（HREM）是其中重要的代表。本章介绍了有关医药纳米粒子的粒度及粒度分布、表面电性、表面成分及价态、表面能、分散性及分散稳定性、结构的检测与表征技术，以及相关样品的制样技术。本章涉及的一些重要基本概念如下： 晶粒：指单晶颗粒，颗粒内为单相，无晶界。 一次颗粒：指含有低气孔率的一种独立的粒子，可以是单晶、单相，也可以是多晶、多相，即颗粒内部可以有界面，如相界、晶界等，又称原级粒子。 二次颗粒：指人为制造的粉料团聚粒子，如无机材料工艺中的“造粒”就是制造二次颗粒，凝聚体和附聚体统称为二次颗粒。 团聚体：指由一次颗粒通过表面力或固体桥键作用形成的大颗粒，分为硬团聚体和软团聚体。 纳米粒子：一般指一次颗粒，其结构可以是晶态、非晶态或准晶。只有一次颗粒为单晶时，纳米粒子的颗粒度（粒径）才与晶粒度相同。 颗粒度：即颗粒的尺寸（粒径、粒度）。 晶粒度：即晶粒的尺寸。3.1 纳米粒子的粒度及粒度分布纳米粒子的粒度是粒子大小的量度，是粒子的一维几何尺寸。球形粒子的直径就是粒径，非球形粒子的粒径或者用某种规定的线形性尺度表示，或者以某种意义的相当圆的直径表示，或者以在同一物理现象中的等效球体的直径表示，称为当量直径。粒度分布分为频率分布（相对分布）和累积分布。频率分布表示与各个粒径相对应的粒子占全部颗粒的（质量、体积或个数）百分含量；累积分布表示小于或大于某一粒径的粒子占全部颗粒的百分含量。Kaye1指出，目前国际上已经使用和正在研究的粒度、颗粒形状与比表面检测的方法，细分起来约有400余种。表3-1列出了具有代表性的纳米粒子的粒度及粒度分布检测方法。表3-1 纳米粒子的粒度及粒度分布检测方法技术方法粒度范围检测依据的性质或效应单一颗粒的粒度及当量径颗粒群的粒度分布及平均粒径*光子相关光谱（PCS）2nm3mRayleigh-Gans-Mie激光散射光强平均径透射电镜（TEM、STEM、AEM、HREM）1nm5m颗粒投影像的某种尺寸或某种相当尺寸投影圆当量径（Heywood径）；定方向径（Feret径）dF；等方向等分径（Martin径）dM个数平均径扫描探针显微技术（SPM）（包括STM、FIM、MFM等）1nm100m探针针尖与样品之间产生局域场的电子隧道效应扫描电镜（SEM）5nm10m颗粒投影像的某种尺寸或某种相当尺寸投影圆当量径（Heywood径）；定方向径（Feret径）dF；等方向等分径（Martin径）dM个数平均径X射线小角散射5nm100nm颗粒对X光的散射同效应的球直径平均体积（质量）径；个数平均径气体吸附*（BET）1nm10mm（0.01m2/g）气体分子在颗粒表面的吸附比表面积当量径*某一微分区间的粒径；n相对该粒径的粒子数。对单分散样品，对分布较宽的样品此关系式不成立。*粒子的形状系数，颗粒真密度，SW颗粒的比表面积。3.1.1 光子相关光谱（PCS）2, 3激光波长=632nm，当粒径时，属于Fraunhofer衍射范围，可把颗粒等效为球体，应用于普通粉体的检测（激光衍射法）；当时，属于Rayleigh-Gans-Mie散射范围，采用光子相关光谱（Photon Correlation Spectroscopy，PCS）技术应用于纳米粉体的检测（激光散射法）。PCS首次应用时间是1970年4。目前仪器制造商给出的检测下限是25nm，上限是12m。该法对单分散或窄分布颗粒系能给出相当准确的检测结果，但对宽分布和双（多）峰分布的颗粒系其准确性有所降低。光子相关光谱技术在发展过程中，不同学者曾用过其它一些学术名词，如动态光散射（Dynamic Light Scattering，DLS）、准弹性光散射（Quasi-Elastic Light Scattering，QELS）、自相关光谱（Auto-Correlation Spectroscopy，ACS）和光强涨落光谱（Intensity Fluctuation Spectroscopy，IFS）等。本书采用了近年来已普遍认可的称谓。1光子相关光谱（PCS）的检测原理根据分子运动学理论，一个悬浮在液体分散介质中的颗粒要受到周围介质分子的不断碰撞而做随机的布朗运动（热运动），颗粒越小，布朗运动越快，反之越慢。测量液体分散介质中颗粒的散射光强度，应用相关技术从散射光强度的起伏涨落中求得颗粒的平移扩散系数，再按Stokes-Einstein公式（，Boltzman常数，液体分散介质的粘度，绝对温度）求得颗粒的当量球形直径。相关技术是处理随机过程及噪声理论中常用的一种方法，PCS检测装置中的相关器就是用来对光电倍增管所接收到的大量散射光强随机信号反复进行“相乘”再“相加”，计算得到试样的时间自相关曲线，该曲线与理论曲线相比，即可求得被检测样的粒径。单分散颗粒系的光强自相关函数服从洛仑兹分布，是一指数衰减函数；对于多分散颗粒系，光强自相关函数将是单指数加权之和或分布积分，其数据处理极为复杂，有：累积分析法、双指数法、直方图法、指数采样法、区域分布函数法、拉普拉斯变换法、非负约束最小二乘法、CONTIN法等。累积分析法（Cumulant Analysis）假设指数分布符合单峰规律，它适用于单分散颗粒系或具有窄分布（分散度 0.080；Lognormal对数正态分布；MSDMultimodal Size Distribution，指用非负约束最小二乘法（NNLS）得到的多峰分布；G(d)频率值；C(d)累积值。图中其余标记或能一目了然，或是仪器参数，在此不再赘述。从图3-3可看出，纳米粒子呈标准的对数正态分布，按累积分析法测得的有效粒径=69.1nm，Polydispresity值等于0.212。从图3-4可看出，按非负约束最小二乘法测得的平均粒径=112.9nm，大于按累积分析法测得的数值。纳米粒子呈三峰分布，峰值分别为49.8nm、149.2nm和422.0nm，三峰对应的粒子数量分别占67%，24%和9%。而通过透射电镜观察得知其粒径为4050nm，所以可认为49.8nm对应于样品的一次粒径，422.0nm对应于团聚颗粒的粒径。对此样品，非负约束最小二乘法比累积分析法能提供更多的信息。MSD图3-3 粒度累积分析法分布曲线 图3-4 粒度非负约束最小二乘法分布曲线2样品制备被检测样的充分分散是重要前提，通常采用改变分散相及分散介质的性质、超声分散、选用合适分散介质或添加某些分散剂等措施进行分散，但纳米颗粒在介质中的分散要根据不同的材质有针对性地进行，属专门技术，此处不作进一步讨论。当颗粒粒径100nm时，可直接将试样分散在介质中，粒径更小时则需采取进一步的净化措施，如通过离心分离、过滤等。试样应充分稀释，避免颗粒间的范德华力，颗粒表面也不应有静电荷等，以消除颗粒间的一切可能相互作用。在一定范围内适当提高试样的浓度可以提高信噪比，有利于提高检测结果的准确性。PCS检测时的最佳试样浓度与许多因素有关，应比其它光检测方法中的浓度要低，一般要求其质量浓度在2g/ml200g/ml范围，试样配制后外观上应是明亮或略微混浊的。必要时，应进行不同浓度下的系列检测，并将所测结果外推到试样浓度等于零时的数据。由于颗粒的扩散系数DT和介质的粘性系数均与温度密切相关，为此，为得到可靠的检测结果，检测应在恒温下进行。同理，当在检测过程中向样品池中添加某些溶剂时，要考虑由此引起的温度和介质粘度系数的可能变化。3.1.2 透射电镜5,6包括普通透射电镜（TEM）、扫描透射电镜（STEM）、分析电镜（AEM）和高分辨透射电镜（HREM）。以下简单介绍透射电镜的基本原理，着重介绍高分辨透射电镜（HREM）的特征。直接观察和研究材料的微结构对于新材料的研制和开发、材料性能的改进以及材料可靠性的评价十分重要，高分辨电子显微方法正是一种在实空间中直接观察材料微观结构的实验技术，它不仅可以获得材料中晶胞排列的信息、还可以确定晶胞中原子的位置。对于现代的200kV级电子显微镜，点分辨率已高于0.2nm，而对于1000kV级高压电镜，点分辨率已达到0.1nm。这样高的分辨率已能分辨几乎所有物质晶体中原子的排列。X射线衍射和中子衍射的精密结构分析方法给出的是晶体的平均结构信息，而高分辨电子显微方法可分析的体积比X射线结构分析的小1014倍，这对非均匀材料、准晶、非晶、或者空位、原子、位错、层错等晶体缺陷，以及晶界、相界、畸界、表面等界面的研究极为有效。1透射电镜的检测原理透射电镜中像的形成可理解为一个光学透镜（物镜）的成像，如图3-5光路图所示。具有一定波长（）的电子束入射到晶面间距为d的晶体时，在满足布拉格条件：2dsin=的特定角度（2）处产生衍射波，该衍射波在物镜的后焦面上会聚成衍射点（电子衍射花样）。在后焦面上的衍射波继续向前运动时，衍射波合成，在像平面上形成放大的像（电子显微像）。通常，将生成衍射花样的后焦面上的空间称为倒易晶格空间，将试样位置或成像平面称为实空间。从试样到后焦面的电子衍射，即是从实空间到倒易空间的变化，在数学上用傅里叶变换来表示。图3-5 用光学透镜表示电子显微成像过程的光路图观察电子显微像时，先观察衍射花样，将光闸插入物镜的后焦面，在电子衍射花样中选择感兴趣的衍射波，调节透镜就能得到电子显微像。如图3-6（a）所示，用物镜光阑选择透射波观察时称为明场方法（得到明场像）；如图3-6（b）所示，用物镜光阑选择一个衍射波观察时称为暗场方法（得到暗场像）。对于这两种像，其透射波或衍射波的振幅随区域受到不同的吸收和散射产生的衬度叫吸收衍射衬度（或振幅衬度）。如图3-6（c）所示，在后焦面上插入大的物镜光阑时，可以使两个以上的波合成（干涉）形成像，称为高分辨电子显微方法，该法所使用的即是高分辨透射电镜（High-Resolution Electron Microscope），观察到的像称为高分辨电子显微像。高分辨电子显微像的衬度是由合成的透射波和衍射波之间的相位差形成的，称为相位衬度。图3-6 各种电子显微观察方法中物镜光阑插入的模式（a）明场方法；（b）暗场方法；（c）高分辨电子显微方法（轴向照明法）利用不同衍射条件和试样厚度，可以观察到带有各种相应信息的高分辨电子显微像，主要有以下5类： 晶格条纹； 一维结构像； 二维晶格像（单胞尺度的像）； 二维结构像（原子尺度的像，晶体结构像）； 特殊的像。图3-7示出了纳米粒子的透射电镜像（120k）。可看到，粒子呈近似球形，颗粒间粘结情况较严重，粒径在20nm50nm左右，为进一步研究其晶粒生长情况，对其用高分辨透射电镜（1500k）进行了观测，如图3-8所示。从图3-8可观察到多相共存的复杂像衬度和大畸变的衬度，以及不同取向的晶格条纹（其间宽即是晶面间距）和非晶态的衬度。图3-9提供了与图3-7和图3-8对应的团聚体的扫描电镜像，请读者参考。 图3-7 纳米粒子的透射电镜像 图3-8 纳米粒子的高分辨透射电镜像2样品制备7-11在生物医药领域中应用电子透射电镜分析技术，比在其它领域中晚，其主要原因不是在仪器设备方面存在问题，而是在样品制备中碰到了许多困难： 多数生物样品中含有大量水分，不能直接放入电镜的真空系统中分析； 生物样品中的许多成份是以可溶性状态存在的，如果用常规的样品制备方法，则会导致这些可溶性成份的损失或重新分布； 因为生物样品一般都不易导电和导热，因此在对其进行分析时会引起电荷积聚和局部受热，导致放电和热损伤； 样品在制备和分析过程中易受别的物质的污染； 透射电镜的光源不是光束而是电子束，因为电子束的穿透能力较光束为小，不能穿透像石蜡切片那样几个微米厚的材料，所以必须制备厚度在100nm以下的超薄切片样品，它比石蜡切片的操作过程更为复杂细致，所有的试剂、包埋介质的要求也不相同。所有这些都会给分析造成误差和困难，因此，电镜分析技术中的样品制备，是这种技术能否在医药科学领域中得到广泛应用的关键。（1）常温下的样品制备技术 无机纳米颗粒、含水率低的颗粒样品、乳液制剂：将颗粒样品放入与样品不发生反应的有机溶剂（如丙酮、乙醇、丁醇等）中（一些团聚较严重的样品可先在玛瑙研钵中加少量试剂研磨一下），用超声波分散制成均匀悬浮液，对于乳液制剂不需此步骤。取少量上述所制悬浮液或乳液制剂滴在用碳或金增强的微栅铜网上，此微栅预先是放在滤纸上的，试剂被吸干和挥发完毕后即可进行检测。 蛋白、核酸、肽类等液滴样品：用微量针筒吸取10pl10nl的液体样品，置于硅玻璃片上，上面用盐饱和的石蜡油覆盖，以防止水分蒸发。分析时用一特制的微量移液管从上述样品中吸取一定量（20pl80pl）样品，一个微量移液管一次可以吸取四五十个样品，样品之间用石蜡油分开，然后置于特别抛光的铍片上。同样，用盐饱和的石蜡油覆盖，一块铍片上可以放置多个样品。上述操作都要在解剖镜下用微操纵器进行。待所有样品转移完毕，用二甲苯或氯仿除去石蜡油，立即在经液氮冷却的异戊烷（-160）中冰冻，然后在真空中冰冻干燥（-70，10-3Pa）56小时，干燥后的样品在室温下保存在放有硅胶干燥剂的真空中待分析。 其它动、植物纳米药物主要运用湿化学法制样技术，该技术在制样过程中要使用各种溶液，它与常规的电镜样品制备技术类似，通常包括固定、洗涤、脱水、包埋固化、超薄切片等步骤。在这些过程中，样品要与各种液体接触，不可避免地会引起样品中的可溶性成分发生损失或重新分布，有的可能引入新的成份而导致样品污染。因此，利用这种方法制样时，要根据透射电镜的要求，对某些步骤作适当的改进或省略，以尽可能保持样品中的成份不变。固定：通常运用化学固定方法，这是目前超薄切片术中常用的一种方法，即用一定的化学试剂来固定待测样品的结构。各种用于普通光学切片的固定液均不适于超薄切片，因这类固定液含有的酸对生物样品结构有较大的损伤作用。电镜技术中采用的是戊二醛-锇酸双固定法，即样品先在26%戊二醛中固定24小时，经缓冲液清洗后再用1%锇酸作后固定。除此之外，还可在戊二醛-锇酸中加入鞣酸作三重、四重固定。洗涤：样品固定前后均要用缓冲液反复冲洗，停留数小时后再多次冲洗，每次20分钟以上。脱水：用乙醇或丙酮脱水，浓度从低到高分级进行，30% 50% 70% 83% 95% 100%，每级20分钟，最后一级（100%）要进行三次，每次20分钟。有些样品在脱水过程中成分损失很大，可以省去脱水步骤，直接进行包埋。包埋：经过固定和脱水后的样品，大都需要用树脂等包埋剂浸透样品，将其中的脱水剂置换出来，等包埋剂固化后，样品才能切片。对包埋剂的要求是：对细胞组分的抽提作用小；能很好地保持细胞的超微结构；在电子束照射下稳定；对样品产生最小的污染。常用的包埋介质是聚酯树脂和环氧树脂等。为使树脂更好地渗入样品，把脱水剂置换出来，有时在乙醇脱水之后、包埋之前使用1,2-环氧丙烷之类的过渡溶剂（用丙酮脱水时不需使用过渡溶剂），因为乙醇和树脂互溶性不好。切片：在电镜中进行检测的样品，既要求样品切片足够薄，以获得好的分辩率，有时又必须有一定的厚度，使其含有足够量的成份，以便能获得具有统计意义的成份分析结果。切片多厚为宜，与样品中待测成份的含量有关，更重要的是取决于使用何种仪器。有时可以连续切出厚度不同的切片，用于不同的检测目的。切片中碰到的问题主要是样品中成份的损失和对样品的污染。切片时将切片漂浮在附着于刀上的液槽中，并用适当溶剂（如液体石蜡、氟里昂等，尽量不使用普通电镜切片中使用的氯仿溶剂）使其展平，然后收集在样品载网上。样品刀可使用金刚石刀或玻璃刀，不能用钢刀。染色：其目的是增加电子图像的反差，以便更好地观察超微结构。常用的染色剂为醋酸氧铀酰、柠檬酸铅以及含有磷钨酸、锰、锇、钍、铋、钒和铬的染色剂。其干扰、污染不可避免，所以在分析时尽量不用，如果反差太小必须染色的话，则要仔细考虑染色剂将带来的影响。样品镀膜：生物样品一般都是热和电的不良导体，在电子束的照射下，样品可能局部过热或积聚电子导致损坏。为解决这一问题，可在样品表面镀上一层导电的碳膜或金膜等，膜厚5nm10nm。（2）低温条件下的样品制备技术低温条件下的样品制备技术，主要是使生物样品骤冷，其中的水分迅速变为固态，更接近于它原来的自然状态。低温制样法包括冷冻干燥、冷冻置换、冰冻超薄切片、冰冻含水样品制备等。所用的冷冻剂有液氮（-196）以及经液氮冷却的异戊烷、氟里昂、丙烷、乙二醇等。后面这些冷却剂比直接用液氮冷冻效果好，因为直接用液氮冷冻，当样品投入时，会引起液氮沸腾，在组织表面会形成一层气泡而降低冷冻速度。有时为获得更低的温度，可以使用熔融状态的液氮浆（liquid nitrogen slush），其温度可低达-2160C。办法是，将液氮置于真空中减压蒸发，使其温度降低到熔点附近，此时液氮变成浆糊状，然后迅速将其从真空中取出，将样品以最快的速度投入冷冻。为加速热量从样品中传导，通常将小的样品块预先粘附在金属块上，一起投入冷冻剂。在样品中形成冰晶是使用冷冻技术时最常碰到的问题之一。冰晶会破坏样品的结构，同时会引起成份在样品中位移。减少冰晶影响的方法之一是加快冷冻速度。冷冻速度越快，形成的冰晶越小，成份移动也越小。另一种方法是使用冷冻保护剂（cryoprotectant），即先用冷冻保护剂如低分子量的甘油、乙二醇，高分子量的聚合物如聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）、羟乙基淀粉（HES）、葡聚糖（dextran）等处理样品，然后再进行骤冷。冷冻后样品的进一步的处理可以通过冷冻干燥、冰冻超薄切片、在冷冻条件下用有机溶剂置换样品中的水分或让水分保持在样品中进行分析等。冷冻干燥法：在真空条件下使冰从样品中升华而被除去。冰升华的速度是冰周围蒸气压的函数，因此，干燥的速度取决于样品的温度、体积、形状、样品中结合水和游离水的相对数量，以及干燥器中的真空度。一般在-60 -110之间进行干燥，真空度达10-2Pa或更高，干燥时间要视样品的体积、性质和干燥温度而有所不同，短则几小时，长则数天时间。样品干燥后要逐步将其温度升高到常温，再进行切片或作其它处理。另一种冷冻干燥的方法是低温吸收法。即将冷冻过的样品置于预先冷却的样品架上，封闭在一个容器中，内装干的分子筛凝胶，然后将整个容器放入液氮中，在-70保持3天或在-60保持6天。在此过程中，干凝胶将样品中的水分吸收，不需要真空系统。上述干燥后的样品要保持在干燥器中，以防止重新吸潮。也可以将其用树脂包埋，再制成切片分析。冷冻置换法：是将样品先快速冷冻，然后用某种合适的有机溶剂，在低温下将样品中的水分置换出来，再用树脂包埋、切片。冷冻置换通常在-80-110进行。多种溶剂如丙酮、乙醚、乙醇、甲醇等，都可以用作置换剂。乙醚（可在其中加入120%的丙烯醛）是比较理想的一种，丙酮其次，乙醇则较差。置换结束后，将样品的温度慢慢升高，等升到室温后，再用树脂包埋。固化后的样品块用超薄切片机切成0.5m1m的片。漂浮切片的液体可以用液体石蜡或氟里昂等作为槽液，或者进行干切。冰冻超薄切片技术：是将样品骤冷，然后用冰冻超薄切片机进行切片，再在低温下干燥。用冰冻超薄切片法制备的样品，其样品内的成份损失很小，但是难以获得满意的超微结构细节。冰冻方法、样品块和刀的温度、切割速度、刀的角度和锋利程度、冰冻干燥的效率等都会影响切片的质量。冰冻含水样品的制备：冰冻含水样品的制备，其冰冻、切片等操作与冰冻超薄切片差不多。样品切片后，要用特制的工具将其转移到装有冷冻操作台的电镜中进行分析。无论是冷冻、切片，样品转移或分析，都应该在尽可能低的温度下进行操作，最好低于-130。超薄切片的图像分辨率较好，所得的图象反差大，定量分析也较容易，但其中的水分较厚样品中难以很好地保持。考虑到上述问题，目前多采用的样品厚度为1m 2m。冰冻含水样品由于水分保持在样品内，能尽可能好地保持其原始状态。但是该法制备样品所得到的电子图像的反差小，难以获得较好的超微结构图像，另外对设备要求高，操作也比较复杂，不仅要有冰冻切片机，而且要有特制的转移样品的装置和分析样品的冷冻台。（3）样品的支持物无论是哪种方法制备的样品，在对其分析的时候，都必须放在某种支持物上，才能放入电镜中进行分析。切片样品可直接放在样品载网上，而颗粒样品、液滴样品等，则通常置于某种透明的或不透明的样品载片上。样品载网可以用铜、钛、镍、钼、铝、铂、金或尼龙制成。用载网支持样品时，要先在样品网上覆盖一层支持薄膜，这薄膜可以用火棉胶、碳、聚乙烯醇缩甲醛（Formvar膜）、硝化纤维素制成。薄膜在电镜观察时不应显示自身结构，应当坚固、耐高温、能经得住电子的轰击，还必须尽可能的薄，使得电子透过时不被明显的吸收，不降低其空间分辨率，其厚度通常为15nm20nm。3.1.3 扫描探针显微技术（SPM）扫描探针显微技术（SPM）包括扫描隧道显微镜（STM）及其在其基础上发展起来的各种新型显微镜，如原子力显微镜（AFM）、磁力显微镜（MFM）、激光力显微镜（LFM）、静电力显微镜（EFM）、弹道电子发射显微镜（BEEM）、扫描离子电导显微镜（SICM）、扫描隧道电位仪（STP）、光子扫描隧道显微镜（PSTM）等，成员已有数十个。它们所具有的共同特点是均有一个很细的针尖，在工作状态下，针尖与样品之间产生高度局域化的场，如电场、磁场、力场等，该局域场可以用作探针以观察原子和分子，获取样品表面纳米尺度的形貌和电学信息。该局域场还可用作加工工具以操纵原子和分子，对表面进行纳米尺度的修饰加工12-15。1982年，Bining和Rohrer等发明了扫描隧道显微镜（Scanning Tunneling Microscope，STM）。它的出现，使人类能够实时地观察单个原子在物质表面的排列状态和与表面电子行为有关的物理、化学性质，在表面科学、材料科学、生命科学等领域的研究中有着广阔的应用前景，被国际科学界公认为80年代世界十大科技成就之一。1986年STM的发明者获得了诺贝尔物理学奖。1扫描隧道显微镜（STM）的基本原理扫描隧道显微镜以原子尺度的极细探针（通常用0.1mm0.3mm的铂铱合金丝或钨丝经电化学腐蚀制作）及样品（表面）作为电极，固定在压电陶瓷传感器（三维扫描控制器）上的探针沿样品表面扫描。根据量子力学理论，由于金属中的自由电子具有波动性，电子波向表面传播，在遇到边界时，一部分被反射，另一部分则可透过过界，从而形成金属表面上的电子云。当针尖与样品表面非常接近（约1nm）时，它们的电子云将相互渗透（透射波相互重叠），在偏压作用下产生隧道电流，电流方向由偏压极性所决定，电流强度随针尖与样品间距成指数规律变化，减小0.1nm则隧道电流（根据材料不同）增大101000倍。通过记录扫描过程中针尖位移的变化（恒电流工作模式）或隧道电流的变化（恒高度工作模式），即可得到样品表面三维显微形貌图。扫描隧道显微镜的特点： 具有原子级高分辨率，它在平行和垂直于样品表面方向的分辨率分别可达0.1nm和0.01nm，即可分辨出单个原子； 可实时地得到在实空间中表面的三维（结构）图像。在STM出现以前，没有一种显微技术在横向和纵向都能达到原子级分辨率。尽管扫描电镜、透射电镜和场离子显微镜的横向分辨也比较高，但扫描电镜要求样品表面镀上导电层，透射电镜仅适用于研究极薄样品的体相和界面结构，场离子显微镜仅能探测吸附在直径小于100nm针尖上的样品原子二维几何结构，都有一定局限性。而利用其它衍射手段都不能对样品实空间直接观察，而是从得到的间接信息中反推样品结构。STM则能够直接获得样品表面的结构信息； 可观察金属、半导体和超导体等的单个原子层的局部表面结构，而不是体相或整个表面的平均性质，因而可直接观察到表面缺陷、表面重构、表面吸附体的形态和位置以及由吸附体引起的表面重构等； 可在真空、大气、常温、高温等不同环境下工作，甚至可将样品浸在水或其它溶液中，不需要特别的制样技术，并且探测过程对样品无损伤，这些特点特别适用于研究医药样品和在不同实验条件下对医药样品的评价； 配合扫描隧道谱可得到有关表面电子结构的信息； 相对于透射电子显微镜，它的结构简单、成本低廉； 扫描隧道显微镜的局限性：不能探测样品的深层信息，无法直接观测绝缘体，探针扫描范围小，探针质量依赖操作者的经验等。2STM在生物医药领域中的应用16-25STM可改变观测范围，为研究各种不同层次的生物样品结构提供了可能，目前STM的扫描范围可从数纳米到100m，对应于原子、分子、超分子、亚细胞乃至细胞水平的不同层次，已在生命科学领域获得了广泛应用，已经拍摄并解析了核酸、蛋白质（包括氨基酸和多肽、胶原蛋白、细胞骨架蛋白、HPI蛋白、蛋白聚集体、分散蛋白质等）、生物膜（二磷脂酰胆碱DMPC膜、卵磷脂双层膜、TE671细胞膜）的STM图像。STM应用于医药技术中遇到