RNA干扰现象的发现.ppt

RNA干扰现象的发现 2001级博：潘 皎 导 师：张义正教授 2003年4月24日 RNA干扰 一些小的双链RNA可以高效、特异地阻断体内 特定基因表达,促使RNA降解,诱使细胞表现 出特定基因缺失的表型,称为RNA干扰(RNA interference, RNAi,也译作RNA干预或者干涉 )。 RNAi一种新的遗传工具 nRNAi是植物、果蝇、线虫和很可能包括哺乳动物在内的许多生物 抵抗病毒感染和限制转座子运动的一种自然存在的防御机制。 nRNAi可以作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具，来制 备特定基因缺失表型的个体, 从而研究该基因的功能.它正在功能 基因组学领域掀起一场真正的革命,并将彻底改变这个领域的研究 步伐,为此被SCIENCE评为2002年最重要的科研成果之一。 n在哺乳动物细胞中用siRNA (2123核苷酸长的小分子干扰 片段(small interfering RNAs,siRNAs,又被称为引导RNAs)。能 高效阻断某个特定基因的表达,这项技术在疾病的基因治疗上也有 光明的应用前景。特别可以用于阻断某些突变基因的表达,或者由 蛋白过量表达引起的疾病。 共抑制现象的发现 研究的早期线索早在20年前,来自于美国和荷 兰的两个转基因植物实验组Richjorgensen和同事,在 对矮牵牛(petunias)进行的研究中有个奇怪的发现:将 一个能产生色素的基因置于一个强启动子后,导入矮脚 牵牛中,试图加深花朵的紫颜色,结果没看到期待中的 深紫色花朵,多数花成了花斑的甚至白的。jorgensen 将这种现象命名为共抑制(cosuppression),因为导入 的基因和其相似的内源基因同时都被抑制。开始这被 认为是矮牵牛特有的怪现象,后来发现在其他许多植物 中,甚至在真菌中也有类似的现象。 随后几年,另外几个植物学家也发现了类似的 现象。如Santa等,将番茄病毒复制所需的复 制酶基因导入烟草中,以阻断病毒的生活周期 而控制病毒的生长,但有些烟草表现出抗病毒 的特性,而另外一些则相反。随后,在植物病毒 实验中也观察到共抑制现象,并发现共抑制具 有抗病毒功能。 Quelling现象 并非只有植物学家才注意到了这种意外的现象 。意大利的Cogoni等,将外源类胡萝卜素基因 导入链孢霉(Neurosporacrassa),结果转化细 胞中内源性的类胡萝卜素基因也受到了抑制。 而在真菌转基因实验中这种共抑制现象被称为 “quelling”。 基因沉默 n转录阶段基因沉默(transcriptional gene silencing ,or TGS)：对于部分植物来说,转基因引发的基因沉默 可能是因为基因特异的甲基化而导致,这被称为转录阶 段基因沉默. n转录后发生的基因沉默(post transcriptional gene silencing ,or PTGS) 等,率先在发生的西红柿中检测出与被沉默基 因同源的约25的短片段,而未发生的西红柿则不能检 出25的 . ,1999,286(5441):950 952 RNA干扰现象的发现 线虫中首次发现了RNAi ： 首次发现dsRNA能够导致基因沉默的线索来源于秀丽新 小杆线虫(Caenorhabditis.elegans)的研究。1995年 康乃尔大学的研究人员Guo和Kemphues尝试用反义RNA (antisense RNA)去阻断par1基因的表达以探讨该基因 的功能,结果反义RNA的确能够阻断基因的表达,但是奇 怪的是,注入正义链RNA(sense RNA)作为对照,也同样 阻断了基因的表达。 ,., 1995,81:611-620. 这个奇怪的现象直到3年后1998才被解开华盛顿卡耐基研究 院的Andrew Fire和马萨诸塞大学癌症中心的Craig Mello首次将 双链dsRNA正义链和反义链的混合物注入线虫,结果诱发了 比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默。将体外转 录得到的单链纯化后注射线虫时,基因抑制效应变得十分微 弱,而经过纯化的双链能够高效地特异性阻断同源基因的表 达。实际上每个细胞只要很少几个分子的双链已经足够完 全阻断同源基因的表达。后来的实验表明在线虫中注入双链 不单可以阻断整个线虫的同源基因表达,还会导致其第一代子代 的同源基因沉默。他们将这种现象称为干扰。 , .,1998,391:806811. n潜在的作用促使F和继续实验,将 一种能够表达与22 基因同源的双链的基因工程细菌 喂食线虫,结果线虫表现出类似22缺陷的表型。 ，1998，395：854 n后继的实验表明将线虫浸入双链中同样可以诱导基因沉默 这种技术使得大规模筛选线虫诱导的功能缺失突 变体成为可能,并引发后继的大量针对这种模式生物基因敲除的研 究， 1998 ，282：430431 n涡虫() ，1999 ，96：5045054 n水螅() ， ，1999 ，214：211214 n锥虫() ，1998 ，95：1468714692、 n真菌(）（neurospora crassa) ，1999，339：166 169 n在果蝇(Drosophila)中发现i Berstein E et al Nature 2001,409(6818):363-366 n在拟南芥中发现i Wassnengger M et al plant Mol Biol 1998,37(2):349-362 n在小鼠中发现i Wianny F et al Nat cell Biol 2000 ,2 (2):70-75 果蝇中的 n在果蝇的研究中同样发现。尽管采用能生产 的酵母喂食果蝇的实验以失败告终,但是通过显微注射或者通过基 因枪将注入果蝇胚胎中、或者将带有反向重复序列的 导入果蝇中能够引发基因沉默。 n来自于冷泉港研究组和麻省医学院的 研究组分别利用果蝇培养细胞和果蝇胚胎,将外源转染 果蝇细胞2或将之直接加入胚胎提取物,同样发现与西红柿非常 相似的结果:加入的被特异地切割成2123的 ,而且这些具有核酸酶活性的 2123的能 够特异地降解与之同源的 ,从而抑制相应基因的表达。 .,2000,404(6775):293296 .,2000,101(1):2533 核酸酶() 最近,研究组从果蝇中成功地分离 出能特异切割的家族 核酸酶()。 .， 2001,409(6818):363366 在哺乳动物细胞中的研究 最近,等在实验中发现哺乳动物细胞中同样存在效 应。他们将一种特殊构建的（对称性3突出2nt约21nt）双 链复合物通过阳离子脂质体转入不同的哺乳动物细胞中,包括细 胞和人胚肾293细胞等,观察到了可重复的,序列特异性的。 的序列专一性要求非常严谨,与靶之间一个碱基错配都会 显著削弱基因沉默的效果。他们还发现：30的引起的阻 抑效应是广泛的,非特异性的。原因是：30的可诱发哺 乳动物细胞内的干扰素系统,它能激活两种酶,一种为蛋白激酶,激 活的通过一系列的磷酸化使翻译起始因子2失活,导致翻 译抑制。在另外一个途径中,长激活,致非特 异的降解。 , .,1999,13:31913197 n 2002年5月,美国科学家等报道,采用21个 核苷酸双链形成双链,加入到感染艾滋病病毒的细胞 中,24后,可减少艾滋病病毒基因表达90%以上,这种双链 可阻断艾滋病病毒感染培养的细胞。7月,等用 技术实现了 1病毒的阻抑。 n2002年7月4日,自然杂志又介绍了美国科学家 等人将合成的双链和通过载体将双链形成小发 夹状的双链直接注入鼠的肝脏,并将肝炎病毒与标志基因 相连后感染鼠肝脏,这种双链或双链发夹状对标志基 因的表达抑制分别达到81%和92 8%,表明这两种双链均可明 显地抑制成体鼠肝脏内导入的肝炎病毒基因的表达。许多实验 都证明利用可以直接和有效地起到抗病毒的作用。 21的双链复合物在哺乳动物细胞中干 预成功为基因作用的研究提供了一种新的工具,原来要 花费6个月至一年的时间才能明确一个哺乳动物细胞基 因如何关闭,现在只需一个星期就能明确10个基因的关 闭,使工作进程大大加快。可以预见,作为一 种快速关闭基因的途径,将会越来越多地用于哺乳动物 基因研究。 遗传学通过基因突变筛选技术在基因水平肯定线虫中共抑制、 和分享共同的基因,具有相同的作用形式,即 介导的靶基因沉默。导入不仅使线虫、果蝇、 小鼠和人细胞中相应基因表达抑制,也在植物中表现出同样效果,