《酯酶与氧化酶》PPT课件.ppt

Esterase 一、基本概念 1. 定义： 酯酶(Esterase), 催化作用于酯类物质的酯健,使之水 解的酶的总称,包括磷酸酶, 羧酸酯水解酶, 硫酸酯水解 酶等。 羧酸酯水解酶(Carboxylic ester hydrolase)，是所有能 催化羧酸酯水解的酶的总称（或称酯酶），其作用是 水解脂肪族酯和芳香族酯，催化的反应式： 羧酸 2. 酯和酯键 酯由来自羧酸的酰基和来自醇的烃氧基组成，是羧 酸与醇反应失水而生成，即羧基上羟基和醇羟基上 的氢共同脱水。通式R-CO-OR，结构上可看作羧酸 中的羟基被烃氧基（-OR）取代的产物，亦可看作 醇中羟基的氢原子被酰基（R-CO-）取代的产物。 羧酸 酰基（R-CO-）是含氧酸分子（RCOOH）中去掉酸性 OH后（即能离解出H+的OH基）余下的基团。包括丙 酰基(丙酸）、苯甲酰基（苯甲酸）、草酰基（草 酸）、苯磺酰基（苯磺酸）、亚硝酰基（亚硝酸） 、亚硫酰基（亚硫酸）、磷酰基（磷酸）。 3. 酯酶与水解反应 羧酸酯酶水解羧酸酯为醇和羧酸 芳香酯酶水解乙酸苯酯为酚和乙酸 脂肪酶水解甘油三酯为甘油二酯和脂肪酸 乙酰酯酶水解乙酰酯为醇和乙酸 乙酰胆碱酯酶水解乙酰胆碱为胆碱和乙酸 胆碱酯酶水解酯酰胆碱为胆碱和羧酸 根据酶对底物、pH、激活剂、抑制剂的反应特 点，可将酯酶分为20余种，在生物化学上统称为酯酶 ，只有一部分可用组化的方法证明。通常根据对底物 是否具有特异性，可分为特异性与非特异性酯酶两种 。分解短链（C2C4）低级脂肪酸酯多为非特异性酯 酶，如芳香基酯酶、羧酸酯酶和乙酰酯酶。特异性酯 酶据其底物特异性可分为，分解长链(C8以上）高级 脂肪酸酯的酶称酯酶(Lipase)，分解乙酰胆碱的乙酰 胆碱酯酶，分解酯酰胆碱的胆碱酯酶。 二、酯酶的分类 （一）非特异性酯酶(non-specific esterase)： 无底物特异性。根据E600, DFP, PCMB对它们 的抑制作用不同，分为3类. 1. 芳香基酯酶(Aromesterase)，即A-酯酶，亦称有机 磷酸抵抗性酯酶I。 （）底物： 萘酚乙酯 萘酚乙酸酯类 吲哚酚乙酸酯类 （）完全抑制 10mmol/L 磷酸二乙基对硝基苯酯(E 600) 1mmol/L CuSO4 1mmol/L Pb(NO3)2 10mmol/L AgNO3 100 mol/L 对氯高汞苯甲酸(PCMB) （）激活 mmol/L 半胱氨酸(Cysteine) 、脂肪族酯酶（aliesterase),即B-酯酶，亦称有 机磷酸敏感性酯酶 （）底物 萘酚乙酯； 萘酚乙酸酯类； 吲哚酚乙酸酯类。 （）完全抑制 10mol/L 磷酸二乙基对硝基苯酯(E-600) 100mol/L 毒扁豆碱(Eserine) 10mmol/L AgNO3 .乙酰酯酶(acetylesterase)：即C-酯酶， 又称有机磷酸抵抗性酯酶 （）底物 吲哚酚乙酸酯类 萘酚AS乙酸酯类 （）完全抑制 10mmol/L -苯丙酸 10mmol/L AgNO3 1mmol/L CuSO4 （） 激活 100mol/L 对氯高汞苯甲酸(PCMB) 100mol/L 苯氯化汞 非特异性酯酶 A酯酶B酯酶C酯酶 别称 芳香/芳基 酯酶, 有机 磷酸抵抗性 酯酶 羧酸酯酶, 芳香族酯酶 , 有机磷酸 敏感性酯酶 乙酰酯酶, -SH 抑制性抵抗性 酯酶, 有机磷酸 抵抗性酯酶 E600 (10- 4mol/L) 抑制 PCMB (10- 4mol/L) 抑制激活 （二）特异性酯酶(Specific esterase) 根据底物的特异性分为三种: 、脂酶(Lipase) 底物：高级脂肪酸 抑制剂：毒扁豆碱(eserine) 激活剂：2.5%牛磺胆酸钠 、胆碱酯酶(cholinesterase) 特异性底物：丁酰硫代胆碱 抑制剂：四异丙基氨基焦酰胺(ISO-OMPA) 3、乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase) 底物：乙酰甲基硫代胆碱 乙酰硫代胆碱 乙酰基吲哚重氮盐 抑制剂：四异丙基氨基焦酰胺(ISO-OMPA) 酯酶的鉴别 、根据底物特异性 选择特异底物配制孵育液 、选择一定浓度的抑制剂或激活剂 通常使用抑制剂的方法是向底物液中 加抑制剂或将切片在抑制液中浸渍。 （一）显示法 A.偶氮色素法 、反应原理 在酶作用下，从底物游离出来的-萘酚AS与重氮 盐偶联形成偶氮色素，同时沉着于酶的存在部位，通 过偶氮色素显色，间接证明酶的存在部位。 -萘酚系统可用重氮盐坚牢蓝，坚牢蓝RR，坚 牢红RC盐。 萘酚AS系统用柘榴石（黄色）、GB盐、坚牢红RC 、坚牢红紫LC盐。 三、非特异性酯酶 2. 孵育液 （萘酚AS乙酸酯法 Pearse,1972） 1%萘酚AS醋酸盐（丙酮溶液）0.1ml (底物） 0.05mol/L PBS(pH 7.0) 10ml（缓冲液） 坚牢蓝B盐30mg（重氮盐） 搅拌过滤使用 3. 操作步骤 (1)新鲜组织恒冷箱切片； (2)入孵液，室温或37 20-30min； (3)流水冲洗2min； (4)2%甲基绿复染细胞核； (5)流水冲洗3-5min； (6)甘油明胶封固。 4. 结果与评价 酶活性部位为黑色，胞核为绿色。活性部位的染 色视重氮盐不同而异。坚牢红TR为紫红色，坚牢红RC 为暗红色，坚牢蓝RR为青铜色。 5. 组织处理说明 非特异性酯酶类对固定 的抵抗性较强，可用醛类固 定液固定后冰冻切片。10%福 尔马林钙、4%多聚甲醛磷 酸缓冲液或二甲胂酸盐缓冲 液，pH7.2-7.4; 4固定16- 18小时，时间随酶活性强弱 不同。 -醋酸萘酚酯 萘酚AS乙酸酯 坚牢蓝B盐 坚牢蓝BB盐 B.偶氮吲哚酚法 1. 反应原理 在非特异性酯酶作用下，醋酸吲哚酚酯被水解为 吲哚酚和醋酸，吲哚酚与六氮盐偶联成偶氮色素。 吲哚酚酯 吲哚酚羧酸 + 六氮盐 偶氮色素 2. 孵育液 醋酸吲哚酚 3mg 二甲基甲酰胺 0.3ml 六氮化副蔷薇苯胺缓冲液10ml （六氮化副蔷薇苯胺0.3ml溶于0.1mol/L PBS pH5-6,用1mol/L-0.1mol/L NaOH将pH调至5-5.5 ，混匀过滤立即使用。） 3. 操作步骤 (1)恒冷箱切片入孵液，3715-60min； (2)蒸馏水洗； (3)4%甲醛固定数小时； (4)甘油明胶封固。 4. 结果 酶活性处呈红棕色 腹水癌细胞中的酯酶 巨噬细胞中的酯酶 C.吲哚酚法(靛蓝法) Pearse, 1972 .原理 醋酸吲哚酚经酶水解释放出吲哚酚，再氧化形成靛 蓝沉着于酶所在部位。 底物:5-溴-6-氯吲哚酚乙酸酯,5-溴吲哚酚乙酸酯等. 氧化剂:铁氰化钾、亚铁氰化钾 .孵育液 (1)醋酸溴吲哚酚酯2mg (2)二甲基甲酰胺0.2ml (3)储备液10ml 储备液配制： 铁氰化钾(1.65%)5ml 亚铁氰化钾(2.11%)5ml 0.1mol/L Tris-HCL缓冲液pH6.820ml 2%CaCL210ml 蒸馏水10ml 3. 操作步骤 (1)新鲜组织恒冷箱切片； (2)切片入孵育液，37或室温 5-120min； (3)蒸馏水洗； (4)甘油明胶封固。 4. 结果 酶活性部位呈青绿色，背底无色。 .注意 铁氰化钾氧化吲哚酚除产生靛蓝外，还有无色产物。 因此酶活性与显色无平行关系，可定性不可定量。 肾间质细胞 油螺卵母细胞 底物：5-溴吲哚酚乙酸酯 主要定位于内质网和溶酶体，生理功能尚不清楚,目前认为 主要参与酯类和蛋白质代谢。 极强阳性：胰腺外分泌部腺细胞，横纹肌运动终板，小肠 上皮细胞； 强阳性：肝细胞，肾近曲小管上皮，结肠上皮细胞； 阳性：胰腺和腮腺导管上皮，食管上皮，肠腺上皮，肺泡 巨噬细胞，睾丸间质细胞。 弱阳性：心肌细胞，胰岛细胞，胆管、甲状腺、气管、支 气管、膀胱等上皮细胞。 （二）非特异性酯酶的生物学意义 特异性酯酶 脂酶乙酰胆碱酯酶胆碱酯酶 底物 高级脂肪 酸 乙酰胆碱，乙 酰-基甲基胆 碱 乙酰胆碱，苯甲 酰胆碱， 长链脂肪酸胆碱 抑制剂毒扁豆碱 异丙基氨基焦 酰胺(ISO- OMPA) 四异丙基氨基焦 酰胺 激活剂 2.5%牛磺 胆酸钠 广义的胆碱酯酶包括乙酰胆碱酯酶（AChE)和狭义的胆碱 酯酶(ChE)，两者化学性质不同，用酯来检测底物特异性时，乙 酰胆碱酯酶能最快地促使乙酰胆碱分解，也能水解乙酰-基甲 基胆碱，但不能水解苯甲酰胆碱，此酶能被高浓度的乙酰胆碱 抑制。但胆碱酯酶却不同，乙酰胆碱浓度越高，越能被胆碱酯 酶所分解。ChE还能水解苯甲酰胆碱，但不能水解乙酰-基甲 基胆碱。 乙酰胆碱+H2O 胆碱+醋酸 酯酰胆碱+H2O 胆碱+羧酸 AChE ChE 四、乙酰胆碱酯酶和胆碱酯酶 (Acetylcholinesterase and Cholinestrase, AChE and ChE) 乙酰胆碱酯酶胆碱酯酶 乙酰胆碱 （快） 高浓度时抑制其活 性 高浓度不抑制其活 性 乙酰-基 甲基胆碱 苯甲酰胆 碱 （快） 长链脂肪 酸胆碱 （快） AChE 和 ChE 的底物特异性 （一）显示方法亚铁氰化铜法 1、反应原理 利用乙酰胆碱酯酶能将乙酰胆碱盐水解产生硫 代胆碱，使铁氰化物还原为亚铁氰化物，再与铜离 子结合形成亚铁氰化铜显色沉淀，证明酶活性的存 在。 乙酰胆碱盐 AChE 硫代胆碱 若用四异丙基焦磷酰胺抑制胆碱酯酶，可单独显 示乙酰胆碱酯酶。 铁氰化钾亚铁氰化钾+Cu2+ 亚铁氰化铜 、孵育液 乙酰硫代胆碱碘盐5mg 0.1mol/L醋酸缓冲液pH5.56.5ml 0.1mol/L (2.94%) 柠檬酸钠0.5ml 30mmol/L (0.75%) CuSO41.0ml 5mmol/L (0.164%) 铁氰化钾1.0ml 蒸馏水1.0ml 乙酰胆碱碘盐完全溶解于醋酸缓冲液后，依次加 入其它溶液，临用前不超过30分钟内配制，充分混匀 ，至溶液呈亮绿色，最终pH5.5。 、操作步骤 (1) 新鲜组织恒冷箱切片； (2)冷丙酮或10%福尔马林固定20-25min； (3)蒸馏水洗； (4)入孵育液37，h； (5)蒸馏水洗； (6)甘油明胶封固。 、结果与评价 乙酰胆碱酯酶和胆碱酯酶活性部位显棕色沉淀。 Cu2+浓度太小易弥散，pH5-5.5，高于易扩散。 、对照 用四异丙基焦磷酰胺4mM(0.137%) 0.2ml抑制胆 碱酯酶显示乙酰胆碱酯酶； 用毒扁豆碱硫酸酯310-5M代替蒸馏水，先将切 片处理30分，水洗后入孵育液，则二种酶均被抑制呈 阴性。 (二）生物学意义 胆碱酯酶的活性中心是丝氨酸。乙酰胆碱酯酶 活性的强弱是神经细胞性质和功能的重要参考指标 ，亦是神经系统发生过程中的神经细胞分化的一个 指标，所以在形态上将乙酰胆碱酯酶的组织化学显 示作为胆碱能传递部位的标志。 AChE是生物神经传导中的一种关键性的酶，在 胆碱能突触间，该酶降解乙酰胆碱，终止神经递质 对突触后膜的兴奋作用，保证神经信号在生物体内 的正常传递。 AChE与细胞凋亡有一定的关系。在细胞水平发 现实验所用的各类细胞，正常状态没有AChE活性反 应，一旦发生凋亡，都有AChE活性反应。用其特异 的抑制剂可以抑制其活性反应。用RT-PCR方法证明 了凋亡细胞有AChEmRNA的转录。加入其抑制剂石杉 碱可降低凋亡基因的表达。 乙酰胆碱酯酶主要分布于神经系统（大脑皮质 中有AChE阳性的神经纤维，还存在于胆碱能神经元 中）、神经肌肉接头处、红细胞等，而胆碱酯酶主 要分布于血清、胰腺、唾液腺内。 五、胆碱乙酰转移酶 (choline acetyltransferase, ChAc) 此酶不属于羧酸酯水解酶，它是乙酰 胆碱的合成酶。胆碱乙酰转移酶的强弱是 胆碱能神经生理功能的标志，因此将ChAC 确认为胆碱能神经的标志酶。 （一）显示方法Burt法 1、反应原理 胆碱乙酰转移酶可把乙酰胆碱辅酶A的乙酰基转移 到胆碱分子上,合成乙酰胆碱。辅酶A被游离出来，辅 酶A中的SH被铅离子沉淀而显示酶的活性。 乙酰辅酶A+胆碱 乙酰胆碱+辅酶A Pb2+ 沉淀产物 PbS 硫化铵 ChAc 2、孵育液 25mmol/L N-2-羟基乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸缓冲 液（HEPES） pH6.0 4mmol/L 胆碱（48.5mg/100ml缓冲液） 0.2mmol/L 乙酰胆碱辅酶A（16.2mg/100ml缓冲液） 18mmol/L 硝酸铅（59.6mg/100ml缓冲液） 0.1mmol/L Phospholine iodide(乙酰胆碱酯酶抑 制剂）（3.8mg/100 ml缓冲液） 最终pH值为6.0。 3、操作步骤 （1）固定：8m厚的冰冻切片在10%蔗糖和2%戊 二醛的25mmol/LHEPES缓冲液（pH7.0）中固定 5min； （2）漂洗：用含10%蔗糖的HEPES缓冲液洗 15min3； （3）孵育：切片入孵育液中，室温，3h；（30， 15-30min）； （4）蒸馏水洗3次； （5）1%硫化铵显色2min； （6）缓冲液漂洗，甘油明胶封固。 4、结果：酶活性部位呈黑色沉淀。 5、对照： （1）孵育液中可除去辅酶A； （2）孵育液中去除胆碱，反应结果为阴性。 （二）生物学意义 ChAc是胆碱能神经元的标志酶，是乙酰胆碱的合 成酶，分布在胆碱能神经元和纤维内，其含量的多少 ，可说明神经兴奋性的高低，能充分反映神经的功能 。是了解胆碱能神经元及其所支配器官的重要指标。 AChE是乙酰胆碱的水解酶，其特性没有ChAc高，两酶 相结合作观察指标最为理想。 六、脂酶(Lipase) 脂酶又名甘油酯水解酶，能催化长链脂肪酸甘油酯或其它 醇酯水解。 激活剂：Ca2+、Sr2+、Mg2+、半胱氨酸、巯基乙酸、牛磺胆 酸盐。 （一）显示方法硫化铅法（吐温法之一，Gomori,1954) 、基本原理 以长链脂肪酸酯为底物，在脂酶作用下，分离出的脂肪酸 可与钙形成钙皂沉淀，再用铅置换钙，最后经硫化胺置换生成 棕黑色硫化铅沉淀。 吐温 脂酶 脂肪酸+Ca2+钙皂 铅置换钙 硫化胺 PbS 、孵育液 5%吐温60或80硬脂酸酯（油酸酯）2ml 0.2mol/L Tris缓冲液(pH7.2-7.4)5ml 10%氯化钙2ml 蒸馏水40ml 、操作步骤 (1)恒冷箱切片； (2)入孵育液，37,小时； (3)1%CaCL液内浸洗，使钙皂不溶； (4) 1%Pb(NO3)2浸15min，（置换）； (5)流水冲洗5分； (6)0.5-1%硫化胺液内min，（显色）； (7)水洗分； (8)甘油明胶封片。 、结果与评价 棕黑色硫化铅沉淀为脂酶活性所在部 位。本法需保持Ca2+浓度，才有利于在 Pb(NO3)2液内进行充分置换反应。孵化时间 过长，易弥散。 、对照 去出吐温60（底物）为阴性 （二）生物学意义 脂酶在体内主要催化甘油三酯水解，使之成为 二酰甘油和脂肪酸，甘油三酯必须在脂酶将它分 解成甘油和脂肪酸后，才能被肠道吸收。脂肪细 胞也需要脂酶水解脂肪，以保证脂肪的外运。 脂酶的定位和组织分布：脂酶主要存在于胞 质的基质，高尔基复合体和线粒体也可出现阳性 反应。胰腺最为丰富，其次是肝脏、肾脏、脾脏 、唾液腺导管（但大鼠极少）、胃贲门、睾丸基 质细胞中也存在。 Oxidase and Dehydrogenase 一、氧化还反应 1. 生物体内的氧化方式 (1) 脱电子反应：从底物上脱落一个电子。 Fe 2+ Fe 3+ + e (2) 脱氢反应：从底物上脱落一对氢原子。 MH2 M + 2H (2H+ + 2e) (3) 加氧反应：向底物中直接加入氧原子或氧分子。 催化上述反应的酶，称氧化还原酶。 受电子体、受氢体与供电子体、供氢体 氧化反应：分解代谢中失电子、脱氢、加氧。 还原反应：合成代谢中得电子、加氢、脱氧。 还原剂：供电子体Fe2+(亚铁离子）。 氧化剂：受电子体（或受氢体)Fe3+(高铁离子）。 根据受氢体的不同，氧化还原酶分为： 氧化酶：催化氢原子直接转移到氧分子上。 脱氢酶：催化氢原子转移到其它受氢体上，催 化氧化过程的中间环节。 常见的受氢体有： 辅酶（NAD+，nicotinamide adenine dinucleotide,尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸）； 辅酶（NADP+, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, 尼克酰胺腺嘌呤 二核苷酸磷酸）； 黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD, Flavin - adenine dinucleotide) 2. 电子传递链 营养物质在线粒体内经三羧酸循环、脂肪酸氧化 等不同氧化分解途径，脱氢氧化。脱下的氢大多由 NAD+、NADP+、FAD接受，NAD+、FAD是常见脱氢酶的 辅酶或辅基。这些脱氢酶是连接代谢途径和电子传 递链的环节。代谢物脱下一对氢，分别以NADH + H+ 或FADH2进入电子传递链，最终与氧结合生成水，并 释放能量。电子只能从电子亲和力低的传递体向亲 和力高的传递体传递。 二、细胞色素氧化酶(Cytochrome Oxidase, CCO) 细胞色素(Cytochrome, cyt)是生物细胞内一类传 递蛋白质，含有铁呋啉辅基，具有红色而取名细胞 色素。 电子传递链中有5种不同细胞色素：b、c、c1 、a、a3， b、c、c1的辅基都含铁原呋呤（血 红素），铁原子与呋呤环和蛋白质形成六个配位键 ，不能再与氧结合。 细胞色素是一种水溶性的膜表面蛋白，还原性 的细胞色素把它的电子传递给细胞色素氧化酶 Cytaa3，细胞色素a和a3结合紧密，一般分离方法不 能将它们分开，形成一个大分子寡聚体，通常称为 细胞色素aa3, Fe与呋呤环和蛋白质形成五个配位 键，还保留一个配位键和O2、CO和CN-（氰基）结合 ，是电子传递链中能与氧进行反应的复合物，能催 化分子氧接受电子而被还原，称细胞色素氧化酶或 细胞色素氧化酶。 细胞色素氧化酶使还原的细胞色素再氧化，是 线粒体的结构成分之一。 （一）显示方法 1、Nadi氧化酶反应（Naphthol-diamine, 萘酚二胺） （1）反应原理 O2 （2）孵育液 N-苯基-对苯二胺 （底物） 3mg 1-羟基-2-萘酚 3mg 二甲基亚砜 0.1ml 0.05mol/L磷酸缓冲液pH7.2 10ml 混匀，过滤。 （3）操作步骤： 1）新鲜组织，恒冷箱切片； 2）入孵育液中，室温，2030min； 3）入Lugol碘液2min；（稳定有色产物） 4）入5%硫代硫酸钠溶液4min；（脱碘） 5）入1%醋酸钴液中60min；（有色产物螯合） 6）D.W洗； 7）甘油明胶封固。 （4）结果： 酶活性部位呈棕黑色颗粒。 （5）对照：标本孵育于含氰化钾（0.0065g/10ml) 的孵育液中，呈阴性反应。 2. 二氨基联苯胺法（DAB法, diaminobenzidine） 1、原理 细胞色素氧化酶（CCO）能催化DAB，被H2O2 氧化，在新鲜或固定标本上生成棕色沉淀。 DAB盐酸盐溶于水后无色透明，但由于CCO的 作用，侧链氨基被氧化，进行反复氧化性聚合和 氧化性环化，形成不溶性褐色吩嗪(phenazine)聚 合体。 (2) 孵育液 蒸馏水 5ml 3,3-二氨基联苯胺-4盐酸盐 5mg 0.2mol/L磷酸缓冲液（pH7.4) 5ml 过氧化氢酶 c-100 1mg 或 c-40 4mg 细胞色素C III型 10mg 或 IV 5mg （3）操作步骤： 1）组织块浸泡固定：戊二醛固定液（3%戊 二醛，0.1mol/L PB pH7.4, 0.05%CaCl2，二甲砷 酸盐缓冲液），4，10min; 2）洗涤：冷固定液15min，3次； 3）恒冷箱切片； 4）孵育：37 ，40-60min，充分洗涤； 5）复染； 6）封片。 （4）结果 酶活性部位呈茶褐色沉淀，细胞内线粒体数 目多者酶活性强。 （5） 对照 孵育液内加1mM K-CN或10mM NaN3，反应完全 呈阴性。抑制剂为氰化物、迭氮化钠（NaN3）、 硫化氢（H2S）、一氧化碳，原因是这些物质均能 与细胞色素氧化酶的三价铁结合而抑制酶活性。 从反应液中去掉底物DAB不能成为对照，因为DAB 同时也是成色剂。 DAB将氧化型细胞色素还原，还原型细胞 色素又被细胞色素a再氧化，反复循环进行， DAB不断被氧化，反应氧化物沉淀沉积。 此法从反应特异性、重复性和电镜应用等 方面最好，用得最普遍。 DAB法是研究代谢旺盛细胞线粒体的有效手 段。 骨骼肌 DAB法显示CCO 肾皮质 肾髓质 （二）生物学意义 几乎所有组织细胞都呈阳性反应，其强度取 决于细胞内的线粒体数目，是线粒体的标志酶之 一。是研究代谢旺盛细胞线粒体的有效手段。心 肌、肾小管上皮、胃壁细胞、肝细胞活性均较高 ，恶性肿瘤和癌前期酶活性有增高趋势。 三、DOPA氧化酶(Catechol Oxidase) 也称儿茶酚氧化酶，酪氨酸酶。 1、反应原理 以DOPA(dihydroxyphenylalanine, 二羟苯基 丙氨酸）为底物，氧化后经一系列复杂反应生 成黑色产物。 2、 孵育液 5.6mmon/L二羟苯基丙氨酸，溶于0.1mol/L磷 酸缓冲液中，pH7.4。 3. 操作步骤 (1) 新鲜组织，厚5mm, 10%福尔马林室温固定1h; (2) 流水冲3分； (3) 入孵育液，371h; (4) 换孵育液，3712-15h; (5) 流水冲洗； (6) Bouin液固定24h; (7) 酒精脱水，透明，石蜡包埋； (8) 切片6-8微米，可复染； (9) 树胶封片。 4. 结果 酶活性部位呈黑棕色颗粒。 5. 对照 去底物或用氰化物 6. 生物学意义 对诊断恶性黑素瘤有意义。 四、单胺氧化酶(Monoamine Oxidase, MAO) 又称肾上腺素氧化酶，酪胺酶。 1、反应原理 MAO是催化芳香族、脂肪族单胺类氧化脱氨基的 酶，属黄素酶，以FAD为辅基。反应产物有醛和 H2O2。利用它们的还原性或氧化性进行组化染色。 反应产物有醛和H2O2，利用醛的还原性和H2O2的氧化性 进行组化染色。 (1) 醛还原作用 氧化 氧化还原 (2) H2O2的氧化作用 利用产生的H2O2经辣根过氧化物酶(HRP)催化，将 芳香胺氧化显色。 HRP 2. 孵育液四唑盐法 盐酸色胺（底物） 25mg 无水硫酸钠 4mg NBT（四唑盐） 4mg 0.1mol/LPBS(pH7.6)5ml 蒸馏水15ml 3. 操作步骤 (1)新鲜冰冻切片； (2)入孵育液，37 30-60min； (3)流水冲洗2min； (4)4%多聚甲醛固定24h; (5)洗涤，脱水，甘油明胶封片。 4. 结果 酶反应阳性部位见蓝色或紫色甲簪颗粒。 5. 对照 去色胺底物。 6. 生物学意义： (1)含生物活性胺组织：肾上腺髓质，APUD细胞 (2)参与毒性胺解毒组织：肝细胞、肾小