《酶学通论》PPT课件.ppt

第八章 酶学通论 酶酶, , enzymeenzyme 希腊语原意希腊语原意: : in yeastin yeast 生命体内催化化学反应的物质生命体内催化化学反应的物质 细胞中大部分球蛋白为酶细胞中大部分球蛋白为酶 1919世纪中叶对发酵本质的探讨：世纪中叶对发酵本质的探讨： 18571857年年 PasteurPasteur认为发酵分几个阶段进行认为发酵分几个阶段进行, , 每一每一 步都有特定的酶参与步都有特定的酶参与, , 但酶只在活体细胞中才能起但酶只在活体细胞中才能起 作用。发酵是酵母细胞活动的结果。作用。发酵是酵母细胞活动的结果。 18971897年年 BchnerBchner兄弟用酵母提取液实现发酵，证兄弟用酵母提取液实现发酵，证 明了酶可以离开细胞起作用。明了酶可以离开细胞起作用。 酶的名称酶的名称 18781878年年 KhneKhne提出提出enzymeenzyme一词：一词：“在酵母中在酵母中”。 18981898年年 DuclauxDuclaux提出用后缀提出用后缀“asease”表示酶。表示酶。 一、酶学研究史 酶促动力学酶促动力学 18941894年年 FisherFisher提出酶与底物作用的提出酶与底物作用的“锁钥锁钥”学说学说 19131913年年 MichaelisMichaelis 和和 MentonMenton米氏方程建立。米氏方程建立。 关于酶的化学本质的认识：关于酶的化学本质的认识： 18331833年年 PayenPayen 和和 PersozPersoz从麦芽的水抽提物中用从麦芽的水抽提物中用 酒精沉淀得到一种热不稳定物质酒精沉淀得到一种热不稳定物质, ,可使淀粉水解成可使淀粉水解成 可溶性糖。可溶性糖。 19261926年年 SumnerSumner首次从刀豆中得到脲酶结晶，并证首次从刀豆中得到脲酶结晶，并证 明其化学本质是蛋白质。明其化学本质是蛋白质。 19821982年年 Thomas R Thomas R CechCech从四膜虫发现从四膜虫发现rRNArRNA的自身的自身 催化作用，并提出了核酶（催化作用，并提出了核酶（ribozymeribozyme）的概念。）的概念。 限制性内切酶的发现限制性内切酶的发现 19701970年年 Restriction enzymeRestriction enzyme的发现的发现基因工程。基因工程。 酶学研究史 二、酶是生物催化剂 uu 酶是一种催化剂酶是一种催化剂 1.1.进行热力学上允许进行的反应；进行热力学上允许进行的反应； 2.2.缩短化学反应平衡到达的时间，而不改变反应缩短化学反应平衡到达的时间，而不改变反应 的平衡点；的平衡点； 3.3.用量少而催化效率高；用量少而催化效率高； 4.4.通过降低活化能加快化学反应速度。通过降低活化能加快化学反应速度。 例 2H2O2 2H2O + O2 反 应应活化能 非催化反应应75.24kJ/mol 钯钯催化反应应48.9kJ/mol H2O2酶催化8.36kJ/mol （1）高的催化效率 以摩尔为单位进行比较，酶的催化效率比化学催化 剂高1071013倍，比非催化反应高1081020倍。 例 2H2O22H2O+O2 1mole H2O2酶 能催化 5106mole H2O2的分解 1mole Fe3+ 只能催化610-4mole H2O2的分解 uu 酶是特殊的催化剂酶是特殊的催化剂 酶与一般催化剂催化效率的比较 底物 催化剂 反应温度 反应速度常数 尿素 H + 62 7.4 10-7 脲酶 21 5.0 106 过氧化氢 Fe 2+ 22 56 过氧化氢酶 22 3.5 107 通常要高出一般催化剂催化活性的通常要高出一般催化剂催化活性的1010 7 7 -10-1013 13倍。 倍。 转换数（turnover number,kcat）: 每秒钟或每分 钟，每个酶分子转换底物的分子数，或每秒钟或每 分钟每摩尔酶转换底物的摩尔数。 2.2.高度专一性高度专一性 3.3.可调控性可调控性 如酶浓度的调节、激素调节、反馈调节、 抑制剂和激活剂的调节、别构调节、酶的共 价修饰调节、酶原活化等。 4.4.反应条件温和 生物固氮： 工业氨合成： 5.酶的催化活力与辅酶、辅基和金属离子有关 N2+3H2 500 ,300大气压 Fe 2NH3 uu 酶是生物催化剂酶是生物催化剂 1.1.生物体产生的；化学本质是蛋白质（直接、间接生物体产生的；化学本质是蛋白质（直接、间接 证据）；证据）； 2.2.与生命活动密切相关。与生命活动密切相关。 6CO2+6H2O+能量 C6H12O6+6O2 植物 动物 N2 + 3H2 2NH3 某些微生物 三、酶的化学本质 1大多数酶是蛋白质 1926年美国Sumner脲酶的结晶，并指出酶是蛋白 质。1930年Northrop等得到了胃蛋白酶、胰蛋白 酶和胰凝乳蛋白酶的结晶，并进一步证明了酶是 蛋白质。 J.B.Sumner J.H.Northrop 20世纪80年代发现某些RNA有催化活性，还有 一些抗体也有催化活性，甚至有些DNA也有催化活 性，使酶是蛋白质的传统概念受到很大冲击。 酶的定义：生命体内具有催化化学反应活性 的蛋白质为酶。 酶为生命体内具有催化化学反应活性的生物 大分子。 四、酶的组成 1单纯蛋白质酶类 仅由氨基酸组成。 如脲酶、 胃蛋白酶等一般水解酶。 2缀合蛋白质酶类 蛋白质 + 非蛋白质部分 全酶 = 脱辅酶（酶蛋白）+辅助因子 （辅酶、辅基或金属离子） 辅酶（coenzyme） 辅基（prosthetic group） 全酶 (holoenzyme) | 酶蛋白（apoenzyme) + 辅助因子 （cofactor) cofactor 辅基， prosthetic group 辅酶，co-enzyme 金属离子 结合力强 酶的催化专一性主要决定于酶蛋白部分，辅助因子 通常是作为电子、原子或某些化学基团的传递体。 v单体酶（monomeric enzyme)：由一条肽链组 成，全部参与水解反应。 v寡聚酶 (oligomeric enzyme)：由几个或多个 亚基组成，亚基牢固地联在一起，单个亚基没 有催化活性。亚基之间以非共价键结合。大多 为代谢调控酶。 根据酶蛋白分子的特点将酶分成三类 v 多酶复合体 (multienzyme complex)： 几个酶嵌合而成的复合物。这些酶催化将底物转化 为产物的一系列顺序反应。如丙酮酸脱氢酶复合体 由丙酮酸脱氢酶（E）、硫辛酰转乙酰酶（E） 和二氢硫辛酰脱氢酶（E）组成。 五、酶的命名和分类 1961年国际酶学委员会（enzyme commission） 提出的酶的命名和分类方法。 每一个酶由下列三种表示： 1、系统名称：底物名+反应性质 2、分类编号：E.C.+四个数字 3、推荐名：选一个习惯名（实用、简单） （一）命名 1系统名称（systematic name） （1）标明底物和催化反应的性质 G-6-PF-6-P G-6-P异构酶 例: （2）两个底物参加反应时应同时列出，中间用 冒号（:）分开。如其中一个底物为水时，水可 略去。 例1： 丙氨酸+-酮戊二酸 谷氨酸+丙酮酸 丙氨酸:-酮戊二酸氨基转移酶 例2： 脂肪+H2O 脂酸+甘油 脂肪水解酶 2习惯名称（recommended name） （1）底物 （2）反应性质 （3）底物+反应性质 乳酸脱氢酶 （4）底物+来源或其它特点 （二）系统分类法及编号 1分类: 根据催化反应的性质分6大类酶 1.氧化还原酶类 oxidoreductase 2.转移酶类 transferase 3.水解酶类 hydrolase 4.裂合酶类 lyase 5.异构酶类 isomerase 6.连接酶类 ligase/synthetase 2编号: 用4个阿拉伯数字的编号表示，数字中用“” 隔开，前面冠以EC（为Enzyme Commission）。 EC 类.亚类.亚亚类.排号，如EC l.1.1.1 乳酸脱氢酶 EC 1. 1. 1. 27 第1大类，氧化还原酶 第1亚类，氧化基团CHOH 第1亚亚类，H受体为NAD+ 该酶在亚亚类中的流水编号 （三）六大类酶催化反应的性质 1氧化还原酶类（oxido-reductases） 主要是催化氢的转移或电子传递的氧化还原 反应。催化氧化还原反应的酶，包括氧化 酶类、脱氢酶类、过氧化氢酶、过氧化物 酶等。 （1）氧化酶类： 催化底物脱氢，并氧化生成H2O或H2O2 。 2A2H+O2 2A+2H2O A2H+O2 A+H2O2 例：邻苯二酚氧化酶 （EC 1.10.3.1，邻苯二酚：氧氧化酶） 邻苯二酚邻苯醌 （2）脱氢酶类：直接催化底物脱氢 A2H + B A + B2H 例：乳酸脱氢酶（EC 1.1.1.27） L-乳酸：NAD+氧化还原酶） 乳酸丙酮酸 2转移酶类（transferases） 催化基团的转移,分成8个亚类：转移碳基、酮 基或醛基、酰基、糖基、烃基、含氮基、含磷 基和含硫基的酶。 例：谷丙转氨酶（GPT）（EC 2.6.1.2） L-丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶） 3水解酶类（hydrolases） AB + H2O AOH + BH 催化加水分解作用。 4裂合酶类（lyases） 从底物非氧化非水解性地移去一个基团并形成双 键的反应或其逆反应。 AB A + B 例1： 例2： 5异构酶类（isomerase） 催化异构化反应 ,常见的有消旋和变旋、醛酮 异构、顺反异构和变位酶类。 例： 6连接酶类（ligases, 也称synthetases合成酶类） 将两个小分子合成一个大分子，通常需要ATP供能。 例： （连接酶） （异构） （裂合） （水解） 氧化还原酶氧化还原酶 转移酶转移酶 水解酶水解酶 裂合酶裂合酶 异构酶异构酶 连接酶连接酶 酶作用的 专一性 结构 专一性 立体异构 专一性 相对专一性 绝对专一性 六、酶专一性 specificity 键的专一性 基团专一性 1、绝对专一性（absolute specificity） 只能作用于某一底物。 例: （1）族专一性（基团专一性，group specificity） 2、相对专一性（relative specificity） 作用于一类化合物。 A B或A B 如-D-葡萄糖苷酶 （2）键专一性 作用一种化学键 A B 2、立体专一性（stereospecificity） 只能催化一种立体异构体进行反应。 （1）D-，L-立体异构专一性 L-乳酸脱氢酶：作用于L-乳酸 （2）几何异构专一性 延胡索酸酶：作用于反式的丁烯二酸 （3）酶能区分从有机化学观点来看是属于对称分子 中两个等同的基团，只催化其中的一个基团，而不 催化另一个。 例1： 若甘油激酶不能区分两个CH2OH基团，则会生成 : 和 例2： 关于酶作用专一性的几种假说 1、锁钥学说（lock and Key theory） 1894年 Fischer 提出:酶的活性中心结构与底 物的结构互相吻合，紧密结合成中间络合物。 2、三点附着学说 3、诱导契合学说（induced-fit theory） 1958年 Koshland 提出:酶活性中心的结构有 一定的柔性，当酶分子与底物酶分子接近时， 酶蛋白受底物分子诱导，构象发生了有利于与 底物结合的变化，使活性中心的有关基团正确 地排列和定向，酶和底物契合结合成中间络合 物，引起底物发生反应。 v酶活力（enzyme activity）是指酶催化某一化学 反应的能力。 七、酶的分离纯化和活力测定 产 物 浓 度 P (t) 测定酶活力时应注意几点 （1）应测反应初速度（initial velocity） 底物浓度变化在起始浓度5%以内。 （2）酶的反应速度一般用单位时间内产物的增 加量来表示。 （3）测酶活力时应使反应温度、pH、离子强度和 底物浓度等因素保持恒定。 （4）测定酶反应速度时，应使SE。 vv酶活力单位酶活力单位（ U ） ：在一定条件下，一定时间内 将一定量的底物转化为产物所需的酶量（U/g， U/ml） 。 v在最适的反应条件（25）下，每分钟内催化一 微摩尔底物转化为产物的酶量定为一个酶活力单 位，即 1IU=1mol/min v在最适条件下，每秒钟内使一摩尔底物转化为产 物所需的酶量定为1kat单位，即 1kat=1mol/s v酶的比活力比活力 （代表酶的纯度）：每mg蛋白质所 含的酶活力单位数。 酶的比活力或比活性（specific activity） 比活力：指每mg蛋白质所具有的酶活力，一般用 U/mg蛋白质来表示，比活力说明酶的纯度。 比活力= 酶活力（U/ml）/蛋白质浓度（mg/ml） 比活力有时也可用每g或每ml酶含多少个活力单 位来表示。 酶活力的测定方法 （1）分光光度法（spectrophotometry） 该法要求酶的底物和产物在紫外或可见光部分 光吸收不同。 优点：简便、迅速、准确；一个样品可多次测 定；可检测到10-9mol/L水平的变化。 例: 人血清乳酸脱氢酶活力的测定 L-乳酸 + NAD+ 丙酮酸 + NADH + H+ 乳酸脱氢酶 （2）荧光法（fluorometry） 该法要求酶反应的底物或产物有荧光变化。 主要的优点：灵敏度很高，可测10-12mol/L的样 品。 酶蛋白分子中的Tyr、Trp、Phe残基以及一些 辅酶、辅基，如NADH NADPH、FMN、FAD等都 能发出荧光。 例：乙醇 + NAD+ 乙醛 + NADH + H+ 乙醇脱氢酶 （3）酶偶联分析法(enzyme coupling assay) 第一个酶的产物为第二个酶的底物，这两 个酶系统在一起反应。 P1无光吸收或荧光变化，偶联后, P2有光吸 收或荧光变化。 例：测己糖激酶的活性 葡萄糖 + ATP 葡糖-6-磷酸 + ADP 己糖激酶 葡糖-6-磷酸 + NADP 葡糖酸-6-磷酸 + NADPH + H+ G-6-P脱氢酶 （4）电化学法（electrochemical method） 有离子选择性电极法、微电子电位法、电流法等。 离子选择性电极法要求在酶反应中必须伴随有离子 浓度的变化或气体的变化（如O2、CO2、NH3等）。 例: 葡萄糖氧化酶活性的测定 葡萄糖+O2+H2O 葡糖酸+H2O2 葡萄糖氧化酶 （5）同位素法 1选材 2破碎细胞 3抽提 4分离及纯化 5结晶 6保存 酶的分离纯化 酶的分离纯化 溶 解 度 的 差 异 盐析法 PEG沉淀法 有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法 热稳定性的差异热处理沉淀法 电荷性质的差异 离子交换层析法 电泳法 分子大小和 形状的差异 凝胶过滤法 超滤法 透析法 离心法 亲和力的差异 亲和层析法 疏水作用的差异 疏水层析法 分配系数的差异双水相系统萃取法 由于酶的特殊性，在提纯过程中要注意 : 1全部操作在低温04。 2在分离提纯过程中，不能剧烈搅拌。 3在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、 少量-巯基乙醇及蛋白酶抑制剂。 4在分离提纯过程中要不断测定酶活力和蛋白 质浓度，从而求得比活力，还要计算总活力和 回收率（得率）。 酶的纯度： 总活力总活力 = 活力单位数/ mL酶液总体积（ mL） 比活力比活力 = 活力单位数/ 毫克蛋白 纯化倍数纯化倍数 = 每次比活力 第一次比活力 产率产率% %（回收率）（回收率）= 100 每次总活力 第一次总活力 酶的纯化鉴定：聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦 电泳法、分子筛层析等。 酶的分离纯化过程中一定要随时追踪酶的活性 酶的保存 v低温（04，-20）；高浓度较稳定；加入 稳定剂；固定化。 v最后一步纯化过程得到的酶液，需经浓缩或结 晶以及其它处理，以便于保存。在合适的条件 下，酶一般可保存较长的时间。 在4下，可 将酶悬浮在浓硫酸铵或PEG溶液中保存，10 mg/ml 的浓酶液可加入25%50%甘油保存。 可将酶液过滤除菌，以减少微生物降解作用。 v冷冻干燥（04）保存，避免反复冻溶。 v1982 Thomas R Cech从四膜虫发现rRNA的自身催 化作用，并提出了核酶（ribozyme）的概念。 v核酶的种类 催化分子内反应（自我剪接和自我剪切） 催化分子间反应（L19RNA、RNaseP) v核酶的研究意义 v 七、核酶（ribozyme) 1982年美国T. Cech等人发现四膜虫的rRNA 前体能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加 工，发现某些RNA有催化活性。 Thomas Cech University of Colorado at Boulder, USA 1983年美国S.Altman等研究 E.coli RNaseP（ 由23%蛋白质和77%的RNA组成），发现RNaseP 中的RNA可催化E.coli tRNA的前体加工。 Sidney Altman Yale University New Haven, CT, USA v抗体：与抗原特异结合的免疫球蛋白。 v既是抗体又具有催化功能的蛋白质称为“抗体酶 (abzyme)”。因为它是具有催化活性的抗体；故 又称为“催化性抗体(catalytic antiboy)”。 v1986年 Bi