《酶的化学修饰》PPT课件.ppt

退出 Enzyme Engineering 酶工程 第五章 酶的化学修饰 第一节 概述 第二节 酶分子化学修饰的方法学 第三节 酶分子侧链基团的化学修饰 第四节 有机大分子对酶的修饰 第五节金属离子置换修饰及物理修饰 第六节 酶化学修饰的应用 第一节 概述 一、 概念 二、 进行化学修饰的原因 三、 化学修饰的基本原理 四、 修饰酶的特点 一、概念 n酶的化学修饰 利用各种修饰剂具有的化学基团，与酶分子 上某种氨基酸残基产生化学反应，使酶分子的结 构发生改变，从而改变酶的某些特性和功能的技 术 n修饰酶 在体外用一定的化学方法将酶和一些试剂进 行共价连接后而形成的酶 体外改造 二、 进行化学修饰的原因 q稳定性不够，不能适应大量生产的需要 q作用的最适条件不符，活性不高 q临床应用的特殊要求：可能具有抗原性 三、 化学修饰的基本原理 1、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 2、如何保护酶活性部位与抗抑制剂 3、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白 水解酶 4、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境 四、 修饰酶的特点 1、热稳定性增加 2、增加抗抑制剂、抗蛋白水解酶能力，体 内半衰期延长 3、消除了酶的抗原性 4、微环境稳定性增强，最适pH改变 5、酶学性质改变 第一节结束 概念 进行化学修 饰的原因 化学修饰的 基本原理 修饰酶的特 点 第一节结束 n点击返回 第二节 酶分子化学修饰的方法学 一、 修饰需考虑的问题 二、 选择酶分子修饰剂 三、 修饰反应的一般程序 四、 测定修饰程度和修饰部位 五、 酶的修饰方法 一、 修饰需考虑的问题 1、 酶性质的了解 (1) 酶活性部位情况 (2) 酶的稳定条件、酶反应最适条件 (3) 酶分子侧链基团的化学性质及反应 活 泼性等 一、 修饰需考虑的问题 2、 选择反应条件 (1) 反应体系中酶与修饰剂的分子比例 (2) 反应体系的溶剂性质，pH条件和离子强 度 (3) 反应温度及时间 (4) 其它 二、 选择酶分子修饰剂 n修饰剂须饰剂须 具备备的特性 1、 能选择性地与一个氨基酸残基反应 2、 反应在保证酶蛋白不变性的条件下进行 3、 被标记的残基在肽中稳定，容易通过降解分 离 出来并鉴定 4、 反应程度能用简单的技术测定 二、 选择酶分子修饰剂 n修饰剂饰剂 的选择选择 1、 修饰剂的相对分子质量、修饰剂链的长度对 蛋 白质的吸附性 2、 修饰剂上反应基团的数目及位置 3、 修饰剂上反应基团的活化方法与条件 三、 修饰反应的一般程序 修饰饰反应应 终终止 稀释释 阳离子交 换换 洗涤涤 过滤过滤 干燥 三、 修饰反应的一般程序 注意事项项 n修饰饰后需进行总的氨基酸分析 n各种酶分子，修饰后均需对每个氨基酸残基 进行确定 n注意缓冲液成分或修饰副产物对修饰部位和 修饰程度及对酶活性的影响 n修饰后酶性质的改变 四、 测定修饰程度和修饰部位 n修饰饰反应应的评评价因素 1、 有多少修饰剂已结合到酶分子上 2、 哪些氨基酸被修饰，修饰度是多少 3、 有多少种不同形式的修饰剂酶分子耦合物 ， 每种各有多少 4、 表面修饰、内部修饰 n测定方法 五、 酶的修饰方法 n侧链基团的化学修饰 n大分子结合修饰 n其他(金属离子置换修饰、物理修饰) 第二节结束 酶分子性质的了解 选择酶分子修饰剂 选择反应条件 修饰反应要注意的其它问题 修饰反应的一般程序 测定修饰程度和修饰部位 酶的修饰方法 第二节结束 n点击返回 第三节 酶分子侧链基团的化学修饰 一、 概述 二、 几种重要的修饰反应 三、 特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰 一、 概述 n侧链基团修饰 采用一定的方法(一般为化学法)使酶分子 的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性 和功能的修饰方法 n酶侧链基团 组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。 有氨基、羧基、巯基、咪唑基、吲哚基、酚羟 基、羟基、胍基、甲硫基等 一、 概述 n作用 研究各基团的作用及其对酶的结构、特性 和功能的影响(研究酶活性中心的必需基团) 改变酶分子性质，提高实用价值 测定某一基团在酶分子中的数量 获得新酶种 一、 概述 n类别 蛋白类酶 核酸类酶 侧链基团：磷酸基，核糖上的羟基，嘌呤、嘧 啶碱基上的氨基和羟基(酮基)等 二、 几种重要的修饰反应 q 酰化及其相关反应 q 烷基化反应 q 氧化还原反应 q 芳香环取代反应 酰化及其相关反应 烷基化反应 氧化和还原反应 芳香环取代反应 定量测定 三、 特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰 n巯基 n氨基 n羧基 n咪唑基 n胍基 n二硫键 1、 巯基的化学修饰 n巯基：许多酶活性中心的催化基团；形成二硫 键，稳定酶的结构 n巯基具有很强的亲核性，采用巯基修饰剂与酶 蛋白侧链上的巯基结合，使巯基发生改变，从 而改变酶的空间构象、特性和功能。提高酶的 稳定性 n常用：酰化基、烷基化剂、马来酰亚胺、二硫 苏 糖醇、巯基乙醇、硫代硫酸盐、硼氢化 钠 2、 氨基的化学修饰 n氨基的甲基化与乙酰化 赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酰胺的侧链氨基； 谷氨酰胺和天冬氨酸羧基的-OH上 甲基转移酶 n氨基的烷基化 脱氨基作用或与氨基共价结合，屏蔽酶分子侧链上 的氨基 修饰剂：亚硝酸、2,4-二硝基氟苯(DNFB)、丹磺 酰氯(DNS)、醋酸酐、琥珀酸酐、二硫化碳、乙亚胺甲 酯 3、羧基的化学修饰 n修饰剂与酶分子侧链的羧基进行酯化、酰基化 等反应 n修饰剂：碳化二亚胺、重氮基乙酸盐、乙醇-盐 酸试剂、异噁唑盐等 4、 咪唑基的化学修饰 n组氨酸。许多酶活性中心的必需基团 n修饰剂通过咪唑基氮原子的烷基化或碳原子的 亲核取代进行修饰 n修饰剂：碘乙酸、焦碳酸二乙酯 5、 胍基的化学修饰 n精氨酸。在结合带有阴离子底物的酶的活性部 位中起重要作用 n一些二羰基化合物在中性或弱碱性条件下与精 氨酸胍基生成稳定的杂环 n修饰剂：丁二酮、1,2-环己二酮、丙二醛、苯 乙二醛等 6、 二硫键的化学修饰 n同巯基基团类似 n还原方法与巯基修饰方法结合，阻止再氧化成 二硫键。可用于计算断裂的二硫键数目 n修饰剂：巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、二硫 赤藓糖醇(DTE)、过甲酸等 第三节结束 酰化及其相关反应 烷基化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应 巯基的化学修饰 氨基的化学修饰 羧基的化学修饰 咪唑基的化学修饰 胍基的化学修饰 二硫键的化学修饰 概述 几种重要的修饰反应 特定氨基酸残基侧链 基团的化学修饰 第三节结束 n点击返回 第四节 大分子结合修饰 一、 概念 二、 大分子结结合修饰饰的方法 三、 大分子结结合修饰饰的作用 一、 概念 q利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间 结构发生某些精细的改变，从而改变酶的 特性与功能的方法称为大分子结合修饰法 ，简称为大分子结合法 二、 大分子结结合修饰饰的方法 修饰剂的选择 修饰剂的活化 修饰 分离 1、修饰剂的选择 q水溶性大分子。如聚乙二醇(PEG)、右旋糖酐、 蔗糖聚合物、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基 纤维素、聚氨基酸等 qPEG: 110KD。溶解度高，无抗原性，无毒 性，生物相容性好 2、修饰剂的活化 q需活化才能与酶分子侧链基团进行反应 eg. 单甲氧基聚乙二醇(MPEG) (1) 聚乙二醇均三嗪衍生物 MPEG1, MPEG2。对天冬酰胺酶等的氨基进行修饰 (2) 聚乙二醇琥珀酰亚胺衍生物 SS-MPEG, SSA-MPEG, SC-MPEG。pH7-10条件下对 酶分子氨基进行修饰 (3) 聚乙二醇马来酸酐衍生物 PM。其中的马来酸酐通过酰胺键对酶分子上氨基进行修 饰 (4) 聚乙二醇胺类衍生物 对酶分子上的羰基进行修饰 3、修饰 q将活化大分子修饰剂与经分离纯化的酶液以一定比例混合 ，在一定温度、pH等条件下反应。使修饰剂活化基团与酶 分子侧链基团共价结合，进行修饰 4、分离 q通过凝胶层析等方法，将具有不同修饰程 度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰 效果的修饰酶 三、大分子结合修饰的作用 q提高酶活力 q增强酶的稳定性 q降低或消除抗原性 酶半衰期相对稳 定性 天然SOD6min1 右旋糖酐-SOD7h70 ficoll(低分子量) -SOD 14h140 ficoll(高分子量) -SOD 24h240 聚乙二醇-SOD35h350 天然SOD与修饰后SOD在人体血浆中 的半衰期 第四节结束 概念 大分子结合修饰的方法 大分子结合修饰的作用 修饰剂的选择 修饰剂的活化 修饰 分离 提高酶活力 增强酶的稳定性 降低或消除抗原性 第四节结束 n点击返回 第五节 金属离子置换修饰及物理修饰 一、 金属离子置换修饰 二、 物理修饰 一、 金属离子置换修饰 1、 概念 q把酶分子中的金属离子换成另一种金属离 子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方 法，称为金属离子置换修饰 一、 金属离子置换修饰 2、 方法 酶分离纯化 除去原有金属离子 加入置换离 子 加入金属螯合剂(EDTA)， 形成螯合物，透析、超滤、 分子筛层析等除去 一般都是二价金属离子。例如 Ca2+、Mg2+、Zn2+、Co2+、 Cu2+、Fe2+等 只适用于哪些在分子结构中 本来含有金属离子的酶 一、 金属离子置换修饰 3、 作用 q阐明金属离子对酶催化作用的影 响 q提高酶活力 q增强酶的稳定性 q改变酶的动力学特性 二、 物理修饰 1、 概念 q通过各种物理方法使酶分子的空间构象发 生某些改变，从而改变酶的某些特性和功 能的方法，称为酶分子的物理修饰 二、 物理修饰 2、 作用 q了解在不同物理条件下，由于酶分子空间构象的 改变而引起酶的特性和功能的变化情况 q探索极端环境中生物的生存可能性及其潜力 q提高酶的催化活性，增强酶的稳定性，改变酶的 催化动力学特性 二、 物理修饰 3、 特点 q不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价 键不发生改变。只是副键发生某些变化和重排 q可在某些变性剂作用下，首先破坏酶分子原有的 空间构象，然后在不同物理条件下，使酶分子重 新构建新的空间构象 第五节结束 金属离子置换修饰 物理修饰 概念 方法 作用 概念 作用 特点 第五节结束 n点击返回 第六节 酶化学修饰的应用 一、 在酶学研究方面的应用 二、 在医药方面的应用 三、 在工业方面的应用 四、 在有机介质酶催化反应中的应用 v 化学修饰方法的局限性 一、 在酶学研究方面的应用 q 酶的活性中心研究 q 酶的空间结构研究 采用具有荧光特性的修饰剂，可借助荧光光谱研 究，分析各基团在酶分子中的空间分布情况 采用巯基修饰剂，可了解酶分子中半胱氨酸的数 目及分布情况，确定肽链的数目和二硫键的数目 q 酶的作用机制研究 了解各种残基及侧链基团在酶催化过程中的作用 常用的修饰方法有亲和标记法、差异标记法、氨 基酸(核酸)置换法等 二、 在医药方面的应用 q 降低或者消除酶的抗原性 q 增强医药用酶的稳定性(半衰期延长) q 改变组织分布 酶经化学修饰后，能在血液中被靶器官选择 性地吸收 三、 在工业方面的应用 q 提高工业用酶的活力 q 增强工业用酶的稳定性 q 改变酶的动力学特征 四、 在有机介质酶催化反应中的应用 q经侧链基团修饰，酶分子能溶解于有机溶剂， 均匀分布于溶剂中，提高酶的催化效率和稳定 性 eg. 用MPEG对脂肪酶、过氧