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质谱分析法联用仪器及应用 一、概述 generalization 质谱：纯物质结构分析 色谱：化合物分离 色谱-质谱联用：共同优点 GC-MS；LC-MS；CZE-MS （毛细管电泳-质谱） 困难点： 载气(或流动液)的分离； 出峰时间监测； 仪器小型化； 关键点：接口技术(分子分离器) Date1 质谱分析法联用仪器及应用 二、GC-MS联用仪器 hyphenated technology of GC-MS Sample Sample 5890 1.0 DEG/MI N HEWLETT PACKARD HEWLETT PACKARD 5972A Mass Selective Detector D C B A A B C D Gas Chromatograph (GC)Mass Spectrometer SeparationIdentification B A C D A D B C MS Date2 质谱分析法联用仪器及应用 GC-MS中的分子分离器 分子分离器类型： 微孔玻璃式、半透膜式和喷射式三种。 喷射式分子分离器： 由一对同轴收缩型喷嘴构成，喷嘴被封在一真空室中，如 图所示。可做成多级。 Date3 质谱分析法联用仪器及应用 四极杆质量分析器 （Quadrupole Mass Filter） + Electron Beam A B C Sample in Ion Beam Date4 质谱分析法联用仪器及应用 仪器结构 色谱-四极杆质谱仪结构示意图 Date5 质谱分析法联用仪器及应用 四极杆质量分离器 Date6 质谱分析法联用仪器及应用 仪器与结构 Date7 质谱分析法联用仪器及应用 飞行时间质量分析器 Date8 质谱分析法联用仪器及应用 三、LC-MS联用仪器 hyphenated technology of LC-MS 1. 大气压电离技术（API） （1）电喷雾电离（ API Electrospray） Rayleigh Limit Reached + + + + + + + + + + - - - - - + + + + + + + + + + - - - - - + + + + +- + + + + +- Evaporation + + Charged Droplets 试样离子 准分子离子 Analyte Ions Solvent Ion Clusters Salts/Ion pairs Neutrals + + + + + + +- 其他离子 Date9 质谱分析法联用仪器及应用 Electrospray， API 电喷雾电离 流出液在高电场下形成带电喷雾，在电场力作用下穿过气帘； 气帘的作用：雾化；蒸发溶剂；阻止中性溶剂分子 Date10 质谱分析法联用仪器及应用 Electrospray， API 电喷雾电离 电喷雾产生多电荷离子， 相对分子质量Mr计算： 选相邻峰，电荷n， n +1 m1=(Mr + n)/2 m2=(Mr + n+1)/ (n+1) 计算结果如 表。 不适用于非 极性化合物 Date11 质谱分析法联用仪器及应用 （2）大气压化学电离（ APCI ） 热喷雾(100-120C)， 化学电离; 适用于热稳定化合物分析 Date12 质谱分析法联用仪器及应用 大气压化学电离（ APCI ） Dielectric capillary High wattage heater HPLC inlet Corona discharge needle Vaporizer Nebulizer gas + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Date13 质谱分析法联用仪器及应用 2.离子阱质量分析器 特定m/z离子在阱内一 定轨道上稳定旋转，改变 端电极电压，不同m/z离子 飞出阱到达检测器； Date14 质谱分析法联用仪器及应用 3. LC-MS (离子阱)联用仪器结构示意图 Date15 质谱分析法联用仪器及应用 4. LC-MS (四极杆)联用仪器结构示意图 Date16 质谱分析法联用仪器及应用 十、联用技术 a). LC/ESI-MS 1). HPLC/ESI-MS Date17 质谱分析法联用仪器及应用 b). FPLC/HPLC/ESI-MS Date18 质谱分析法联用仪器及应用 c). 浓缩装置与ESI-MS联用 Date19 质谱分析法联用仪器及应用 d). 流速与检测器的性质 Date20 质谱分析法联用仪器及应用 e). 注意事项 采用挥发性缓冲液，如醋酸铵、甲酸铵、醋酸、三氟 乙酸(TFA)、七氟丁酸(HFBA)等代替硼酸盐、磷酸盐 和硫酸盐等； pH值应保持相同； 应采用挥发性的离子对试剂。但应注意更换离子对试 剂后保留时间的变化； LC用的有机溶剂应与离子化方式一致。反相LC用的 极性溶剂与ESI相匹配；正相LC用的非极性溶剂与 APCI相匹配； Date21 质谱分析法联用仪器及应用 2). CE/ESI-MS a). 示意图 Date22 质谱分析法联用仪器及应用 b). Sheath liquid pH 的影响 Date23 质谱分析法联用仪器及应用 c). 注意事项 Sheath liquid的成份通常为甲醇、甲氧基甲醇、 乙腈并含1020%甲酸、乙酸或水； Sheath liquid流速及pH大小。流速一般为25 L/min； 缓冲液应为挥发性溶剂，如：乙酸、乙酸铵、碳酸铵 和甲酸。缓冲液的纯度应较高，以减少背景噪音。 降低待测成分的流速，以提高灵敏度。 注意毛细管内径对灵敏度的影响。20m i.d. Date24 质谱分析法联用仪器及应用 十一、样品的制备 超滤。采用不同截止分子量的滤膜过滤。 溶剂提取。将待测成分自水相提取至有机相是常用的 方法之一。这种方法的优点是应用广泛；溶剂、pH、 离子对试剂等均可选择，以利提取；可浓集待测成分 。缺点是耗时，有时回收率较低。 固相提取。主要是使用C18、C8、C4萃取小柱。具体 方法可参考公司说明书。 色谱柱纯化。 Date25 质谱分析法联用仪器及应用 串联质谱技术(MSn) 1). 碰撞诱导解离(collisional-induced dissociation, CID)技术 在离子阱(ion trap)、triple stage quadrupole、FTICR、磁质谱仪及混合的 串联质谱仪上可实现CID反应。 a). 由母离子寻找子离子 (parent ions to daughter ions) Date26 质谱分析法联用仪器及应用 b). 由子离子寻找母离子(daughter ions to parent ions) Date27 质谱分析法联用仪器及应用 c). 中性丢失(neutral loss) Date28 质谱分析法联用仪器及应用 ). CID技术在肽测序方面的应用 含有 N terminal 碎片离子称为：a, b or c；含有C terminal的碎片离子称为： x, y or z. De novo 蛋白质测序 Date29 质谱分析法联用仪器及应用 肽CID碎裂反应中出现的重排离子 Date30 质谱分析法联用仪器及应用 Residue 3-letter code 1-letter code Immonium ion* Related ions* AlanineAlaA44 ArginineArgR12959,70,73,87,100,112 AsparagineAsnN8770 Aspartic acidAspD8870 CysteineCysC76 Glutamic acidGluE102 GlutamineGlnQ10156,84,129 GlycineGlyG30 HistidineHisH11082,121,123,138,166 IsoleucineIleI8644,72 LeucineLeuL8644,72 LysineLysK10170,84,112,129 MethionineMetM10461 PhenylalaninePheF12091 ProlineProP70 SerineSerS60 ThreonineThrT74 TryptophanTrpW15977,117,130,132,170,171 TyrosineTyrY13691,107 ValineValV7241,55,69 Date31 质谱分析法联用仪器及应用 Formulae to Calculate Fragment Ion Masses N is the mass of N- terminal group, C is the mass of C- terminal group, M is mass of the sum of the neutral amino acid residue masses Ion TypeIon Mass aN+M-CO a*a-NH3 aa-H2O a+(a+H)/2 bN+M b*b-NH3 bb-H2O b+(b+H)/2 cN+M+NH3 da-partial side chain vy-complete side chain wz-partial side chain xC+M+CO yC+M+H2 y*y-NH3 yy-H2O y+(y+H)/2 zC+M-NH Date32 质谱分析法联用仪器及应用 低能(Low Energy) CID特点: a) 反应发生在四极杆分析器和离子阱分析器； b) 质谱图中出现 N terminal 碎片离子：a, b or c 和有C terminal的碎片离 子： x, y or z. 但主要是形成 a, b 和 y系列离子。 c) 在碎裂过程中易丢失中性小分子NH3 和H2O， 分别形成 a*,b* 和 y* 和 ao,bo 和yo。 高能(high Energy) CID特点: a) 反应发生在磁质谱分析器和飞行时间分析器； b) 质谱图中出现 N terminal 碎片离子：a, b or c 和有C terminal的碎片离 子： x, y or z. 但主要是形成 a, b 和 y系列离子。 Post Source Decay特点： 质谱图类似高能CID谱。 3). CID分类 Date33 质谱分析法联用仪器及应用 4) 电子捕获碎 裂(Electron capture dissociation, ECD)反应在肽 测序方面的应用 亮氨酸 异亮氨酸 Date34 质谱分析法联用仪器及应用 八 、 ESI 质 谱 图 的 解 释 1). 蛋白质分子量的测定正离子质谱 ESI mass spectrum M + nHn+ n n +1 Mr: 平均分子量 Deconvoluted Mass Spectrum Date35 质谱分析法联用仪器及应用 ). 核苷酸分子量的测定负离子质谱 Date36 质谱分析法联用仪器及应用 ). 混合肽的质量测定 purification C18, C8 and C4 Metal coated Tip dimmer: 2-8 m Nanospray capillaryElution volume 500-1000 nL 去除小分子化合物 Date37 质谱分析法联用仪器及应用 Date38 质谱分析法联用仪器及应用 影响ESI因素： a) 样品的pKa 和溶液的pH。样品在电喷雾溶液中是否已预先形成离子取决于样 品的pKa值。在低Ph值条件下有利于样品分子质子化，提高pH导致灵敏度和 分子所带电荷的数目减少。在正离子检测中，溶液pH应较低，可用醋酸、三氟 乙酸(TFA)调节。溶液pH通常至少低于样品的pKa 2个单位。在负离子检测中 ，溶液pH应较高，可用氨水调节，使溶液pH比样品pKa高2个单位。 b) 溶剂的性质。溶剂应具有较低的汽化点，有较低的黏度和表面张力。常用的 ESI溶剂有醇类、乙腈、丙酮、水等。常用混合溶剂及添加剂，如甲酸、乙酸 、氨及挥发性缓冲液。 c) 去溶剂时干燥气体的温度和流速。应保持较高的温度及流速以利于去溶剂。但 也应注意过高的温度可能导致样品分解。 d) 不能使用不挥发的无机盐缓冲液作为ESI的溶剂 Date39 质谱分析法联用仪器及应用 九、基质辅助激光解吸电离技术的应用 MALDI-ToF MS Date40 质谱分析法联用仪器及应用 Basic components of a linear (upper panel) and reflecting (lower panel TOF mass spectrometer. Date41 质谱分析法联用仪器及应用 1). 常用的 MALDI matrices at 337 nm(N2). Matrix Application 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) 2,5-二羟羟基苯甲酸 Peptides, proteins, lipids, and oligosaccarides 3,5-Dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid (sinapinic acid) 3,5-二甲氧基羟羟基肉硅酸(反式) Peptides, proteins, and glycoproteins a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) 腈腈基羟羟基肉硅酸 Peptides, proteins, lipids, and oligonucleotides Date42 质谱分析法联用仪器及应用 2). MALDI -TOF-MS可容忍下列物质的最高浓度 Urea 0.5M Guanidine-HCl 0.5M Dithiothreitol (DTT)0.5M Glycerol 1% Alkali metal salts 0.5M Tris buffer 0.05M NH4HCO3 0.05M Phosphate buffer 0.01M Detergents (not SDS) 0.1% SDS 0.01% Date43 质谱分析法联用仪器及应用 MALDI-TOF spectra of bovine insulin 3). 蛋白质分子量的测定 M + Na, K Li Date44 质谱分析法联用仪器及应用 MALDI peptide Map 4). 肽分子量的测定 Date45 质谱分析法联用仪器及应用 5). 肽序列的测定 a). CID测序，方法与ESI相同. Date46 质谱分析法联用仪器及应用 PSD mass spectrum of substance P in CHCA employing RE-TOF-MS. 15 kV accelerating potential, 50 laser pulses averaged for each reflector voltage segment. b). PSD测序 Date47 质谱分析法联用仪器及应用 Ladder sequencing of the adrenocorticotropic hormone (ACTH) fragment 18-39 utilizing the CPY dilution technique and MALDI linear DE-TOF-MS. 25 kV accelerating potential, 150 ns pulse delay, 1.30 kV pulse, 50 laser pulses averaged for each spectrum. carboxypeptidase Y (CPY) 羧酸酶 The sequence of the peptide from the C- terminus can be read directly from the mass sp