人教版教学课件福建省16次年会报告课件《基因工程和细胞工程.ppt

2010年省生物教学学会年会报告 基因工程和细胞工程 福建师范大学生命科学学院 肖义军 生物材料 DNA mRNA 一定大小范围DNAPCR cDNA（互补DNA） 反转录 基因组文库 cDNA文库 基因文库 包括 人工合成 限制酶切割 获取目的基因 构建表达载体 导入受体细胞 得到转基因生物 目的基因检测与鉴定 第一步 第二步 第三步 第四步 基因工程的基本操作程序 获取目的基因 生物材料 PCR cDNA mRNA DNA 基因组文库 cDNA文库 一定大小范围DNA 人工合成 逆转录 限制酶切割 获取目的基因 构建表达载体 导入受体细胞 得到转基因生物 目的基因检测与鉴定 第一步第一步 第二步第二步 第三步第三步 第四步第四步 基因文库(gene library)概念 u又称DNA文库，是指某个生物的基因组DNA 或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转 化宿主细胞，通过筛选后得到大量的阳性菌 落(或噬菌体)，所有菌落或噬菌体的集合即为 该生物的基因文库。 u基因文库由外源DNA片段、载体和宿主细胞 组成。 基因组文库(Genomic library) n将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内 切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA 片段，再与合适的载体在体外重组并转化相 应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。该文库 以DNA片段的形式贮存着该生物全部基因组 的信息，可用于分离目的基因和保存某种生 物的全部基因。 基因组文库 cDNA文库 (cDNA library) n提取某生物组织或发育时期的总mRNA，经反转 录产生的cDNA (complementary DNA，互补 DNA)片段分别与克隆载体重组，储存于受体菌 中，该群体就称该生物基因组的cDNA文库。 结构基因 外显子 内含子 转录、加工修饰 mRNA cDNAcDNA文库文库 反转录酶 cDNA 克克隆、转化、培养、鉴定隆、转化、培养、鉴定 构建基因文库的基本程序 1)提取研究对象基因组DNA，制备合适大小的DNA片段 ，或提取组织或器官的mRNA并反转录成cDNA； 2) DNA片段或cDNA片段与经特殊处理的载体连接形成 重组DNA； 3)重组DNA转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌； 4)阳性重组菌落或噬菌斑的筛选。 基因组DNA文库 cDNA文库 基因组文库的类型 根据所选用的载体可以分为： 质粒文库、噬菌体文库、人工染色体文库（细 菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库）。 n高等生物的基因组DNA十分复杂,单个基因在基因 组或某个特定发育阶段或特定组织中所占比例很 小。因此，要想从庞大的基因组中分离某个特定 的未知基因非常困难，因此先把材料DNA分成 若干易于处理的片段，然后确定目标序列在哪一 片段，再进一步从该片段寻找目标序列，事情就 变得容易了。 为什么要建 基因文库？ 从基因文库中筛选目的基因 1.通过克隆序列筛选：核酸杂交和PCR 2.通过表达产物筛选：免疫学检测（抗原抗体反 应） 探针 n探针是一小段带标记的单链DNA或者RNA 片段（大约是20到500bp）， 用于检测与其 互补的核酸序列。 n最初是使用带放射性的DNA探针，通过放射自显 影来显示位置。后来又发明了免疫探针法，将探 针核苷酸的侧链加以改造，探针杂交后，其侧链 可被带有荧光标记的抗体所识别，从而显示出位 置。 核酸杂交（菌落原位杂交法） n直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上, 经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤 膜原位结合,再与特异性DNA探针杂交,筛选 出含有目的序列的菌落。 对应的菌斑或噬菌斑位置不变， 可以直接找出阳性菌落。 特点： 免疫筛选法（一） 放射性抗体检测法 滤膜（固定抗体） + 免疫沉淀检测法 菌落 沉淀素 免疫筛选法（二） PCR法获取目的基因 已知基因： n设计合成一对引物，直接从基因组DNA中扩增该 目的基因。 未知基因： n参照其他物种中该基因的两末端设计引物，从基 因组DNA（或文库）中扩增该目的基因； n依照其他物种中该基因的保守区段序列设计引物 ，扩增出一段DNA，标记为探针，从基因组文库 、cDNA文库中钓出该基因。 nPCR法获取目的基因的前提是：要有足够制备 合适引物的信息 PCR法获取目的基因优点 n1.简便快速：在有足够引物信息的情况下，可直 接从基因组DNA中克隆目的基因，大大减少了 基因分离的工作量； n2.灵敏度高：可从极微量的模板扩增出目的片段 ； n3.对起始材料质量要求低：由于其灵敏度高和特 异性强，极微量的材料或者混合的组织、部分已 降解的DNA材料都可以作为起始材料； 化学合成制备目的基因 n 如果蛋白分子较小，可根据氨基酸序列推导出其基因 序列，采用人工合成的方法制备目的基因。化学合成法通 常主要用于制备探针和引物。 n磷酸二酯法 n亚磷酸三酯法 获取目的基因的方法 n一般来说： n 目的基因的获得通常采用PCR法；化学 合成法由于合成的片段较短，一般用于引 物和探针的合成；基因文库一般用于保存 基因资源。 目的基因检测与鉴定 n通常采用分子杂交的方法。 n分子杂交：采用已知标记的核酸分子或蛋白质分 子检测混合样品中未知核酸分子或蛋白质分子。 n根据其检测对象的不同可分为 Southern 杂交（ DNA）、Northern 杂交（RNA）和 Western 杂交 （蛋白质）。 分子杂交的方法 通常是采用各种方法将核酸（蛋白质 ）分子固定在固相支持物上，然后用放射 性元素等标记的探针（抗体）与被固定的 分子杂交，经显影（显色）后显示出目的 核酸（蛋白质）分子。 Southern杂交(检测目的基因是否插 入到受体细胞基因组中） n(1)提取 DNA，酶切，凝胶电泳分离各酶切片段，然后 使DNA原位变性。 n(2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼 龙膜)上。 n(3) 预杂交滤膜，掩盖滤膜上非特异性位点。 n(4) 让探针与同源DNA片段杂交，然后漂洗除去非特异 性结合的探针。 n(5) 通过显影检查目的DNA所在的位置。 放射自显影 DNA印迹转移 探针杂交 提取分离受体细胞的提取分离受体细胞的mRNA,mRNA,将将mRNAmRNA分子分子 从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他 化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的 一种实验方法。一种实验方法。 Northern杂交(检测目的基因是 否转录出了mRNA） Northern杂交的过程 提取总RNA 分离mRNA：利用亲和层析的原理纯化mRNA。 制备目标RNA的探针：根据mRNA序列合成同源DNA 探针，或以cDNA为探针。 Northern杂交：通过显影检查目的DNA所在的位置 。 Southern杂交和Northern杂交过程示意图 Western杂交 （检测目的基因是否翻译成蛋白质） n中文一般称为蛋白质印迹技术。其基本原理 是通过特异性抗体对凝胶电泳分离的细胞或 生物组织蛋白样品进行检测。 nWestern Blot与Southern杂交或Northern杂交方 法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺 凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗 体，“显色”用标记的二抗。 Western杂交过程 n经过SDS-PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（ 例如硝酸纤维素膜）上； n以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体 起免疫反应； n再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色 或放射自显影以检测电泳分离的目的蛋白。 n 根据检测结果，从而可得知被检细胞内目的蛋白表达 与否、表达量及分子量等情况。 Western杂交结果图 常见载体容量 载体质粒 噬菌体 黏粒细菌人工 染色体（ BAC） 酵母人工 染色体（ YAC） 容量 （kb) 1023453501000 （二）细胞工程 动物细胞融合与单克隆抗体 细胞融合（cell fusion)，又称体细胞杂 交，是指两个或更多个相同或不同细胞通 过膜融合，形成单个细胞的过程。 细胞融合的常用方法 一、灭活病毒法： 二、聚乙二醇（PEG）法： 三、电融合法： 一、灭活病毒法 1. 两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近； 2. 通过病毒与细胞膜的作用使两个细胞膜互相渗透，胞质 互相渗透； 3. 两个细胞的细胞核互相融合，两个细胞融为一体； 4. 进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂 种细胞。 二、聚乙二醇（PEG）法 nPEG分子式：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，通常选用 平均相对分子质量为10004000、浓度在30%50%的 PEG进行动物细胞的诱导融合。 nPEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基 团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在在 质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连 进而促使质膜的融合. PEG诱导融合的特点：其优点是融合成本低， 不需特殊设备；融合子异核率较高；融合过程不 受物种限制。其缺点是操作过程繁琐，PEG可能 对细胞有毒害。 三、电融合法 细胞首先在交流电场中极化并沿电力线排列成串，形成细胞间 的紧密接触；然后在高强度的直流电脉冲作用下，相互连接的细胞 质膜被击穿而导致细胞融合。 电融合法的优点： u融合率高，重复性强，对细胞伤害小； u装置精巧，方法简单，可在显微镜下观察或录像观察融合过程； u免去PEG诱导后的洗涤过程，诱导过程可控性强。 融合细胞的筛选 n 细胞融合后，会形成由未融合的亲本 细胞、同核体以及异核体组成的细胞混合 群体。可根据不同细胞生理生化特性的差 异，设计具体的筛选方案和选择体系，优 先选择杂交细胞或只允许杂交细胞生长， 以淘汰亲本细胞。最常用方法是应用合适 的选择培养基，使亲本细胞死亡，而仅让 杂交细胞存活下来。 u基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选 u基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选 u由温度敏感型细胞组成的杂种细胞的筛选 u具有所需性状杂种细胞的筛选 常用的杂种细胞筛选方法 杂交瘤技术与单克隆抗体 抗体 由抗原刺激B淋巴细胞产生的，并能与 刺激其产生的抗原发生特异性结合的、具 有免疫功能的糖蛋白。 抗体结构 n 抗体是具有4条多肽链的对称结构，其中2 条较长、相对分子量较大的相同的重链(H链)； 2条较短、相对分子量较小的相同的轻链(L链)。 链间由二硫键和非共价键联结形成一个由4条多 肽链构成的单体分子。整个抗体分子可分为恒 定区和可变区两部分。 抗体的结构图 “Y”型，四肽链 重链 （5种: 、 、） 轻链 （2种: 、） 可变区 （V区） 超变区 骨架区 恒定区 （C区） 铰链区 抗体结构 n 在给定的物种中，不同抗体分子的恒 定区都具有相同的或几乎相同的氨基酸序 列。可变区位于“Y”的两臂末端。在可变区 内有一小部分氨基酸残基变化特别强烈， 这些区域称高变区。高变区的氨基酸序列 决定了该抗体结合抗原的特异性。一个抗 体分子上的两个抗原结合部位是相同的， 位于两臂末端，称抗原结合片段(antigen- binding fragment, Fab)。 抗体多样性的遗传学基础 n抗体的L链是由C、V、J三个基因簇编码的 ，H链由C、V、D、J四个基因簇编码的。V 编码可变区，有300个种类；D编码高变区, 有15 20个种类；J编码连接V、C的结合 区，有45个种类；C编码恒定区，仅有一 种。这些外显子通过多种多样的随机组合 重排所合成出的肽链，还要再进一步进行L 和H链的随机组合，这样最后生成的抗体种 类就非常多了。 抗原决定簇 n抗原分子中存在的能与抗体Fab片段特异性 结合的特殊化学基团，是免疫应答特异性 的物质基础。 单克隆抗体 定义：由单一克隆B细胞杂交瘤产生的、只 识别抗原分子某一特定抗原决定簇的高度 特异性的抗体。每种单克隆抗体其分子结 构完全相同。 多克隆抗体 定义：抗原分子通常具有多个抗原决定簇，动 物免疫后可刺激多种具有相应抗原受体的B细 胞发生免疫应答，因而可产生多种针对不同抗 原决定簇的抗体。这些由不同B细胞克隆产生 的抗体称为多克隆抗体（polycolonal antibody, PcAb）。 单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞与经特定 抗原免疫刺激的B淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞，杂 交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖， 又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单 克隆抗体技术又称为杂交瘤技术。 致敏B淋巴细胞的准备 n用目的抗原免疫小鼠时，应选用纯系、健 康的8周龄BALBc小白鼠作为免疫动物， 这样可以获得大量激活的淋巴细胞。 n一般将各种病毒、细菌和癌细胞作为目的 抗原接种动物制作抗原，其方法是将目的 抗原进行腹腔或皮下注射，一般要进行初 次免疫、二次免疫和加强免疫。加强免疫 后45天，取脾脏分离B淋巴细胞备用。 骨髓瘤细胞选择 n骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体 n选择次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷 型（HGPRT-）或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型 （TK-）瘤细胞 细胞内DNA的合成途径 n从头合成途径：以氨基酸和其他小分子起 始合成核苷酸，进而合成DNA 的过程；可被 叶酸类似物氨基蝶呤（A）阻断； n旁路合成途径：胸腺嘧啶脱氧核苷激酶（ TK）利用胸腺嘧啶核苷（T）合成DNA；次 黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）利用次黄 嘌呤（H）合成DNA。 n在旁路合成途径中，HGPRT负责催化磷酸 核糖焦磷酸和嘌呤基形成嘌呤单磷酸核苷 酸，而TK可催化胸苷转化为5-单磷酸胸苷 ，作为胸苷脱氧核苷酸合成的材料。 HAT选择培养基 n含次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺 嘧啶核苷（T）的培养基，是动物杂交细胞 筛选中最常用的方法。在这种培养基中细 胞只能利用旁路途径合成DNA，因而只有 具有HGPRT+或/和TK+的细胞才能生长。 在HAT选择培养基中 骨髓瘤瘤细胞（HGPRT-或TK-）及其同核体：不能 增殖，死亡； B淋巴细胞及其同核体：体外培养条件下增殖次数 有限， 死亡； 杂交瘤细胞： 存活 阳性细胞的筛选 n将融合细胞充分稀释，进行克隆培养；然 后再通过酶联免疫吸附测定( ELISA) ，筛选 出能够分泌较高水平抗体的融合细胞，即 阳性细胞，再进行克隆化培养。 杂交瘤细胞的克隆培养 n有限稀释法：将稀释到一定密度的杂交瘤 细胞接种到96孔培养板中，尽可能使每个孔 中只有一个细胞生长； n软琼脂培养法 ：软琼脂的半固态性质，使 单个的杂交瘤细胞在相对固定的位置上增 殖形成细胞克隆。 n 一般情况下，杂交瘤细胞的染色体处 于不稳定状态，因此当细胞分裂时，染色 体分配不平衡，易造成杂交瘤细胞在分裂 增殖过程中失去抗体分泌能力，所以克隆 化培养35次后，才能获得稳定基因型和稳 定分泌特异性抗体的细胞。 单克隆抗体的大量制备 n体内法：将稳定的单克隆细胞注入到小鼠腹 腔培养，然后从腹水中分离、提取单克隆抗 体。 n细胞培养：体外克隆培养，再从培养液中回 收产生的抗体。 单克隆抗体的纯化 n通过上述培养之后获得的培养液或腹水， 其中除了单克隆抗体之外，还有无关的蛋 白质等其他物质，因此必须对产品做分离 纯化。目前，常用的方法有硫酸铵沉淀法 、盐析法、离子交换、凝胶过滤或亲和层 析等等。一般是综合采用几种方法分步进 行