《转录后加工》PPT课件.ppt

3.4 原核与真核生物 mRNA特征比较 3.4.1 原核生物mRNA特征 1、半衰期短； 2、许多mRNA以多顺反子的形式存在； 多顺反子-指一条mRNA可以编码多条蛋白 质肽链。一般是一组相邻或相互重叠基因的转录 产物构成一个操纵子。 3、 mRNA的5/端无帽子结构，3/段没有多聚A 的尾巴结构或只有较短多聚A的尾巴。 4、5/端的AUG上游有712核苷酸的保守区- -SD序列。 作用:是与核糖体30S小亚基内的16SrRNA的3/端序列互补 ，是起始的tRNA正确的定位于mRNA的5/端结构的起始密码 子上 原核mRNA 的SD序列 n 3.4.2 真核生物mRNA特征 1、半衰期相对较长； 2、许多mRNA以单顺反子的形式存在 ； 3、 mRNA的5/端存在帽子结构； 4、绝大多数mRNA 3/段有多聚A的尾 巴结构。 （1）帽子的结构 （2 2）帽子的功能）帽子的功能 、有助于mRNA穿过核孔进入 细胞质； 、保护5不被酶降解； 、有助于在翻译时起始因子IF 和核糖体识别。 （3 3）帽子的类型及加帽位点）帽子的类型及加帽位点 在末端鸟苷的第7位上存在单个甲基 化位点的称0号帽子（cap0）； 在次末端核苷酸的核糖上的2-0位点 上还有一个甲基位点的称1号帽子 (cap 1)； 在第三个核苷酸的核糖上（2-0）有 甲基化位点的称2号帽子（cap2）。 帽帽 子子 的的 类类 型型 （4 4）加）加帽帽生化过程生化过程 剪切前加帽 如呼肠病毒， 牛豆病毒 剪切后加帽 如疱疹病毒和口炎病毒 加尾加尾 （1）加尾作用和时间 n多聚A是 m RNA由细胞核进入细 胞质所必需的形式。 n多聚A是转录后加上去的。 （2 2） 加加尾尾过程过程 特殊组分(CPSF)识别AAUAAA并指导其它的活性 剪切因子(CF)在加尾位点 AAUAAA下游11 30nt ( 核苷酸)处剪切RNA； 末端腺苷转移酶poly(A)聚合酶合成poly(A)尾巴； 结合蛋白（PBP）与poly(A)结合，反应停止。 加加尾生化反应尾生化反应 第一步加一个短的寡聚A 序列（10nt），此反 应依赖于AAUAAA序 列（加尾信号）； 此反应由poly（A ）聚合酶在特殊因子 指导下完成的。 第二步是寡聚A尾巴延伸 到240nt的长度。 此反应并不需要 AAUAAA序列，但需 要一个识别寡聚A并 指导poly（A）聚合 酶延伸的刺激因子。 3.5 RNA合成的延伸 终止和抗终止 RNA合成 的延伸 3.5.1 延伸速度快慢和转录暂停 1、延伸速度 n延伸速度快慢与DNA模板含G、C的区 域有关； n在富含G、C区慢或暂停。 2、转录暂停 当RNA聚合酶转录过程遇到特殊序列 ，转录速度变慢为0.1b/s或0称为暂 停； 这段序列称为暂停信号. 3.5.2 RNA合成的终止 1、一旦RNA聚合酶启动了基因转录，它就会沿着模板 53方向不停地移动合成RNA链，直到遇到终止信号 时才释放新生的RNA链，并与模板DNA脱离。 2、模板DNA上都有终止转录的特殊信号-终止子，每个基 因或操纵子都有一个启动子，一个终止子。 3、在新生RNA中出现发卡式结构会导致RNA聚合酶的暂 停，破坏RNA-DNA杂合链5端的正常结构。寡聚U的 存在使杂合链的3端部分出现不稳定的rUdA区域。 原核转录的终止 以大肠杆菌为例（体外实验） 1、终止子（terminator,t） n 弱终止子需要因子（rho factor） 又称为依赖因子终止子 n 强终止子内在终止子（intrinsic terminators） 又称为不依赖因子终止子 n依赖于因子的终止 因子是一个相对分子质量为2.0105的六聚 体蛋白。它能水解各种核苷三磷酸，实际上是一 种NTP酶。由于催化了NTP的水解，因子能促使 新生的RNA链从三元转录复合物中解离出来，从 而终止转录。 作用：因子即附着在新生的RNA链上，靠 ATP水解产生的能量，沿着53方向朝RNA聚 合酶移动，到达RNA的3-OH端后取代了暂停在 终止位点上的RNA聚合酶，并从模板和酶上释放 RNA，完成转录过程。终止过程需要消耗能量， 所以，因子具有终止转录和核苷三磷酸酶两种功 能。 b、不依赖于 因子的终止 若终止点上游存在一个富含GC碱基的二 重对称区，由这段DNA转录产生的RNA容 易形成发卡式结构；在终止点前面有一段由 4-8个A组成的序列，导致转录产物的3端 为寡聚U。这两种结构特征的存在同样决定 了转录的终止。 在新生RNA中出现发卡式结构会导致 RNA聚合酶的暂停，破坏RNA-DNA杂合链 5端的正常结构。寡聚U的存在使杂合链的 3端部分出现不稳定的rUdA区域。 强终止子的结构 nNNAAGCGCCGNNNCCGGCGCTTTTTTNNN nNNTTCGCGGCNNNGGCCGCGAAAAAANNN DNA nNNAAGCGCCGNNNCCGGCGCUUUUUUNNN RNA 强终止子的结构特点 n (1) 有回文结构存在； n（2）茎的区域富内含G-C； n (3) 强终止子3端上有6个U； n N n N N n n N N n G C n C G n C G n G C n C G n G C n C U n NNNNC U UUUU-OH 3 n 强终止子结构的模式图 3.5.3 抗终止 n主要有两种方式： n1、破坏终止位点RNA的茎环结构； n 例如：色氨酸操纵子结构基因前的一 段序列-衰减子 n2、依赖于蛋白质因子的转录抗终止； n例如：噬菌体中的N基因-N蛋白具有 抗终止作用 3.6 内含子的剪接、编辑 及化学修饰 转录后RNA的加工成熟 RNA加工成熟主要包括： 5加帽子结构；3加多聚A；切除内含子 。 3.6.1 RNA中的内含子 n三类转录产物加工的重要内容-切除内含子 n内含子概念和功能：被受关注，功能不清 n内含子剪切信号-GU-AG法则 n既内含子的5/边界序列为GU，3/边界序列 为AG又称chambon法则。 剪切位点交界顺序 RNA内含子的3种剪接方式 n第一类：自我剪接内含子（型、型） n第二类：蛋白质（酶）参与剪接内含子 n第三类：snRNP参与剪接内含子 三类内含子的分布 I型内含子的剪接 Cech等1981年用四膜虫分离得到了35S的前体 rRNA，它含有一个长413bp的内含子。 此35S rRNA要加入一价或二价阳离子及GTP 就可以在体外释放出413b的线性的内含子 ， 若继续保温，那么线形内含子又可形成环状 的RNA。这就意味着35S RNA在GTP的作 用下可以自我剪接。 （一）I型内含子的结构特点 1. 其边界序列为5U-G 3； 2. 具有中部核心结构（Central core strucature） 3.内部引导顺序（internal guide seguence IGS） (二) I型内含子的剪切机制 n转酯反应(transesterification) 酯键从一个位置转移到另一个位置。 （三）I型内含子与核酶 1、核酶（Ribozyme）提出 1981年T.Cech和S.Atman等在研究四膜虫 rRNA时发现的； T.Cech由核糖核酸（ribonucleic acid）和酶 （enzyme）这两个词“重组”成一个新的词 ： 核酶 -是指本质为RNA或以RNA为主含有 蛋白质辅基的一类具有催化功能的物质。 2、核酶和传统酶的区别： n(1)一般的酶是纯的蛋白质；而核 酶是RNA或带有蛋白的RNA； n(2)核酶既是催化剂又是底物；而 酶仅催化反应。 3、核酶发现的意义 n（1）突破了酶的概念. 是一种自体催化 ； n（2）揭示了内含子自我剪接的奥秘；促 进了RNA的研究。 n（3）为生命的起源和分子进化提供了新 的依据。 型内含子的剪接 (一)结构特点 (1) 边界序列为 5GUGCGYnAG； (2) 有6个茎环结构； 有分支点顺序。 (二)剪接机制 n无需鸟苷的辅助，但需镁离子的存在。 n分枝点A的2-OH对5端交界处的磷酸二 酯键发动亲核进攻，产生了套索（lariat ）结构； n切下的外显子1其3-OH继续对内含子3 端的交界序列进行亲核进攻，同时释放 出套索状的内含子。 I类与类内含子的剪接比较 蛋白质（酶）剪接的内含子蛋白质（酶）剪接的内含子 -tRNAtRNA前体的前体的剪切反应剪切反应 1、真核tRNA的基因的特点： (1)真核的前体分子tRNA是单顺反子，但成 簇排列，基因间有间隔区； (2)真核tRNA基因一般都比原核tRNA基因多 得多，如酵母约有400个tRNA基因； (3) 5端单磷酸核苷酸，表明已被加工过； (4) tRNA的前体分子中含有内含子。 2、真核tRNA内含子切除的特点 (1)没有交界序列，也没有内部引导序列 ； (2)剪切反应信号是二级结构，而不是 一级结构； (3)是依赖于蛋白质性的RNase，而不是 核 糖拟酶或snRNP； (4)反应的本质不是转酯反应。 3、 真核tRNA的加工和原核的区别 (1)真核tRNA前体中无二聚体和多聚体； (2)增加了剪接内含子的过程； (3)都要加CCA。 4、tRNA内含子切除过程 3.6.2 真核mRNA前体内含子的 剪接反应 (一) 结构特点： 1. 边界顺序:符合GU-AG法则。 2. 分枝点顺序：为Py80NPy87Pu75APy95其中A 为百分之百的保守，且具有2-OH。 3.内含子5端有一保守序列可以和U1 snRNA 的5端的保守顺序互补 内含子剪接位点及保守序列 （二）参与剪接的加工因子 n剪接体 ：由snRNA和蛋白质因子组成 n核小分子RNA（snRNA）至少有： n U1 ：5/剪切点结合 n U2 ： n U4 /U5 ： n U6： n 蛋白质因子：有20余种 n n (三)剪接机制 剪接因 子 snRNPs U1,U2,U 5和 U4/U6。 mRNAmRNA前体的前体的 剪接过程剪接过程 第一步：第一步：转酯反应。转酯反应。5 5 / / 剪剪 接点磷酸基转移到分支点接点磷酸基转移到分支点 A A 的的2 2 / / -OH -OH上，形成上，形成2 2 / / ， 5 5/ / - -转酯化合物（套索转酯化合物（套索RNARNA 结构）结构） 第二步：第二步：剪接反应。剪接反应。 5 5 / / 外显子、外显子、3 3 / / 外显子共价连外显子共价连 接，形成成熟接，形成成熟mRNA mRNA 和和套套 索状内含子索状内含子 3.6.3 RNA的编辑和化学修饰 1、RNA编辑的发现 n编辑（editing）是指转录后的RNA在编码区 发生碱基的加入、丢失或转换等现象。 n1986年R.Benne在研究锥虫线粒体mRNA转 录加工时发现m RNA的多个编码位置上加 入或丢失尿苷酸；1990年在高等动物和病毒 中也发现了编辑现象。 线虫coxII 基因的编辑 2、 RNA编辑的方式 n（1）单碱基突变 n（2）U的缺失和添加 3、编辑的可能机制 n1990年L.Simpsom等发现指导RNA（guide gRNA）。 4、RNA编辑的生物学意义 (1)校正作用； n(2)调控翻译； n(3)扩充遗传信息。 5. 碱基的化学修饰 方式： 1、甲基化 2、去氨基化 3、硫化 4、同分异构化 5、二价健的饱和化 6、核苷酸替代 3.6.4 核酶 n1、核酶概念 n2、核酶结构类型 n3、核酶催化功能 3.6.5 RNA在生物进化中的地位 n1、RNA比相应DNA序列含有更多信息； n2、R