硕士毕业论文-广谱高效微生物防腐剂产生菌的筛选及应用.docx

学校代码10463 密 级 硕 士 学 位 论 文广谱高效微生物防腐剂产生菌的筛选及应用作者姓名 指导教师 教授 副教授学科门类 理 学学科专业 微生物学培养单位 生物工程学院完成时间 二一三年五月Screening of Broad-spectrum Biocontrol Substance Producing Strain and Application A Dissertation Submitted for the Degree of MasterCandidate：Supervisor：Prof. Associate Prof. College of BioengineeringHenan University of Technology, Zhengzhou, ChinaIII摘 要微生物导致食品的腐败变质不仅会造成巨大经济损失，还会引起严重的食品安全问题。而现有的食品防腐保鲜方法在实际生产应用中具有一定的局限性，迫切需要寻求更安全有效的防腐保鲜新技术，将微生物及其代谢产物应用于食品防腐保鲜的生物防治方法是现阶段研究的热点。从轮马热泉、北海温泉、大塘热泉等腾冲温泉附近采集土壤样品23种，采用稀释分离法分离纯化得到细菌菌株142株。以大肠杆菌、黑曲霉、禾谷镰刀菌等为指示菌，采用滤纸片法或平板对峙法从142株细菌菌株中初步筛选得到具有广谱抑菌效果的菌株7株，其中菌株 LM2303广谱抑菌效果最好。通过形态特征分析、生理生化特性分析和16S rDNA序列比对，菌株LM2303应为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。采用紫外线诱变、硫酸二乙酯诱变和微波诱变对菌株LM2303进行选育。其中，经硫酸二乙酯诱变处理得到突变菌株D59，其抑菌效果较原始菌株提高了11.4%。以抑菌物质产量为指标，从8种基础培养基中筛选出菌株D59最佳发酵培养基M2。采用单因素实验和响应面分析对菌株D59进行发酵条件优化。单因素试验结果表明培养时间、温度和转速对菌株D59抑菌物质产量有显著影响(p0.05)。利用响应面确定菌株D59的最佳培养条件为：接种量5%、装液量100mL/250mL、培养时间43h、温度33、转速177rpm。在上述发酵条件下培养，100mL发酵液可得到抑菌物质粗提物2.8560 g(湿重)，是原发酵条件下的1.4倍，有效提高了抑菌物质产量。采用盐酸沉淀、甲醇萃取，从拮抗菌株发酵液中得到抑菌物质粗提物。利用薄层色谱对抑菌物质进行分析和初步纯化，紫外及茚三酮显色结果表明抑菌物质含有苯环和闭合肽键。红外光谱扫描结果表明菌株LM2303抑菌物质为环状脂肽类物质。该脂肽类物质理化性质稳定，抑菌谱广，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等细菌和黑曲霉、黄曲霉、扩展青霉、禾谷镰刀菌等真菌均有较强的抑制作用。从不同腐烂病症的冬枣上分离得到根菌索菌、细极链格孢、橄榄色盾壳霉、扩展青霉四种致腐真菌。平板对峙试验结果表明菌株LM2303可有效抑制上述四种真菌的生长，菌株LM2303具有冬枣贮藏期致腐真菌的生物防控应用潜力。关键词：枯草芽孢杆菌；拮抗；抑菌物质；诱变选育；发酵条件优化ABSTRACTFood spoilage caused by pathogenic microorganisms not only results in great financial losses, but also serious food safety problems. And existing food antisepsis method in practical application has certain limitations, to explore an obvious safe and effective anticorrosion technology is particularly important. Microorganisms and their metabolites work for food conservation is a research focus of biological control at the present stage.142 strains of bacteria were isolated from 23 soil samples which collected form Tengchong hot spring, such as Lun-ma hot spring, Bei-hai hot spring, Da-tang hot spring and so on. Filtering paper method and dual culture technique were employed to test antagonistic effect of bacteria strains, and seven of them showed efficient inhibitory, strain LM2303 has the most obvious inhibitory effect. Strain LM2303 was identified as Bacillus subtilis through the analyses of morphological and biochemical properties and 16S rDNA sequencing.Bacillus subtilis LM2303 was used as the start strain and the mutation breeding was carried out through UV light, DES and microwave radiation. Inhibition ratio of strain D59 isolated following DES mutagenesis enhance 11.4%. The production of biocontrol bubstance was taken as indexes, M2 medium was used for fermentation screened from 8 different medium. The factors and its levels influencing the production of biocontrol bubstance produced by strain D59, was determined by using single-factor test, and the optimization of fermentation conditions was approached by RSM. The optimum fermentation conditions were as follows: temperature was 32.6, inoculation was 5%, medium volume was 100mL/250mL, rotary speed was 176.9 rpm and fermentation time was 43.02 h. Under the new fermentation condition, 2.8560 g biocontrol bubstance can be obtained from 100 mL fermentation broth and is the 1.4 times of original fermentation conditions. Biocontrol bubstance were obtained with hydrochloric acid precipitate and methanol extraction method from fermentation broth, and purified by thin layer chromatography. Purified biocontrol bubstance was detected by FT-IR. The results showed that the biocontrol bubstance contained lipopeptides. Biocontrol bubstance produced by strain LM2303 has stable physical and chemical properties and wide antibacterial spectrum, exhibit strong inhibitory effect on a number of bacteria and multiple pathogenic fungi.Four putrefying fungi were isolated from the decayed tissues of Winter Jujube and identified as Rhizomorpha Roth.ex Fr, Alternaria tenuissima, Coniothyrium olivaceum and Penicillium expansum. Strain LM2303s prominent inhibition on four putrefying fungi lay the foundation for putrefying fungi biocontrol of Winter Jujube.Key words: Bacillus subtilis; antagonistic action; biocontrol bubstance; mutation breeding; optimization of fermentation conditionsIII目 录第一章 前言11.1 研究背景11.2 生防微生物概况21.2.1 用于生物防治的微生物种类21.2.2 生防微生物的作用机制21.3 生防芽孢杆菌41.4 芽孢杆菌抑菌物质研究概况41.5 本研究的目的和意义6第二章 广谱拮抗菌株的筛选及其鉴定82.1 材料82.1.1 样品82.1.2 试剂92.1.3 仪器102.1.4 培养基102.1.5 供试有害微生物112.2 方法112.2.1 微生物培养112.2.2 细菌菌株分离纯化112.2.3 菌悬液制备112.2.4 拮抗菌株初筛122.2.5 拮抗菌株无细胞培养滤液制备122.2.6 拮抗菌株的复筛122.2.7 拮抗菌株形态特征观察132.2.8 拮抗菌株生理生化特性分析132.2.9 拮抗菌株16S rDNA序列分析132.3 结果与分析142.3.1 细菌菌株的分离纯化142.3.2 拮抗菌株初筛152.3.3 拮抗菌株复筛152.3.4 拮抗菌株LM2303鉴定结果172.4 结论与讨论19第三章 菌株LM2303诱变选育213.1 材料213.1.1 微生物菌株213.1.2 试剂213.1.3 培养基213.1.4 仪器设备223.2 方法223.2.1 菌悬液制备223.2.2 紫外线诱变223.2.3 硫酸二乙酯(DES)诱变223.2.4 微波诱变233.2.5 正突变株筛选233.2.6 突变株遗传稳定性243.3 结果与分析243.3.1 紫外线(UV)诱变243.3.2 硫酸二乙酯(DES)诱变253.3.3 微波诱变263.3.4 突变菌株的遗传稳定性273.4 结论与讨论27第四章 拮抗菌株发酵条件优化294.1 材料294.1.1 微生物菌株294.1.2 试剂294.1.3 仪器304.1.4 培养基304.2 方法314.2.1 种子液制备314.2.2 生物量测定314.2.3 抑菌物质粗提物制备314.2.4 基础发酵培养基筛选314.2.5 菌株D59生长曲线测定324.2.6 单因素试验324.2.7 响应面优化334.3 结果与分析334.3.1 菌株D59生长曲线334.3.2 基础发酵培养基筛选结果334.3.3 单因素试验结果344.3.4 响应面优化364.4 结论与讨论38第五章 菌株LM2303抑菌作用研究405.1 材料405.1.1 微生物菌株405.1.2 试剂405.1.3 仪器415.1.4 培养基415.2 方法425.2.1 菌悬液制备425.2.2 菌株LM2303对有害微生物生长的影响425.2.3 抑菌物质粗提物制备425.2.4 抑菌物质抑菌谱测定435.2.5 真菌孢子悬液制备435.2.6 抑菌物质对真菌孢子萌发的影响435.2.7 抑菌物质对真菌菌丝形态的影响435.2.8 抑菌物质稳定性研究445.2.9 抑菌物质分离纯化及定性研究445.3 结果与分析465.3.1 菌株LM2303对有害微生物的抑制作用465.3.2 菌株LM2303抑菌物质抑菌谱475.3.3 对真菌菌丝形态的影响485.3.4 对真菌孢子萌发的抑制作用495.3.5 抑菌物质的稳定性研究结果505.3.6 抑菌物质分离纯化及鉴定515.4 结论与讨论54第六章 生防菌株在冬枣贮藏中的应用556.1 材料556.1.1 菌株556.1.2 培养基556.1.3 试剂566.1.4 仪器566.2 方法566.2.1 冬枣贮藏期致腐真菌的分离566.2.2 回接验证试验576.2.3 冬枣致腐真菌的种属鉴定576.2.4 冬枣致腐真菌拮抗菌株的筛选576.3 结果与分析576.3.1 冬枣致腐真菌的分离鉴定576.3.2 冬枣致腐真菌拮抗菌株的筛选结果596.4 结论与讨论60第七章 结 论61参考文献62致 谢69作者简介70广谱高效微生物防腐剂产生菌的筛选及应用1广谱高效微生物防腐剂产生菌的筛选及应用第一章 前言1.1 研究背景在食品工业中，粮食、果蔬及加工类食品的防腐保鲜始终是一个亟待解决的重要问题，据FDA统计，全世界每年约有 10% 20% 的食物损失于各种腐败，其中微生物侵染是导致食物腐败变质的主要因素。各类食物的腐败变质不仅会导致其丧失营养和食用价值，造成巨大的经济损失，而且由于许多微生物在生长繁殖过程中产生的有毒次级代谢产物，还会引起食品安全问题，严重危害人类健康(石立三等, 2008)。据WHO统计，全世界每年数以亿计的食源性疾病患者中， 70%是由病原微生物污染的食物引起的。因此，防止微生物侵染是食品工业面临重大问题，也是保证食品安全的首要任务。目前，用于各类食品防腐保鲜的方法主要有物理和化学的方法。(1)物理方法：主要是采用热处理、气调、辐照及低温贮藏等方法来防止食品腐败变质，其中热处理和紫外线辐照处理的方法在葡萄、梨、苹果、西红柿等多种果蔬的防腐保鲜应用中取得较好效果(赵明慧等, 2011)。但低温贮藏、辐照处理等物理方法均需要特定的专业设备，难以大面积的普及推广应用(吕劳富和何勇, 2003)。(2)化学方法：主要是运用化学合成药剂来控制病原微生物的侵染，化学方法具有效价高、效果稳定、作用机理明确等显著优点，但长期的研究表明，化学合成药剂对人体不同程度存在一定的毒性，其中一些具有诱癌性和致畸性，在超标使用的情况下甚至会引起食物中毒，而且化学合成药剂长期大量使用会导致病原微生物产生抗性和造成环境污染(刘钟栋, 2005)。由于物理和化学方法在实际生产应用中存在一定局限性，迫切需要寻求更安全有效的防腐保鲜新技术。近年来越来越多的人把目光投向天然防腐剂的开发利用，天然来源的防腐剂分为动植物源和微生物源防腐剂，相对于动植物来源的防腐剂，微生物因为具有生长繁殖快、生长条件简单、易于培养等特点而成为天然防腐剂的重要来源。利用微生物菌株及其代谢产物进行生物防治的研究开发已引起国内外学者的广泛关注，它主要是利用微生物及其代谢产物来抑制病原微生物的生长繁殖从而达到防腐保鲜的目的，生物防治方法是现阶段各类食品防腐保鲜研究的热点 (贾士儒, 2009)。目前，世界上公认的、采用微生物发酵法生产并已经投入使用的安全生物防腐剂有：乳酸链球菌素(Nisin)、纳他霉素(Natamycin)和-聚赖氨酸(-polylysine)。1.2生防微生物概况1.2.1 用于生物防治的微生物种类利用微生物进行各类食品的防腐保鲜就是选取不会对食品造成危害的微生物来抑制病原微生物的生长繁殖，从而达到防止食品腐败变质或降低食品腐败变质程度的目的，目前研究较多的生防微生物主要有芽孢杆菌(Sharma et al, 2009)、乳酸菌(Jiang et al, 2012)、放线菌(Subramaniam et al, 2011)、酵母菌(Droby et al, 2002)及霉菌(Ippolito A et al, 2000)等，如表1-1所示。表1-1 用于生物防治的微生物微生物种类微生物菌株芽孢杆菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)乳酸菌双歧杆菌(Bifidobacterium)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、乳酸链球菌(Lactic streptococci)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)放线菌白色链霉菌(Streptomyces albus)、球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)、褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)、纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis)、恰塔努加链霉菌(Streptomyces chattanoogensis)酵母菌酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、假丝酵母(Candida guilliermondii)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)、梅奇酵母(Metschnikowia)霉菌哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、绿色木霉(Trichoderma viride)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)其他荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)1.2.2生防微生物的作用机制明确生防微生物的作用机制对该生防菌株的成功应用及技术的推广至关重要。生防微生物的作用机制非常复杂，某一生防菌株的作用机制是单一的还是几种机制协同作用也比较难以断定，而且有些作用机制可能还尚未被发现。随着国内外学者对生物防治研究的不断深入，我们对生防菌株作用机制的认识也在逐步加深。现有的研究结果表明，生防微生物菌株对有害微生物的作用方式主要有拮抗作用、寄生作用、竞争作用和诱导抗性等。(1)拮抗作用拮抗作用指生防菌株通过分泌胞外活性物质的方式来抑制有害微生物的生长繁殖甚至杀死有害微生物的现象，它是生防菌株发挥作用的一个重要机制。生防菌株分泌的胞外活性物质通常在极低的浓度下就能对有害微生物的生长代谢活动产生抑制作用，如荧光假单胞菌产生的吩嗪类抗生素(朱栋华, 2003)、枯草芽孢杆菌产生的脂肽类抗生素(陈华等, 2008)、明串珠菌产生的细菌素(李曼等, 2008)、木霉产生的木霉素(申屠旭萍等, 2009)等。纪兆林等研究发现地衣芽孢杆菌产生的抗菌蛋白对苹果轮纹病菌、炭疽病菌的菌丝生长和孢子萌发具有显著的抑制作用，可以有效防治苹果贮藏期的轮纹病病害(纪兆林等, 2008)。范青等的研究表明枯草芽孢杆菌B-912对柑橘采后青霉病和绿霉病具有较好的抑制效果，菌株B-912的抑菌机理主要是产生抗菌素(范青等, 2000)。(2)寄生作用寄生作用指生防菌株通过吸附生长、侵入等方式抑制有害微生物生长的现象。寄生作用是拮抗真菌菌株发挥生防作用的重要机制之一，如哈茨木霉(Benhamou and chet, 1993)的菌丝定向生长扩展伸向有害真菌，当接触到病原真菌后，它的菌丝吸附于于病原真菌菌丝体周围，通过分泌蛋白酶、几丁质酶和葡聚糖酶等可以降解有害真菌细胞壁的酶类来破坏其细胞骨架，致使其消解死亡，从而表现出抗真菌活性。 (3)竞争作用竞争作用是生防微生物发挥作用的重要机制之一，微生物间的竞争作用主要包括营养竞争和空间位点竞争，指生防菌株通过争夺同一生态环境内的营养和空间位点的方式来抑制病原微生物的生长繁殖。王亮等的研究表明梅奇酵母XY201在冬枣表皮具有很强的定殖能力，在人工气调条件下贮藏，梅奇酵母XY201 能有效抑制冬枣黑斑病的发生，使发病率降低52.5%-59.2%(王亮等, 2010)。Charles等发现玉米内生芽孢杆菌能在玉米体内迅速生长繁殖，占领生态位点，从而达到抑制病原真菌生长的效果(Charles et al, 2001)。(4)诱导抗性 近年来，拮抗菌株诱导采后果蔬产生抗性成为了果蔬采后贮藏期病害生物防治的研究热点(李淼, 2010)。已有的大量研究表明，有些生防菌株或其代谢产物能引起果蔬发生一些生理生化反应，提高果蔬自身某些酶的活性，从而使果蔬产生对多种病原微生物的抗性，这种现象称为诱导系统抗性。研究发现，出芽短梗霉(Ippolito A et al, 2000)、毕赤酵母(Fan et al, 2000)、假丝酵母(Ghaouth et al, 2003 )、枯草芽孢杆菌(Ongena, 2007)等均能诱导多种果蔬发生生理生化反应，提高果蔬自身的抗性，减少其在采后贮藏期的腐烂。1.3生防芽孢杆菌芽孢杆菌(Bacillus)是一类嗜温、好氧、产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，具有抗逆性强，易于分离培养，生理特征丰富多样，能够代谢产生多种具有抑菌活性的胞外物质，抑菌谱广等显著优点，且该菌在自然界中广泛存在，对环境无污染，对人畜无毒无害，是理想的生防微生物菌株。近年来，国内外学者对芽孢杆菌在生物防治中的应用开展了大量研究，用于生物防治的芽孢杆菌主要有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)等。范青等分离筛选得到的枯草芽孢杆菌B-912对柑桔青霉病、绿霉病均具有较好的防治效果(范青等, 2000)。杨震等的研究结果表明采用1108 CFU/mL的枯草芽孢杆菌BS-331菌悬液浸泡油桃可达到与纳他霉素(300 mg/L)相当的防治油桃采后病害的效果(杨震等, 2008)。纪兆林等研究发现地衣芽孢杆菌产生的抗菌蛋白对苹果轮纹病菌、炭疽病菌的菌丝生长和孢子萌发具有显著的抑制作用，可以有效防治苹果贮藏期的轮纹病病害(纪兆林等, 2008)。陈莉等从棉花根际土壤中分离得到短短芽孢杆菌A57，平板对峙培养试验中菌株A57对棉花立枯病菌、枯萎病菌和黄萎病菌的平均抑制率分别达到33.15%、39.15%、29.15%，具有良好的生防应用潜力(陈莉等, 2007)。王奕文等从甜瓜果皮分离得到一株解淀粉芽孢杆菌EXWB3-03，对峙培养试验结果表明菌株EXWB3-03对灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、链格孢(Alternaria alternata)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、黑曲霉(Aspegillus niger)和粉红单端孢霉(Trichothecium roseum)等8种果蔬采后病原真菌均具有显著的拮抗作用(王奕文等, 2008)。赵德立等研究发现多粘芽孢杆菌JW2725对柑橘青霉菌具有很强的拮抗作用(赵德立等, 2006)。1.4芽孢杆菌抑菌物质研究概况1952年，Babard等首次从枯草芽孢杆菌发酵液中分离出抗真菌肽，至今国内外学者已从枯草芽孢杆菌的不同菌株中发现60多种具有抑菌活性的物质。研究发现枯草芽孢杆菌可以通过核糖体合成途径和非核糖体合成途径产生抑菌物质，核糖体合成途径产生的抑菌物质主要有细菌素类(罗秀针等, 2008)、细胞壁降解酶类(顾真荣等, 2004)、活性蛋白类(谢栋等, 1998)等。非核糖体合成途径产生的抑菌物质主要有脂肽类(高学文和姚仕义, 2003)、多肽类(孙晓宇等, 2010)、酚类(张慧等, 2011)、挥发性物质(Hua Chen et al, 2008)等。其中脂肽类抑菌物质由于具有理化性质稳定、抑菌活性高、抑菌谱广等优点而成为研究开发的热点。根据脂肽类物质在结构上的差异，可以将其分为Surfactins，Iturins和Fengycins三大类。Surfactins是一类基本结构相似的生物表面活性剂的总称，主要包括枯草芽孢杆菌产生的Surfactin、地衣芽孢杆菌产生的Lichenysin、短小芽孢杆菌产生的Pumilacidin和Esperin(Meiji and Michel, 1969; Yakimov et al, 1995; Naruse et al, 1990)，如图1-1所示。枯草芽孢杆菌产生的Surfactin是由-羟基脂肪酸和含有7个氨基酸的肽链以内酯键结合而成的环状脂肽，其分子中的肽键呈马鞍型立体构象，脂肪酸碳链长度一般为13-15个。枯草芽孢杆菌Surfactin由于肽链中氨基酸的种类、脂肪酸碳链长度及支链位置的不同而形成多个结构类似物，肽链中2、4、7位的氨基酸易被其它氨基酸所取代。枯草芽孢杆菌Surfactin是迄今发现效果较好的生物表面活性剂之一，具有很强的乳化性能，具有抗病毒、抗真菌及抗细菌活性，在医药、食品、化妆品、环境治理、微生物采油等领域具有很好的应用发展前景(杨福廷, 2006; 吕应年等, 2004; 邓建良等, 2010)。图1-1 Surfactins基本结构Iturins是一类对真菌具有较强拮抗作用的脂肽抗生素(Ohno et al, 1993)，主要包括Iturin A、C，Bacillomycin L、D、F、LC和Mycosubtilin等(Yao et al, 2003)，如图1-2所示。Iturins由-胺基脂肪酸和含有7个氨基酸的肽链以酰胺键结合成环状，脂肪酸链一般由14-17个碳组成，具有高效广谱的抗真菌活性和一定的抗细菌活性。图1-2 Iturins 基本结构Fengycins是另一类具有抗真菌活性的脂肽，主要包括Fengycin A 、B，Plipastatin A 、B，如图1-3所示(Schneider, 1999)。Fengycins对丝状真菌具有较强的抑制作用，研究表明Fengycins通过影响真菌细胞膜的表面张力，导致细胞膜形成微孔，从而使细胞内离子出现渗漏，最后引起细胞死亡(Magali and Michel, 2008)。Fengcyins是一类由-羟基脂肪酸链和10个氨基酸构成的化合物，其中8个氨基酸结合成环，2个氨基酸和脂肪酸链结合成链状，脂肪酸链一般由15-17个碳组成。图1-3 Fengycins基本结构1.5本研究的目的和意义有害微生物侵染导致的各类食品腐败变质给人类健康及食品工业的发展带来了严重威胁，而食品防腐保鲜中常用的物理及化学方法又或多或少的存在一些弊端。这就使得越来越多的国内外学者把目光投向了天然防腐剂的开发利用，而微生物因具有生长繁殖快、生长条件简单、易于分离培养等优点已成为天然防腐剂研究开发的热点。本实验从不同土壤样品中分离纯化得到细菌菌株，并以易于侵染各类食品的有害微生物为指示菌筛选具有广谱拮抗作用的拮抗菌株，并对拮抗菌株进行分类鉴定，以期为食品防腐保鲜提供新的生防菌种资源；采用紫外线、硫酸二乙酯和微波方法对拮抗菌株进行诱变选育，通过单因素和响应面分析得到拮抗菌株产抑菌物质的最佳发酵培养基和最优发酵条件；利用盐酸沉淀和甲醇抽提的方法获取拮抗菌株的抑菌活性物质，通过薄层色谱对抑菌物质进行初步纯化，测定抑菌物质的抑菌谱，并利用红外色谱分析及质谱分析法对抑菌物质进行鉴定，为开发和利用拮抗菌株及其抑菌物质进行食品的防腐保鲜打下坚实基础。第二章 广谱拮抗菌株的筛选及其鉴定2.1材料2.1.1样品表 2-1 试验所用样品及来源样品代号样品样品来源LM05土壤腾冲地区轮马热泉LM07土壤腾冲地区轮马热泉BH03土壤腾冲地区北海温泉BH04土壤腾冲地区北海温泉LM08土壤腾冲地区轮马热泉LM19土壤腾冲地区轮马热泉LM21土壤腾冲地区轮马热泉LM23土壤腾冲地区轮马热泉LM25土壤腾冲地区轮马热泉RH07土壤腾冲地区大滚锅石侧水沟RH08土壤腾冲地区大滚锅石侧水沟DT02土壤腾冲地区大塘热泉DTO3土壤腾冲地区大塘热泉DT05土壤腾冲地区大塘热泉DTO6土壤腾冲地区大塘热泉DT21土壤腾冲地区大塘热泉RST19土壤腾冲地区热水塘大池SQ03土壤腾冲地区石墙热泉DZ05土壤腾冲地区胆扎温泉DZ06土壤腾冲地区胆扎温泉DT19土壤腾冲地区大塘热泉DT18土壤腾冲地区大塘热泉2.1.2 试剂表2-2试剂试剂名称规格生产厂家牛肉浸膏BR北京奥博星生物技术有限责任公司氯化钠AR天津市风船化学试剂有限公司酵母膏AR北京奥博星生物技术有限责任公司琼脂粉BR天津市科密欧化学试剂有限公司葡萄糖AR天津市科密欧化学试剂有限公司乳糖AR天津市科密欧化学试剂有限公司蛋白胨BR北京奥博星生物技术有限责任公司双氧水AR汕头市西陇化工厂有限公司磷酸二氢钠AR天津市化学试剂三厂硝酸钾AR天津市瑞金化学品有限公司乙酸AR开封市芳晶化学试剂有限公司盐酸AR洛阳昊华化学试剂有限公司三氯化铁AR天津市化学试剂工厂碘AR天津市科密欧化学试剂有限公司甲基红AR天津市科密欧化学试剂有限公司4-氨基苯磺酸钠AR国药集团化学试剂有限公司结晶紫AR天津市化学试剂三厂次氯酸钠AR天津市光复精细化工研究所番红花红TAR天津市科密欧化学试剂有限公司-萘胺AR天津市科密欧化学试剂有限公司溴百里香酚兰AR上海三爱思试剂有限公司L-苯丙氨酸AR上海三爱思试剂有限公司氢氧化钠AR天津市科密欧化学试剂有限公司无水乙醇AR天津市永大化学试剂开发中心2.1.3 仪器表2-3仪器仪器名称仪器型号生产公司生化培养箱SHP-150上海精宏试验设备公司电热恒温水浴锅DZKW-S-4北京市永光明医疗仪器厂电热恒温鼓风干燥箱DHG-9246A上海精宏试验设备公司恒温培养振荡器ZHWY-211C上海智城分析仪器制造有限公司立式压力蒸汽灭菌锅LDZX-50KB上海申安医疗器械厂生物显微镜BK5000重庆奥特光学仪器有限公司台式离心机TGL-16C上海菲恰尔分析仪器有限公司无菌操作台SW-CJ-2F苏州安泰空气技术有限公司移液枪KHB上海科华实验系统有限公司超纯水系统61814-1德国SG公司电泳槽DYCP-31北京六一仪器厂稳压稳流电泳仪DYY-5北京六一仪器厂PCR仪MG48+杭州郎基科学仪器有限公司紫外凝胶成像仪WFH-101B美国Bio-Rad公司电子天BS 124S北京塞多利斯仪器系统有限公司冰箱 BCD-155TDGA青岛海尔股份有限公司2.1.4 培养基NA培养基(NA)：牛肉膏3g、蛋白胨 10g、NaCl 5g、琼脂 20g、蒸馏水1000 mL、pH 7.0，用于细菌的分离、培养及保存。 PDA培养基(PDA)：马铃薯200g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1000 mL、pH自然，用于病原真菌的培养、保存。LB培养基(LB)：蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠 10g、蒸馏水1000 mL、pH 7.0，用于细菌的液体培养。2.1.5供试有害微生物表2-4 供试有害微生物有害微生物来源大肠杆菌(Escherichia coli)实验室保存金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)实验室保存黄曲霉(Aspergillus flavus)实验室保存黑曲霉(Aspergillus niger)实验室保存扩展青霉(Penicillium expansum)实验室保存禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)实验室保存细极链格孢(Alternaria tenuissima)实验室保存2.2 方法2.2.1微生物培养将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌划线接种于NA斜面上，37恒温培养24h。分别将黄曲霉、黑曲霉、扩展青霉、禾谷镰刀菌、细极链格孢接种于PDA平板上，28恒温培养5d后，用无菌打孔器在培养好的各真菌平板上打孔，得到直径6mm的病原真菌菌饼。2.2.2细菌菌株分离纯化准确称取25g土壤样品，放入装有玻璃珠和 225mL无菌水的三角瓶中，振荡30min，得到样品悬液。在无菌条件下，用无菌水对样品悬液进行梯度稀释，得到10-110-8浓度的稀释液。分别吸取各稀释度的样品悬液0.1mL均匀涂布于NA平板上，30恒温培养24h36h后，观察长出菌落的形态、颜色、透明度等特征，挑取形态差异明显的菌落进行划线纯化、编号、保存备用。2.2.3菌悬液制备取活化好的待测细菌菌株、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌斜面，分别用10mL无菌生理盐水冲洗各菌株斜面，涡旋振荡混匀后，平板菌落计数，然后用无菌生理盐水将各菌体浓度均调整为106CFU/mL，即得到待测细菌及指示菌菌悬液。2.2.4拮抗菌株初筛采用滤纸片法(He, 2009)考察待测细菌菌株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制能力。分别取20mL大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌悬液，同200mL冷却至55左右的NA培养基充分混匀后倒平板，待其凝固后，分别于距离平板中央2.5cm处的四个点上放置四个已灭菌的直径8mm的滤纸片，然后缓慢向滤纸片滴加15L待测细菌菌悬液，以15L无菌水作为对照。每个处理重复3次，37恒温培养24h后，观察是否有抑菌圈出现，测量并记录抑菌带宽。采用平板对峙培养法(Sanket, 2008)考察待测细菌菌株对病原真菌的抑制能力。在PDA平板中央接入直径6mm的病原真菌菌饼，分别于距离平板中央2.5cm处的四个点接种待测细菌，以未接种待测细菌的平板作为对照。每个处理重复3次，28恒温培养5d，定期查看病原真菌的生长情况，测量并记录抑菌带宽。2.2.5拮抗菌株无细胞培养滤液制备将初筛得到的拮抗菌株在NA培养基上活化后，接入装有50mL LB培养液的250mL三角瓶中，30、175rpm振荡培养12h后，以5%(v/v)的接种量接入装有200mL LB培养液的500mL三角瓶中，30、175rpm振荡培养48h，得到拮抗菌株发酵液。将发酵液在4条件下，12000rpm离心15min，收集上清液。上清液经0.22m微孔滤膜过滤后即为无细胞培养滤液，4保存、备用。2.2.6拮抗菌株的复筛采用牛津杯法(foldes, 2000)对初筛得到的抑菌效果较好的拮抗菌株进行复筛。按照2.2.4中的方法制备含有大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的NA平板，分别于距离平板中央2.5cm处的四个点放置4个已灭菌的牛津杯，取150L拮抗菌株无细胞培养滤液于牛津杯中，以向牛津杯中加入150L无菌水为空白对照，每个处理重复3次，37恒温培养24h后，观察实验组平板是否有抑菌圈出现，测量并记录抑菌圈直径。在PDA平板中央接入直径为6mm的病原真菌菌饼，分别于距离病原真菌菌饼中央2.5cm处的四个点放置4个已灭菌的牛津杯，取150L拮抗菌株无细胞培养滤液于牛津杯中，以向牛津杯中加入150L无菌水为空白对照，每个处理重复3次，28恒温培养5d，定期查看病原真菌的生长情况，测量并记录抑菌带宽度。2.2.7拮抗菌株形态特征观察参照常见细菌系统鉴定手册(东秀珠和蔡妙英，2001)对拮抗菌株进行传统形态学鉴定，包括菌株个体形态、大小及排列情况，革兰氏染色，有无运动性，鞭毛的着生位置和数目，有无芽孢及芽孢的着生部位和形状，细胞个体发育过程中形态变化的规律性，是否有荚膜，菌落形态、大小、颜色、黏稠度、透明度、表面性质、边缘及隆起情况等。 2.2.8拮抗菌株生理生化特性分析参照常见细菌系统鉴定手册(东秀珠和蔡妙英，2001)进行拮抗菌株的生理生化试验，包括需氧性、运动性、生长温度、葡萄糖发酵试验、过氧化氢酶试验、V-P试验、淀粉水解试验、柠檬酸盐利用试验、酪蛋白水解试验、硝酸盐还原试验、耐盐性试验、纤维素降解试验、明胶液化试验、尿素利用试验、吲哚试验、pH5.7营养肉汤生长试验等。2.2.9 拮抗菌株16S rDNA序列分析2.2.9.1细菌基因组DNA提取将筛选得到的拮抗菌株在NA培养基上活化后，接入装有10mL LB培养液的50 mL三角瓶中，30、175 rpm振荡培养12h。取拮抗菌株培养液1mL，12000rpm离心2min，收集菌体。按照细菌基因组DNA提取试剂盒（北京鼎国生物技术有限责任公司）操作说明书提取拮抗菌株的基因组DNA。2.2.9.2 16S rDNA序列扩增以16S rDNA通用引物27F和1492R为引物，以提取得到的拮抗菌株基因组DNA为模板对拮抗菌株的16S rDNA进行PCR扩增。依照表2-5，冰浴配制30L PCR反应体系。PCR反应条件为，95预变性3min；95变性50S，52退火50S，72延伸2min，30个循环；72延伸10min。引物1 27F：5-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3引物2 1492R：5-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3表2-5 PCR反应体系ddH2012L模板1L引物11L引物21L2Taq Plus PCR Green Mix15L总体系30L PCR扩增产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测后送交上海生工生物工程有限公司纯化测序。2.2.9.3 系统发育分析将测序结果与GenBank