分子生物学8DNA重组技术liu.ppt

第八章 基因重组与基因工 程 v基因工程：按人为的设计，通过基因克隆技 术有目的地改造基因，改变生物遗传性状的 系列过程称为基因工程（genetic engineering）。基因工程就是要改造 DNA,涉及DNA序列的重新组合和建造,其核 心即是人工的DNA重组。 vDNA重组：不同来源的DNA分子通过末端 共价连接形成重新组合的DNA分子的过程 称为DNA重组（DNA recombination ）。 v基因克隆（DNA克隆）：是指在体外对 DNA分子按照既定的目的分离、剪切和重 新连接，构成重组的DNA分子，然后把它 导入宿主细胞，使其在宿主细胞内扩增，从 而获得该DNA分子的大量拷贝。由于此克 隆技术是在分子水平上进行的，故又称为分 子克隆（molecular cloning）。 v基因工程、蛋白质工程、酶工程共同构成当 代新兴的学科领域生物技术工程。 第一节 工具酶 v限制性核酸内切酶（restriction endonucleases） vDNA连接酶（DNA ligase） vDNA聚合酶（DNA polymerase） v末端脱氧核苷腺转移酶（terminal deoxy nucleotidyl transferase， TdT） 一、限制性核酸内切酶 （restriction endonucleases） v又称限制性内切酶，简称为限制酶，能识别 双链DNA分子内部的特异位点并裂解磷酸 二酯键。 v5AACGTTCGAAGCTTTAGGCCCGAT3 (一)限制酶的命名与分类 v限制酶常以4个字母命名，第一个字母取自 产生该酶的细菌属名，用大写；第二、三个 字母是细菌的种名，用小写；第四个字母代 表株名。另外用罗马字代表同一菌株中不同 限制酶的编号。如Hind的H代表 Haemophilus属，in代表influenzae种，d代 表Rd菌株，代表该菌株中第三个被分离到 的限制酶。 v限制性核酸内切酶 分为，型，基 因克隆中所用的限制酶是型酶。 (二) 型限制酶的识别和切割 位点 型酶的识别序列通常为46bp，具有回 文结构（palindrom），大多数酶是错位切 割双链DNA，产生5或3末端突出的粘性末 端（sticky end）。 v如EcoRI切割后产生5末端突出的粘性末端； 5GAATT C3 5G 5 AATTC3 3C TTAAG5 3CTTAA 5 G5 vPstI切割后产生3末端突出的粘性末端： 5C TGCAG3 5CTGCA G3 3GACGT C5 3G ACGTC5 v还有一些酶沿对称轴切割DNA，产生平端或钝端（blunt end）。如SmaI: 5CCCGGG3 5CCC GGG3 3GGGCCC5 3GGG CCC5 v有些限制酶识别序列不同，但切割DNA后产生相同类型的 粘性末端，这些酶称为同尾酶（isoaudamers），如 BamHI（GGATCC）和Sau3AI（NGATCN）。由此产 生的粘性末端称为配伍末端（compatible end），可进行 相互连接，在DNA重组中具有更大灵活性。 二、其他工具酶 v1.DNA连接酶（DNA ligase）：催化DNA 片段之间的3-5磷酸二酯键的形成。 v2.DNA聚合酶：基因克隆中常用的DNA聚 合酶有大肠干菌DNA聚合酶、Klenow片段 和T4DNA聚合酶。 v3.末端脱氧核苷腺转移酶：将dNTP逐一加 到DNA的3-OH上。 三、目的基因 v在基因工程中，欲要克隆的基因或要 表达的基因称为目的基因，又称为目 的DNA（target DNA）。 v包括cDNA和基因组DNA(genomic DNA)。 第二节 基因载 体 v外源DNA本身没有自主复制能力，导入宿主细胞 后不能随宿主细胞的繁殖而复制，达不到使外源 DNA片段扩增的目的。如果要将外源DNA导入宿 主细胞进行扩增或表达，就需要将外源DNA与某 种能在宿主细胞中进行自主复制和表达的DNA重 组，并由其携带进入宿主细胞。这种可以用来插 入外源DNA片段构建重组DNA分子，并将外源 DNA携带进入宿主细胞并进行复制的DNA称为基 因克隆载体，简称为载体（vector）。 v可充当克隆载体的DNA分子有质粒DNA、噬菌体 DNA和病毒DNA。 一、质粒 （一）质粒DNA的生物学特性 v 质粒（plasmid）是一些染色体外的环形双链 DNA分子； v 质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中， 大小从1kb至200kb不等； v 具有自主复制能力，能在子代细胞中保持恒定 的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。 v 由质粒产生的表型含有对抗生素的抗性基因， 可供筛选用。 v有共价闭环DNA、开环DNA、线状DNA三种存在形 式 （二）良好载体应具备的条件 v分子量相对较小，能在细菌内稳定存在，有较多 的拷贝数； v具有可供选择的遗传标志，便于对宿主细胞进行 识别和筛选，如抗生素的抗性基因、lac Z等； v带有尽可能多的限制酶单一酶切位点，即多克隆 位点（multiple cloning sites ,MCS）。便于有 选择性的外源基因定点插入。如果这些位点有外 源基因的插入，会导致某些标志基因的失活，而 便于筛选； v具有复制起始点（origin ,ori），能在宿主细胞中 自主复制，并能携带外源DNA片段一同扩增； v表达载体还应具备表达元件。 （三）常用的质粒载体 v已商品化的质粒载体较多，本处只介绍 pBR322、pUC两类。 1.pBR322质粒载体 v早期应用的质粒载体是由F.Boliver和 RL.Rodriguez构建，当时他们构建起一套 pBR质粒系列，pBR322则是其中的一种。 pBR322质粒载体的特点是： v含有单个EcoR限制性核酸内切酶位点,可 在此插入外源基因； v具有氨苄青霉素(ampr)和四环素(terr)两种 抗生素的抗性基因，可供作转化子的选择标 志。 v具有复制起始点(ori),可自主复制。 2. pUC质粒载体 v pUC质粒载体是由M13噬菌体改造建成，是一种 具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。pUC 质粒载体是由J.Messing和J.Vieria于1987年首先 构建，包括： v来自于pBR322质粒的复制起始点（ori）； v氨苄青霉素抗性基因（Ampr）， v大肠杆菌半乳糖苷酶基因(lacZ)的启动子及 其编码-肽链的DNA序列（编码大肠杆菌半乳 糖苷酶N端的46个氨基酸残基），此结构特称为 lacZ基因，可供-互补筛选用。 vUC:University of Califonnia v lacZ expressing vlacZ gene sequence of galactosidase 146 amino acid of N terminal expressing vlac- E.coli sequence of galactosidase （C terminal） + vX-gal blue chemical material (production) vIt is named as alpha complementation(-互 补) v galactosidase 半乳糖苷酶， vX-gal: 5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷 vlac- E.coli: 半乳糖苷酶基因突变型大肠杆菌 二、噬菌体载体 v噬菌体 ( phage) vM13噬菌体 v1.噬菌体 ( phage) vDNA为为双链线链线 性分子,长约长约 49kb,在分子两端各 有12bp的互补单链补单链 ,是天然的粘性末端,称cos位 点。当噬菌体吸附于宿主细细胞膜后， DNA自噬 菌体的尾部注入宿主细细胞，其两个粘性末端互相 结结合，既可裂解生长长，也可溶源生长长。 v较质较质 粒有如下优优点： v可携带较长带较长 的外源DNA片段，最大可达23kb； v重组组后的DNA分子可在体外包装成噬菌体颗颗粒， 具有更强的转转染宿主细细胞的能力； v重组组的噬菌体容易筛选筛选 和储储存。 v The important bacteriophage（噬菌体 ） used for vectors are bacteriophage and bacteriophage M13. vThe vectors developed by modifying bacteriophage include : vgt system (insert type vector 插入型载体 ,used for cDNA cloning) vEMBL system(replacement type vector置 换型载体, used for genormic DNA) v2.M13噬菌体 v为6.4kb的闭环DNA; v其特点是可产生大量 含有 外源DNA的单链 DNA分子; v可用于DNA测序、 DNA诱变和探针制备 v3.病毒载体 v上述载体的宿主细胞是原核细胞,如要将外 源基因在真核细胞扩增或表达,需要构建真 核表达载体,病毒载体则属于真核表达载体. v动物病毒载体:反转录病毒载体 Retrovirus vector 腺病毒载体 Adenoviros vector 腺病毒相关载体 Adenovirus-associated virus 慢病毒载体 v真核表达质粒 pcDNA3.1 第三节 基因克隆的基本程序 v基因克隆的基本程序包括五大步骤: v目的基因的获取; (分) v目的基因与载体的拼接;(切、接） v将重组体转入受体细胞;（转） v重组体的筛选和鉴定；（筛） v重组体的扩增与表达 一、目的基因的制备 v在基因工程中，欲要克隆的基因或要表达的 基因称为目的基因，又称为目的DNA（ target DNA），包括cDNA和基因组DNA (genomic DNA)。 v化学合成法 v基因组DNA vcDNA vPCR扩增目的基因 1化学合成法 v对已知碱基序列的目的基因可以利用化学合 成的方法予以合成; v如果知道肽链的氨基酸顺序，则可按照对应 的密码子推导出DNA的碱基序列，然后用 化学方法人工合成这段序列; vDNA合成仪的诞生，为人工合成目的基因 提供了方便、快捷的合成方法。 v已合成：胰岛素原、脑啡肽、干扰素等基因 。 2基因组DNA v采用限制酶将基因组DNA切成片段，与载 体连接成重组DNA分子，重组DNA导入受 体菌扩增，使每个细菌内都携带一种重组 DNA分子的多个拷贝。这些存在于转化菌 内，由克隆体所携带的所有基因组DNA的 集合称为基因组DNA文库（genomic library, g文库）。基因组文库包括某种细 胞器或某个染色体基因组所有DNA片段， 即全部遗传信息。目的基因可以从基因组文 库中筛选。 3cDNA v从生物细胞中提取总RNA，通过反转录酶反应合 成与mRNA互补的DNA（complementary DNA ，cDNA）, 再复制成双链cDNA片段，与适当载 体连接后形成重组DNA混合体，重组DNA导入受 体菌进行扩增，得到分子克隆的混合体，该混合 体称cDNA 文库（c文库）。 vcDNA文库与gDNA文库不同，它只有表达的转录 体互补序列，不包括内含子和其他表达的DNA序 列。从cDNA文库中也可以筛选出所需的目的基因 。 cDNA的生成 v5.GUCUAAGCCGUGUAA.3 mRNA 反转录 v5.GUCUAAGCCGUGUAA.3 mRNA v3 .CAGATTCGGCACATT.5 cDNA v 解链 v3 .CAGATTCGGCACATT.5 cDNA 复制 v3. CAGATTCGGCACATT.5 双链 v5. GTCTAAGCCGTGTAA.3 cDNA PCR cDNA文库的构建 4PCR扩增目的基因 v采用聚合酶链反应（PCR）技术可以在体 外特异地扩增目的基因片段。在已知序列前 提下，也可以采用反转录PCR（RT-PCR） 方法直接从mRNA获得特定基因的cDNA。 PCR扩增目的基因的方法，较从基因组文 库或cDNA文库获得目的基因更为简便、快 捷和准确。 二、目的基因与载体的重组（拼 接） v目的基因片段与适当的载体经限制酶剪切后 ，再在DNA连接酶的催化下即可相互连接 ，形成人工重组体。常用体外重组方法主要 有以下四种。 v粘性末端连接 同一限制酶切割位点连接 5G AATTC3 酶切 5G AATT C3 3CTTAAG5 3C TTAA G5 5GAATTC3 酶切 5G AATT C3 3CTTAAG5 3C TTAA G5 5G AATTC3 连接酶 5GAATT C3 3CTTAA G5 3C TTAAG5 5G AATT C3连接酶 5GAATT C3 3C TTAA G5 3C TTAAG5 v平端连接 AGCT GCAT AGCTGCAT TCGA CGTA TCGACGTA v同聚物加尾连接 同聚物加尾连接是利用同聚物序列，如多聚A与多 聚T之间的退火作用完成连接，该法是cDNA克隆 常用的方法。在末端转移酶（terminal transferase）作用下，在DNA片段末端加上同聚 物序列、制造出粘性末端，而后进行粘性末端连 接。 AGCT TTTTGCAT AGCTTTTTGCAT TCGAAAAA CGTA TCGAAAAACGTA 三、重组DNA转入宿主细胞 v外源DNA与载体DNA形成重组DNA后，需要导入 宿主细胞才能复制、扩增与表达。在基因克隆技 术中: v将质粒DNA及其重组体导入细菌称为转化（ transformation）； v将病毒及其重组体导入宿主细胞称为转染（ transfection）； v将噬菌体及其重组体导入宿主细胞称为转导（ transduction）。 氯化钙法（磷酸钙转染法） v将受体菌悬浮在0和低渗CaCl2溶液中，经一段 时间后，菌体细胞壁通透性增加，菌体膨胀成球 形，易于吸收外源DNA，这种状态的菌称谓感受 态菌。 v将溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中的重组质粒DNA 加入感受态菌，搅拌混匀，此时转化液中的DNA 形成抗Dnase的羟基-磷酸复合物，粘附于细胞表 面，经短暂的热休克（4290秒）后即可进入细 胞内。然后在不含抗生素的培养基中继续培养， 使质粒DNA得到复制，并使抗生素抗性基因表达 。 v将上述细菌接种在含有有关抗生素的琼脂平板上 ，过夜生长，即可得到转化的菌落(转化菌)。 v此种方法转化频率很低（大约0.01-0.1%），故需 一个很强的选择性标志基因。 电穿孔法 v将对数生长期的大肠杆菌与外源DNA混合 于电穿孔杯中，在高频电流作用下，细胞壁 出现小孔，外源DNA即可进入细胞内。 v电穿孔法最早用于DNA导入真核细胞，现 已用于大肠杆菌和其他细菌。 v该法操作简单、转化率比较高。但需要特殊 仪器、技术性高、细胞杀伤率高。 3脂质体转染法 v近年相继发展了系列广谱和高效的脂质体，如单价阳离子 脂质体DOSTAP等和多价阳离子脂质体DOSPER和infect AMINETM等。其中以infect AMINETM最新。 v脂质体是一类双层的微囊结构，如DOSPER和infect AMINETM，含有一个亲水性正电荷的精胺基团头和疏水 性脂酸尾，可与DNA分子结合成脂质体/多核苷酸复合物 ，使DNA免受Dnase的降解，精胺基团可与带负电荷的细 胞表面非特异吸附，易于通过细胞内吞作用而进入细胞内 。 v该方法的优点是：转化率最高，转化细胞类型广泛。其缺 点是脂质体价格昂贵 精胺基团头 疏水性脂酸尾-DNA 4.显微注射法 v显微注射法是在显微镜下，经细胞玻璃针将 外源DNA直接注入细胞。 四、 重组体的筛选与鉴定 v在转化过程中并非每个宿主细胞都被转化； 即使获得转化的细胞也并非都含有目的基因 ，可能含有自身成环的载体分子，或载体与 非目的基因形成的重组子。 v因此，转化后须在不同层次、不同水平上进 行筛选，以区别转化子与非转化子、重组子 与非重组子，以及鉴定所需的特异性重组子 。 （一）遗传学方法 v1.抗药性标志筛选转化菌 克隆载体上含有抗菌素抗药性基因，如 ampr和tetr等，用其转化细菌后，含有重组 体的细菌能在含amp和/或tet的培养板上生 长并形成菌落，不含有重组体的细菌则不能 生长。利用这种方法即可把转化菌和非转化 菌区分开，初步筛选出转化菌。 v2.筛选带有重组体的克隆 v(1)插入失活法(insection inactivation) v将目的基因插入抗生素抗性基因中,破坏其 相应抗生素抗性. v(2) -半乳糖苷酶显色反应法 v又称为-互补（alpha complementation） 筛选或蓝白斑筛选,属于标志补救筛选. v在PUC系列和M13中，均引入能表达-半乳糖苷酶的肽 的LacZ基因。当无外源DNA插入时，质粒表达肽。 v突变型Lac-E.Coli可表达该酶的肽。 v肽 + 肽具有-半乳糖苷酶活性，能催化底物X- gal变成蓝色物质. v在诱导剂IPTG （异丙基-D-硫代半乳糖苷）存在下,宿 主细胞与克隆载体同时共表达这两个肽时，宿主细胞内才 有-半乳糖苷酶活性，在含有底物X-gal和诱导剂IPTG条 件下，菌落呈蓝色，这就是-互补（alpha complementation）。 v如果LacZ基因由于插入外源基因而失活，结果无肽表达 ，转化菌落无-互补，缺乏-半乳糖苷酶活性，在X- gal培养板上为白色菌落，由于这种颜色标志，重组克隆 和非重组克隆的区别一目了然，这种筛选也称为“蓝白斑 筛选”，或称-互补筛选。 v (二)分子杂交法 v将待选菌在琼脂平板上培养成菌落或噬菌斑 ，再把硝酸纤维素膜或尼龙膜盖于长有菌落 或噬菌斑的琼脂平板的表面，定好位，把膜 揭起，进行原位分子杂交，根据阳性斑点在 平板上的相应位置，即可找出阳性克隆。 (三)免疫化学筛选法 v如果外源基因能够在宿主细胞进行表达，合 成外源蛋白质，可以采用免疫化学等方法检 测，用已知的抗体来检测目的基因编码的抗 原。 v v (四)PCR筛选法 六、克隆基因的表达 v如果所用载体是表达载体,重组DNA在宿主 细胞中可表达出克隆基因的蛋白质。 (一)真核细胞基因表达特点 v基因组复杂，基因数量多 v断裂基因,转录后需剪接修饰 v转录和翻译在时间和空间上分离 v转录后加工修饰 v单顺反子 vRNA聚合酶II (二)真核基因在原核细胞中的 表达 v要大量的制备蛋白质,或制备按其他方法难 以生产的蛋白质,可在原核细胞中表达生产; v真核基因在原核细胞中表达比在真核细胞中 表达要方便、快速得多； v但需要加工的蛋白质在原核细胞中表达有困 难。 大肠杆菌系统具有明显的优越性 ： v经过长期的研究人们已经掌握了丰富的大肠杆菌 的基础生物学、遗传学以及分子生物学等方面的 背景知识，特别是对其基因表达调控的分子机理 有很深刻的理解。 v大肠杆菌已经发展成一种安全的基因工程实验体 系，拥有各类实用的寄主菌株和各种载体系列。 v实验已证明许多真核基因都可以在大肠杆菌细胞 中表达 v大肠杆菌培养方便，操作简单，成本低廉，易于 进行工业化批量生产 真核基因在原核细胞中表达局限 性 v真核基因的结构上同原核基因有着很大的差 别 v真核基因的转录信号同原核不同。 v真核基因的蛋白质产物都要经过翻译后的修 饰，剪接，折叠组装。 v细菌的蛋白酶往往会识别外来基因所表达的 蛋白质，并把它们降解。因此，必须对大肠 杆菌的表达体系充分了解并加以改造。 大肠杆菌表达载体结构示意图: RBS:核糖体结合位点; P:promoter（启动子）; SD:SD序列位于AUG上游3-10bp处,由3-9bp组成,是 rRNA识别和结合位点 提供有效地启动子和终止子 v基因的编码区之前应有一个启动子 v可以是外源基因携带的特定的启动子 v也可以是载体携带的新启动子 v好的启动子应具备的条件 v强启动子 lac 、trp、tac、l pL 、 phage T7 v应能够呈现出一种低限的基础转录水平 v启动子应是可诱导型的 Shine-Dalgarno Sequence(SD 序列)和核糖体结合位点 v RBS - ribosome binding site, 翻译起 始信号 v由AUG(GUG)和SD序列组成 vShi