传染病病原诊断技术.ppt

传染病病原体的诊断技术传染病病原体的诊断技术 上海市（复旦大学附属）公共卫生中心上海市（复旦大学附属）公共卫生中心 应急检测实验室应急检测实验室 胡芸文胡芸文 Friend or Foe? Rotavirus Ebola virus Bacterium Algae Protozoan Virus 1973年以来部分新发的传染病 1973 1973 轮状病毒轮状病毒 婴儿腹泻的主要病因婴儿腹泻的主要病因 1975 1975 细小病毒细小病毒B19 5B19 5号病，慢性溶血性贫血的再障危象号病，慢性溶血性贫血的再障危象 1976 1976 隐孢子虫隐孢子虫 隐孢子虫病，急性小肠结肠炎隐孢子虫病，急性小肠结肠炎 1977 1977 埃博拉病毒埃博拉病毒 埃博拉出血热埃博拉出血热 1977 1977 嗜肺军团菌嗜肺军团菌 军团病军团病 1977 1977 汉坦病毒汉坦病毒 肾综合征出血热肾综合征出血热 1977 1977 空肠弯曲杆菌空肠弯曲杆菌 空肠弯曲菌肠炎空肠弯曲菌肠炎 1977 1977 丁型肝炎病毒丁型肝炎病毒 丁型肝炎丁型肝炎 1980 1980 嗜人嗜人T T细胞病毒细胞病毒I I型型 T T细胞淋巴瘤白血病细胞淋巴瘤白血病 1981 1981 金黄色葡萄球菌产毒株金黄色葡萄球菌产毒株 中毒性休克综合征中毒性休克综合征 1982 1982 大肠埃希菌大肠埃希菌O157O157：H7 H7 出血性结肠炎出血性结肠炎 1982 1982 嗜人嗜人T T细胞病毒细胞病毒1111型型 毛细胞白血病毛细胞白血病 1982 1982 伯氏疏螺旋体伯氏疏螺旋体 莱姆病莱姆病 1983 1983 人类免疫缺陷病毒人类免疫缺陷病毒 艾滋病艾滋病(HIV)(HIV) 19731973年以来部分新发的传染病年以来部分新发的传染病( (续续) ) 1983 1983 幽门螺杆菌幽门螺杆菌 消化性溃疡病消化性溃疡病 1986 1986 环孢子球虫环孢子球虫 环型孢子虫病环型孢子虫病( (顽固性腹泻顽固性腹泻) ) 1988 1988 人疱疹病毒人疱疹病毒6 6型型 突发性玫瑰疹突发性玫瑰疹 1989 1989 丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒 丙型肝炎丙型肝炎 1990 1990 戊型肝炎病毒戊型肝炎病毒 戊型肝炎戊型肝炎 1992 01391992 0139霍乱弧菌霍乱弧菌 O139O139霍乱霍乱 1992 1992 巴尔道氏体巴尔道氏体 猫抓病，杆菌性血管瘤病猫抓病，杆菌性血管瘤病 1993 1993 汉坦病毒分离株汉坦病毒分离株 汉坦病毒肺综合征汉坦病毒肺综合征 1994 1994 SabiaSabia病毒病毒 巴西出血热巴西出血热 1994 1994 新变异型克雅氏病新变异型克雅氏病( (人类疯牛病人类疯牛病) 1985) 1985年疯牛病（牛海绵状脑炎年疯牛病（牛海绵状脑炎BSEBSE） -1994-1994年出现首例年出现首例nvCJD-1996nvCJD-1996年提出年提出nvCJDnvCJD概念概念 病原为朊蛋白病原为朊蛋白PrPPrP（英）（英） 1995 1995 庚型肝炎病毒庚型肝炎病毒 庚型肝炎庚型肝炎 1997 H5N11997 H5N1禽流感病毒禽流感病毒 人禽流感人禽流感 1998 1998 NipahNipah病毒病毒 尼巴病毒性脑炎尼巴病毒性脑炎 1999 1999 西尼罗病毒西尼罗病毒 西尼罗病毒性脑炎西尼罗病毒性脑炎 2000 2000 裂谷热裂谷热(Rift Valley)(Rift Valley)病毒病毒 裂谷热裂谷热 2003 SARS2003 SARS冠状病毒冠状病毒 SARSSARS（传染性非典型肺炎）（传染性非典型肺炎） l大部分人类致命性疾病均是由动物传播，包括现正 肆虐全球的禽流感。 l每年至少有一种新病原体，包括病毒、细菌、寄生 虫、原生动物和真菌等从动物传染给人类。 l前所未有的速度产生突变，并传给人类，就如艾滋 病、马尔堡出血热、SARS以及现正肆虐全球的禽流 感等难抗病毒。 l研究人员分辨1407种令人类生病的病原体，发现其 中至少800种越过种物界线，由动物传至人类。 新发传染病动物传播 与人类行为及环境的改变有关 过去25年来曾出现38种新病原体袭击人类，其中 四分三为源自动物的疾病，包括艾滋病、马尔堡 出血热、SARS及禽流感等。 丛林打猎、密集耕种、全球变暖及长途旅行的普 及，增加疾病跨种物传播的机会，使动物身体上 的病原体容易产生突变，感染人类。 一个典型例子是艾滋病毒，最初原是在非洲猿猴 身上发现的一种病毒，其后传播至人类身上，更 演变成世纪绝症。 新病原体的特征 现时人类新传染病的病原体，多属于核糖 核酸(RNA)病毒类，包括艾滋病毒及流感病 毒，可于短时间内发生突变，并容易适应 新宿主，令跨种物传播机会变得更大。 人类与传染病较量中的四方面重大 突破 隔离检疫制度的建立; 病原微生物的发现; 特效药物的出现; 疫苗的诞生 . 快速诊断是关键快速诊断是关键 在人类与传染病的斗争中，诊断、治疗和在人类与传染病的斗争中，诊断、治疗和 预防是三个关键环节。其中，及时正确诊预防是三个关键环节。其中，及时正确诊 断最为关键，是有效治疗的基础，也是制断最为关键，是有效治疗的基础，也是制 定预防策略的依据。定预防策略的依据。 及时发现、有效鉴别、快速诊断和提出预及时发现、有效鉴别、快速诊断和提出预 警，这是现代传染病防治体系的最前沿警，这是现代传染病防治体系的最前沿 对已知传染病要尽快明确诊断对已知传染病要尽快明确诊断 对未知新发传染病要查病因对未知新发传染病要查病因 传染病的实验室传染病的实验室诊断诊断 n n一般检查一般检查; ; n n生化检查生化检查; ; n n病原学检查病原学检查; ; n n免疫学检查免疫学检查; ; n n病理组织检查病理组织检查; ; n n影像学检查影像学检查. . 传统的和常规的病原学传统的和常规的病原学诊断诊断 分离培养分离培养( (细胞细胞, ,组织动物组织动物);); 显微镜检查显微镜检查( (光学和电子显微镜光学和电子显微镜);); 抗原成分检测抗原成分检测(ELISA,(ELISA,免疫荧光等免疫荧光等);); 分子生物学基因诊断分子生物学基因诊断( (核酸杂交核酸杂交,PCR,PCR等等);); ElectronmicrographsElectronmicrographs Adenovirus Rotavirus (courtesy of Linda Stannard, University of Cape Town, S.A.) 免疫荧光检测免疫荧光检测 Positive immunofluorescence test for rabies virus antigen. (Source: CDC) (Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital) 细胞病变效应细胞病变效应 ( (cpecpe) ) l l Some viruses kill the Some viruses kill the cells in which they cells in which they replicate, often easily replicate, often easily visible as visible as cpecpe, other , other viruses produce little viruses produce little or no or no cpecpe l l Typically rounding or Typically rounding or detaching of cells and detaching of cells and cell fusion (cell fusion (syncytiasyncytia) ) From Principles of Virology , Flint et al ASM press From Principles of Virology , Flint et al ASM press 实实 验验 动动 物物 Laboratory animals Laboratory animals - animal models of human infection. - animal models of human infection. Historically the only way to study viruses was from animal to Historically the only way to study viruses was from animal to animal. animal. l l Problems - 1) inconvenient and expensive, 2) not a defined Problems - 1) inconvenient and expensive, 2) not a defined system - leads to generation of virus mutants, 3) animal welfare system - leads to generation of virus mutants, 3) animal welfare issues, issues, l l Advantages - 1) some viruses can only be studied in this way, 2) Advantages - 1) some viruses can only be studied in this way, 2) gives unique insight into virus pathogenesisgives unique insight into virus pathogenesis l l EmbryonatedEmbryonated eggs eggs From Principles of Virology , Flint et al ASM press 核酸诊断的发展史核酸诊断的发展史 l l 核酸分子杂交核酸分子杂交 l l 聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCRPCR） l l 核酸定量分析核酸定量分析 核酸的直接检测核酸的直接检测 核酸扩增检测核酸扩增检测(PCR)(PCR) 定性定性PCR PCR 定量定量PCRPCR 11核酸分子杂交核酸分子杂交(nucleic acid (nucleic acid moleculamolecula hybridization) hybridization) genome probe 32P 35S 3H 125I 生物素 地高辛 酶 genomegenomegenome probeprobeprobe 检测方法：放射自显影 底物显色 化学发光 常用核酸分子杂交技术常用核酸分子杂交技术 斑点杂交（spot blot hybridization) 凝胶电泳印迹转移杂交（Southern blot hybridization) 原位杂交（in-situ hybridization) 聚合酶链反应（PCR） 基本步骤和原理 变性（高温） 退火（低温 ） 延伸（适温 ） 每一循环 模 板 引物引物 dATP dGTP dTTP dCTP Taq酶 PCR原理和步骤 定量定量PCRPCR -荧光实时定量荧光实时定量PCRPCR TaqmanTaqman 水解探针法水解探针法 杂交双探针法 分子信标（环性探针）法 Amplisensor能量转换法等 新发传染病的病原体？新发传染病的病原体？ 病原学发现的“科赫三定律” 一、每种传染病必定能发现其病原体；一、每种传染病必定能发现其病原体； 二、能培养出该病原体的纯种；二、能培养出该病原体的纯种； 三、以培养出的纯种病原体接种于动物可以三、以培养出的纯种病原体接种于动物可以 产生相同的病变。产生相同的病变。 建立该病原体的鉴定方法 动物试验 临床实验室诊断 流行病学研究等 分离到该病原体 确定一种疾病病原体的基本步骤 最终确定病原体与疾病的病因学关系 基本思路基本思路 回答两个问题：回答两个问题： 是否是已知的病原体或其变种？是否是已知的病原体或其变种？ 是否是完全未知的一种病原体？是否是完全未知的一种病原体？ 基本要求：快、准基本要求：快、准 已知病原体的快速诊断已知病原体的快速诊断 高通量的检测技术高通量的检测技术 高通量的病原体筛选技术高通量的病原体筛选技术 病原体核酸的高通量检测病原体核酸的高通量检测 技术一：多重技术一：多重PCRPCR（联用技术：质谱技术、（联用技术：质谱技术、 液相芯片技术）液相芯片技术） 技术二：病原体基因芯片技术二：病原体基因芯片 病原体抗原或抗体的高通量检测病原体抗原或抗体的高通量检测 核心技术：蛋白质芯片核心技术：蛋白质芯片 Multiplex PCR-Mass Tag system 多重 PCR-质谱联用技术 美国哥伦比亚大学Lipkin 研究组发明了一种基 于multiplex PCR-MassTag（多重PCR与质谱联用 ）的高通量病原体快速筛选技术。 优点：由于使用光敏感的分子量标签，增强了 multiplex PCR引物设计的适应性和灵活性，使 检测通量有大幅度的提高。应用质谱分析PCR产 物上的分子量标签克服了凝胶电泳分辨率的局限 或荧光染料种类的局限。 1. PCR amplification with conjugated primers 90 minutes B B A A 2. PCR purification on filter plate 30 minutes 3. Elution into 96-well loading plate for mass spectrometer analysis 96-well 96-well thermocyclerthermocycler plate plate B B A A 4. Automated sample injection, photocleavage and detection 1:30 minutes/sample Purified samplesPurified samples Ultraviolet Light Cleavage of mass tags from Cleavage of mass tags from ampliconamplicon MSMS B B A A B B A AB B A A B B A AB B A A B B A A Ionization and detectionIonization and detection A A B B A A B B Mass SizeMass Size AbundanceAbundance 5. Identification of pathogen by signal analysis PCR-Mass Tag system NUCLEIC ACID CONJUGATED MASS TAGS Photocleavable linker and spacerMS sensitivity enhancer Variable mass unit DETECTION OF 58 DIFFERENT MASS TAGS BY APCI-MS 目前，建立在此技术上的有呼吸道病原体检测模 块（包括19个病毒和3种细菌），流感病毒亚型检 测模块，出血热病原体检测模块，痘疹病毒检测 模块和脑炎脑膜炎病原体检测模块。尽管目前已 开发的分子量标签只有64个，但根据质谱分析的 分子量范围，还可有极大的拓展空间，保证了这 一技术具有足够的发展前景和潜力。 应应 用用 RESPIRATORY SYNDROME PANELRESPIRATORY SYNDROME PANEL Influenza A MatrixInfluenza A Matrix Influenza A N1Influenza A N1 Influenza A N2Influenza A N2 Influenza A H1Influenza A H1 Influenza A H2Influenza A H2 Influenza A H3Influenza A H3 Influenza A H5Influenza A H5 Influenza B HAInfluenza B HA RSV Group ARSV Group A RSV Group BRSV Group B MetapneumovirusMetapneumovirus European strainsEuropean strains American strainsAmerican strains CoVCoV-SARS-SARS CoV-OC43CoV-OC43 CoV-229ECoV-229E HPIV-1HPIV-1 HPIV-2HPIV-2 HPIV-3HPIV-3 HPIV-4HPIV-4 HPIV-4aHPIV-4a HPIV-4bHPIV-4b Chlamydia Chlamydia pneumoniaepneumoniae MycoplasmaMycoplasma pneumoniaepneumoniae LegionellaLegionella pneumophilapneumophila Streptococcus Streptococcus pneumoniaepneumoniae HaemophilusHaemophilus influenzaeinfluenzae l l Influenza A H7Influenza A H7 l l RhinovirusRhinovirus l l Herpes Simplex Virus 1, 2Herpes Simplex Virus 1, 2 l l VaricellaVaricella Zoster Virus Zoster Virus l l CytomegalovirusCytomegalovirus l l HIV-1HIV-1 l l HIV-2HIV-2 l l Measles virusMeasles virus l l Mycobacterium Mycobacterium tuberculosistuberculosis l l PneumocystisPneumocystis cariniicarinii l l CoxiellaCoxiella burnettiburnetti Current Respiratory PanelIn Progress Enterovirus Adenovirus HEMORRHAGIC FEVER PANELHEMORRHAGIC FEVER PANEL Ebola virus (Zaire)Ebola virus (Zaire) Ebola virus (Sudan)Ebola virus (Sudan) Marburg virusMarburg virus Crimean-Congo Crimean-Congo hemorrhagic fever virushemorrhagic fever virus Rift Valley virusRift Valley virus HantaanHantaan virus virus Seoul virusSeoul virus Yellow FeverYellow Fever KyasanurKyasanur Forest virus Forest virus Lassa virusLassa virus (lineage IV) (lineage IV) l l Ebola virus (Reston)Ebola virus (Reston) l l JuninJunin virus virus l l MachupoMachupo virus virus l l DobravaDobrava virus virus l l TacaribeTacaribe virus virus l l GuanaritoGuanarito virus virus l l SabiaSabia virus virus l l LCMVLCMV l l ChikungunyaChikungunya virus virus l l Dengue virus groupDengue virus group l l BorreliaBorrelia burgdorferiburgdorferi l l Herpes Simplex virus (1, 2)Herpes Simplex virus (1, 2) l l HIV-1, -2HIV-1, -2 l l NeisseriaNeisseria meningitidismeningitidis l l RickettsiaRickettsia Spotted Fever Group Spotted Fever Group l l Plasmodium spPlasmodium sp Current PanelIn Progress ACB Lab Network Epidemiology Microbiology research service training infectious agents samples clinical data GLOBAL SURVEILLANCE NETWORK Animal models drugs vaccines Drosten, Hamburg Lipkin, New York Mackenzie, Perth Pauli, Berlin Peiris, Hong Kong Qian, Beijing Perez-Brena, Madrid Swanepoel, South Africa Webster, Memphis Wen, Shanghai Multiplex PCR-XMAPMultiplex PCR-XMAP 多重多重PCR-PCR-液芯联用技术液芯联用技术 DiagramDiagram LUMINEX XMAP技术：多 指标并行检测系 统（流式荧光技 术或液芯技术） 技术 GENOCA Templex PCR技术:多指 标并行扩增 Super Primer Templex PCR技术原理 Templex PCR技术原理 巢示巢示PCRPCR引物提高了引物间的相容性引物提高了引物间的相容性 低浓度的特异性引物降低了反应过程低浓度的特异性引物降低了反应过程 中的背景值中的背景值. . 仅有的一条生物素标记的引物使得更仅有的一条生物素标记的引物使得更 容易扩大生产以及质量控制容易扩大生产以及质量控制 . . 流式荧光技术（液芯）原理XMAP 荧光编码微球技术荧光编码微球技术 每种微球的地址由两 种红色荧光颜料的掺 入比例唯一决定 颜色编码的微球颜色编码的微球 共价交联技术共价交联技术 C O N H 反应模式反应模式 Multiplex Assays Multiplex Assays with Color with Color SeparetionSeparetion Luminex 100多功能流式点阵仪 流式荧光检测仪 呼吸道感染型 11种DNA基因组的病原体 呼吸道感染型 13种RNA基因组病毒型病原体 蛋蛋 白白 质质 芯芯 片片 MASATM液相芯片 一一. . 基本原理基本原理 微小的乳胶颗粒（Beads,微球）分别染成不同 的荧光色，然后再把针对不同检测物的蛋白（ 如抗原抗体）以共价方式结合到特定颜色的微 球上。应用时，先把针对不同检测物的、用不 同颜色编码的微球混合，再加入被检测物（被 测物可以是血清中的抗原、抗体、或酶等）。 固定生物分子的微球固定生物分子的微球 悬浮点阵悬浮点阵 多分析物组合灵活多分析物组合灵活 The Red Laser is Used to Identify the Bead Code The Green Laser is Used to Identify the Reporter Signal 液相芯片的特点： 液相芯片的独特设计使得它拥有常规 的蛋白质检测方法所不具备的特点： 1. 重复性好 2. 通量大 可对同一样本中的多种不同目的分子 同时进行分析在35-60分钟内可对96个不 同样本进行检测 。 3. 3. 灵活性好灵活性好 4. 4. 灵敏度高灵敏度高 5. 5. 信噪比好信噪比好 6. 6. 操作简便，不需洗涤，耗时短操作简便，不需洗涤，耗时短 7.7.液相环境更有利于保持蛋白质的液相环境更有利于保持蛋白质的 天然构象，也更有利于探针和被天然构象，也更有利于探针和被 检测物的反应检测物的反应 Hybridization Time Hybridization Time % % of Maximumof Maximum MinutesMinutes MASATM和ELISA灵敏度的比较 基因芯片（Gene Chip） 何谓基因芯片： 基因芯片（或DNA Chip,或Microarray）又称DNA微阵列，是 指固定在固相载体上的高密度DNA微点阵。即将大量靶基因 或寡核苷酸片段有序地，高密度地（点与点间距一般小于 500m） 排列在玻璃、硅等载体上，称之为基因芯片。 基因芯片的种类： 按应用，基因芯片主要可分为3类：1、表达谱基因芯片：主 要用于基因功能研究；2、诊断基因芯片：如肝癌诊断芯片 、糖尿病诊断芯片、病原体多基因诊断芯片等：3、检测芯 片：如商品检疫芯片、病原体检测芯片等。 Viral Pathogen Custom Microarray 病原体诊断基因芯片 High Sensitivity ScannerHigh Sensitivity Scanner 0.05 0.05 CPSMCPSM CPSM - what does it mean?CPSM - what does it mean? ChromphoresChromphores per square micron per square micron 0.05 0.05 cpsmcpsm or 5 molecules of dye per 10 or 5 molecules of dye per 10 micron pixel.micron pixel. Competitors best is 10 molecules of dye per Competitors best is 10 molecules of dye per 10 micron pixel.10 micron pixel. To achieve high sensitivity:To achieve high sensitivity: Dynamic Dynamic AutofocusAutofocus Laser stability ControlLaser stability Control High resolution scanningHigh resolution scanning 0.05 CPSM Detect 5 dye molecules in 10um pixel 0.1 CPSM Detect 10 dye molecules in 10um pixel eArrayeArray Delivering Custom Content and FormatsDelivering Custom Content and Formats Back Name Your Design Select Array Format Prokaryotic Array Custom Prokaryotic Array Custom Designs Designs Agrobacterium Anopheles (AG) and Plasmodium (PB).ie. malaria microarray Archaeon, Halobacterium sp. Bacillus cereus Bacterial pathogens Bifidobacterium longum Bordetella Pertussis Chlamydophila abortus Culex pipiens Cyanobacterium Synechocystis E.Coli Erwinia carotovora atroseptica/Solanum tuberosum Lactobacillus plantarum Methylobacterium extorquens AM1 Plasmodium falciparum Pseudomonas aeruginosa S.aureus; N.meningococcus; E.coli Salmonella typhimurium Staphylococcus aureus SARS Coronavirus Human Coronavirus OC43 Human Coronavirus 229E GreeneChipGreeneChip 1.1 1.1 CATCTCATCT GGTGGGTG TGGATGGA AGCCAGCC TTATCTTATC GGAAGGAA CAAGCAAG GACCGACC AGAGAGAG CCACCCAC CTGGCTGG GCTGGCTG AGAAAGAA CATCTCATCT A A Sample: WNV NY99 100,000 RNA copies/ml 32/45 top hits are WNV- specific; remainder are JEV group or other flavivirus-genus probes Collaboration between the Greene Laboratory of Columbia University, ICTV , Northeast Biodefense Center, and Agilent Corporation CATCTCATCT GGTGGGTG TGGATGGA AGCCAGCC TTATCTTATC GGAAGGAA CAAGCAAG GACCGACC AGAGAGAG CCACCCAC CTGGCTGG GCTGGCTG AGAAAGAA CATCTCATCT A A Sample: SARS-CoV 100,000 RNA copies/ml GreeneChipGreeneChip 1.1 1.1 Columbia (Briese, Lipkin, Liu, Lussier Palacios), ICTV (Bchen-Osmond), and Agilent (Hirschberg) 251,000 sequence database, 1710 vertebrate viruses 未知新病原体的发现未知新病原体的发现 发现新病毒的主要技术路线发现新病毒的主要技术路线 表达表达cDNAcDNA文库筛选技术文库筛选技术 宽范围宽范围PCRPCR（基于保守序列的（基于保守序列的PCRPCR） 差异显示技术：差异显示技术： 代表性差异分析（代表性差异分析（RDARDA） 抑制性消减杂交（抑制性消减杂交（SSHSSH） 序列非依赖的扩增：序列非依赖的扩增： 随机随机PCRPCR（randomerandome PCR PCR） 序列非依赖的单引物扩增（序列非依赖的单引物扩增（SISPASISPA） cDNAcDNA 文库筛选文库筛选 ppcDNAcDNA文库筛选常被用来检出文库筛选常被用来检出RNARNA病毒的核酸。病毒的核酸。 pp收集病毒颗粒（感染组织匀浆过滤，或者血浆超速收集病毒颗粒（感染组织匀浆过滤，或者血浆超速 离心以收集病毒颗粒），提取离心以收集病毒颗粒），提取RNARNA，逆转录成，逆转录成c c DNA ,DNA ,构成构成c DNAc DNA表达文库。表达文库。 pp最常用的表达型载体是最常用的表达型载体是gt11,gt11,插入的插入的c DNAc DNA片断可以片断可以 融合蛋白形式表达，保留抗原性。融合蛋白形式表达，保留抗原性。 pp病毒在感染过程刺激机体产生特异性抗体，因而常病毒在感染过程刺激机体产生特异性抗体，因而常 用患者恢复期的血清对用患者恢复期的血清对c DNAc DNA库进行免疫学筛选。库进行免疫学筛选。 HCVHCV的发现的发现 pp 19891989年年ChooChoo等小组等小组 pp 从被感染的黑猩猩的血浆中用超离心的方法收集病毒颗粒从被感染的黑猩猩的血浆中用超离心的方法收集病毒颗粒 ，提取核酸（包括，提取核酸（包括RNARNA和和DNADNA），充分变性后逆转录），充分变性后逆转录c c DNADNA，构建，构建gt11 c DNAgt11 c DNA表达文库。表达文库。 pp 用慢性非甲非乙肝炎患者的血清筛选库，结果得到一个反用慢性非甲非乙肝炎患者的血清筛选库，结果得到一个反 应性克隆。应性克隆。 pp 该该c DNAc DNA克隆与正常人的克隆与正常人的DNADNA不杂交，说明他来源于外源不杂交，说明他来源于外源 基因组。基因组。 pp 与被感染黑猩猩的肝组织与被感染黑猩猩的肝组织RNARNA杂交，与未感染黑猩猩的肝杂交，与未感染黑猩猩的肝 组织组织RNARNA不杂交，提示该因子可能就是输血相关肝炎的一不杂交，提示该因子可能就是输血相关肝炎的一 种致病因子。种致病因子。 pp 发现该发现该c DNAc DNA克隆仅与被感染黑猩猩的肝组织克隆仅与被感染黑猩猩的肝组织RNARNA杂交，杂交， 而与而与DNADNA不杂交，提示该因子是一种不杂交，提示该因子是一种RNARNA病毒。序列分病毒。序列分 析表明属于黄病毒科，命名为析表明属于黄病毒科，命名为HCVHCV。 基于保守序列的聚合酶链式反应基于保守序列的聚合酶链式反应 （Consensus Sequence Based PCRConsensus Sequence Based PCR） 基本原理：基于保守序列的聚合酶链式反应（以基本原理：基于保守序列的聚合酶链式反应（以 下简称保守序列下简称保守序列PCRPCR）就是通过已知的一种生物）就是通过已知的一种生物 和另一种生物之间高度保守的和另一种生物之间高度保守的DNADNA序列设计引物序列设计引物 ，用，用PCRPCR的方法去扩增另一种生物的未知的方法去扩增另一种生物的未知DNA DNA 序序 列。当一种未知病毒与可能与另一种已知的病毒列。当一种未知病毒与可能与另一种已知的病毒 相似时，可以根据已知病毒的保守序列设计引物相似时，可以根据已知病毒的保守序列设计引物 ，然后用，然后用PCRPCR方法扩增出未知病毒的相应序列。方法扩增出未知病毒的相应序列。 新型汉坦病毒的发现新型汉坦病毒的发现 19931993年年5 5月，在美国西南部爆发了一场高死亡率的月，在美国西南部爆发了一场高死亡率的 急性呼吸道疾病。血清学试验中发现。病人的血急性呼吸道疾病。血清学试验中发现。病人的血 清能与一些已知的汉坦病毒抗原起交叉反应，提清能与一些已知的汉坦病毒抗原起交叉反应，提 示该病的病原体有可能是一种以前未能发现的新示该病的病原体有可能是一种以前未能发现的新 汉坦病毒。汉坦病毒。 19931993年年NicholNichol等根据已知的汉坦病毒基因组等根据已知的汉坦病毒基因组MM片断片断 的包膜糖蛋白的包膜糖蛋白G2G2编码区的保守部位设计了编码区的保守部位设计了PCRPCR引引 物，扩增出一个物，扩增出一个278bp278bp的的DNADNA片断。序列分析表明片断。序列分析表明 ，与其他个血清型的汉坦病毒至少有，与其他个血清型的汉坦病毒至少有30%30%的不同的不同 源性，在系统发生上与源性，在系统发生上与IVIV型希望山病毒（型希望山病毒（Prospect Prospect Hill Hill virus,PHvirus,PH）最为接近，说明该病毒是一种新的）最为接近，说明该病毒是一种新的 汉坦病毒。汉坦病毒。 基于保守序列的基于保守序列的PCRPCR 技术要点技术要点-引物设计引物设计 一种是一种是简并简并PCRPCR，其所用的是一个混合的引物库，其所用的是一个混合的引物库 ，包含了已知某种病毒高度保守氨基酸区域的所，包含了已知某种病毒高度保守氨基酸区域的所 有可能的核苷酸序列有可能的核苷酸序列 （设计引物之前，列出该病（设计引物之前，列出该病 毒家族所有成员的对比图毒家族所有成员的对比图 ），但简并度很高时有），但简并度很高时有 效引物的浓度不足。效引物的浓度不足。 另一种是根据密码子的另一种是根据密码子的偏向性偏向性设计设计单一的引物单一的引物： 依照高度保守的氨基酸序列，选择每个氨基酸最依照高度保守的氨基酸序列，选择每个氨基酸最 常用的密码子组成一条完整的引物。适用于分离常用的密码子组成一条完整的引物。适用于分离 亲缘关系较近的相关序列，但对亲缘关系较远的亲缘关系较近的相关序列，但对亲缘关系较远的 序列则不能检出。序列则不能检出。 简并引物设计简并引物设计 目前已经可以有计算机软件来设计，常用目前已经可以有计算机软件来设计，常用 的软件有的软件有: : Primo Degenerate 3.4 Primo Degenerate 3.4 GenefisherGenefisher CODEHOP CODEHOP Simple degenerate Simple degenerate primer(Uprimer(U : Oregon) : Oregon) 差异显示技术差异显示技术 （differential display)differential display) 最先是最先是LiangLiang和和PardeePardee等提出用于比较两种细等提出用于比较两种细 胞或同种细胞在不同状态下胞或同种细胞在不同状态下mRNAmRNA表达差异表达差异 的技术的技术; ; 现在已经发展了多种分离和鉴定差别表达现在已经发展了多种分离和鉴定差别表达 基因的技术，其中代表性差异技术基因的技术，其中代表性差异技术(RDA)(RDA)和和 抑制消减杂交技术抑制消减杂交技术(SSH)(SSH)以其灵敏度高、假以其灵敏度高、假 阳性率低和重复性好而相对更受欢迎阳性率低和重复性好而相对更受欢迎 代表性差异分析代表性差异分析 （Representational Difference Representational Difference Analysis ,RDAAnalysis ,RDA） 基本原理：病原微生物感染靶器官或组织基本原理：病原微生物感染靶器官或组织 时，同时带入自己的基因组，这样病理组时，同时带入自己的基因组，这样病理组 织就比正常组织多出了病原体基因组。织就比正常组织多出了病原体基因组。 RDARDA可以把单拷贝的外源基因组从高度复可以把单拷贝的外源基因组从高度复 杂的人染色体杂的人染色体DNADNA本底中检测出来。本底中检测出来。 RDARDA流程流程 分别提取实验组分别提取实验组(Tester)(Tester)和对照组和对照组 (Driver(Driver或驱动子或驱动子) )的总的总RNARNA或者或者DNADNA 用四碱基内切酶充分酶切，分别连上用四碱基内切酶充分酶切，分别连上 寡核苷酸接头，并用特异性的接头引寡核苷酸接头，并用特异性的接头引 物扩增物扩增 扩增产物去除接头，再在实验组扩增扩增产物去除接头，再在实验组扩增 子上连上新接头，将两份扩增子杂交子上连上新接头，将两份扩增子杂交 ，以新接头为引物进行扩增，以新接头为引物进行扩增 只有那些未能与驱动扩增子杂交而自只有那些未能与驱动扩增子杂交而自 身退火的样品身退火的样品DNADNA的两端因都能与引的两端因都能与引 物配对才以指数形式扩增，而待检样物配对才以指数形式扩增，而待检样 品单链品单链DNADNA和驱动样品和驱动样品DNADNA只有一端只有一端 与引物配对而线性扩增与引物配对而线性扩增 GBVGBV病毒的发现病毒的发现 ppGBGB肝炎是肝炎是DeinhardtDeinhardt等在等在19701970年首先报道。后研究年首先报道。后研究 表明表明GBGB肝炎因子不同于甲肝炎因子不同于甲- -戊型肝炎病毒。戊型肝炎病毒。 pp19951995年年SimonsSimons等用等用GBGB肝炎因子感染狨猴取同一狨肝炎因子感染狨猴取同一狨 猴感染前和感染后急性期的血浆，分别提取总猴感染前和感染后急性期的血浆，分别提取总 RNARNA，逆转录成，逆转录成cDNAcDN