《酵母基因工程》PPT课件.pptVIP

第十二章 酵母基因工程 1974 Clarck-Walker和Miklos发现在多数酿酒酵 母中存在质粒。 1978 Hinnen将来自一株酿酒酵母的leu2基因导 入另一株酿酒酵母，弥补了后者leu2的缺陷，标 志着酵母表达系统建立 1981 Hitzeman用酿酒酵母成功表达人IFN。 1983 我国首次用酵母菌表达HBV HBsAg基因。 1996 完成第一个真核生物-酿酒酵母全基因组 测序 一、酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征 酵母菌酵母菌(Yeast)(Yeast)是一群以芽殖或裂殖方式是一群以芽殖或裂殖方式 进行无性繁殖的单细胞真核生物。进行无性繁殖的单细胞真核生物。 二、酵母菌表达外源基因的优二、酵母菌表达外源基因的优 势：势： 全基因组测序，基因表达调控机理清楚，全基因组测序，基因表达调控机理清楚， 遗传操作简便。遗传操作简便。 具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。 大规模发酵工艺简单、成本低廉。大规模发酵工艺简单、成本低廉。 不含特异性病毒、不产毒素，被美国不含特异性病毒、不产毒素，被美国FDAFDA认认 定为安全的基因工程受体系统。定为安全的基因工程受体系统。 能将外源基因表达产物分泌至培养基中。能将外源基因表达产物分泌至培养基中。 不足之处 产物蛋白质的不均一、信号肽加工不完全 、内部降解、多聚体形成等 幻灯片 7 解决内部降解的方法 u在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白 胨或酪蛋白水解物； u将培养基的pH值调成酸性，以抑制中性蛋 白酶的活性； u利用蛋白酶缺失酵母突变体进行外源基因 的表达。 幻灯片 5 第二节 常用酵母表达系统 一、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 表达系统 酿酒酵母中的酿酒酵母中的2 2 环状质粒：环状质粒： A 野生型，双链、环状， 6kb，拷贝数50-100。 同源重组同源重组 B IRs: 反向重复序列，同源重组 FLP: 编码产物驱动IRs同源重组 REPREP: : 编码产物控制质粒稳定性编码产物控制质粒稳定性 STBSTB: : REPREP结合位点结合位点 表达载体可以有自主复制型和整合型两种 。自主复制型质粒含有ARS，不稳定，拷贝 数高。 整合型质粒不含ARS，必需整合，拷贝数低 糖蛋白的核心寡聚糖链含有末端仅 1,3甘 露糖，所以，酿酒酵母常常用来制备亚单 位疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)。 二、甲醇营养型酵母表达系统 u表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基 因一(A0x1)，甲醇为诱导物 u不宜于食品等蛋白生产 u巴斯德毕赤酵母 u生产医药用重组蛋白质 毕赤酵母表达系统的特点 含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启 动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达 表达水平高，即可在胞内表达，又可分泌型表 达。 发酵工艺成熟，易放大。 培养成本低，产物易分离。 外源蛋白基因遗传稳定。 作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的 亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷 酸化等翻译后修饰加工功能。 三、裂殖酵母(Schizogenesis pombe)表达系 统 外源基因产物具有相应天然蛋白质的构象 和活性。 研究较少。 四、酵母菌的转化方法 原生质体转化法 碱金属离子介导转化法 电击转化法 原生质体转化法 在Ca2+和PEG存在下，转化子可达原生质体总 数的1-2%。 对线型和环状DNA的吸收没有特异性。 1个受体细胞可同时接纳多个质粒分子，这种 共转化的原生质体占转化子总数的25-33%； 特点： 原生质体转化法的缺点 ： 转化率受原生质再生率的严重制约。 操作周期长； 2）碱金属离子介导转化法 酵母菌完整细胞经碱金属离子(如Li+)、 PEG、热休克处理后，可高效吸收质粒DNA。 吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA， 二者相差80倍。 共转化现象极为罕见； 特点 ： 3）电击转化法 适用范围广。 酵母菌完整细胞或原生质体可在电击下 吸收质粒DNA。 特性 ： 转化率高，达105/g DNA； 操作方便； 五、用于转化子筛选的标记基因 营养缺陷型互补基因 显性基因 宿主菌：氨基酸或核苷酸生物合成缺陷型突变 如：LEU-、TRP-、HIS-、URA- 营养缺陷型互补基因 载体：携带相应的合成基因 如：leu1/leu2、trp1、his3/his4、ura3 选择压力：不完全培养基 如：YNB、无机盐培养基 编码产物主要是毒性物质的抗性蛋白 显性标记基因 氨基糖苷转移酶 抗G418 氯霉素乙酰转移酶 抗氯霉素 二氢叶酸还原酶 抗氨甲喋呤和磺胺 铜离子螯合物 耐受铜离子 蔗糖转化酶 耐受高浓度蔗糖 乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草剂 标记基因 编码产物 遗传表型 aph cat dhfr cup1 suc2 ilv2 六、利用酵母菌表达外源基因的步骤 克隆重组 酶切线性 转化 筛 选转化子 小规模诱导鉴定表达量 大规模培养以及制备 七、酵母表面展示系统 即把外源靶蛋白基因序列与特定的载体基 因序列融合后导入酵母细胞，利用酿酒酵 母细胞内蛋白转运到膜表面的机制（GPI锚 定）使靶蛋白定位于酵母细胞表面并进行 表达。 幻灯片 26 锚定区域与细胞蛋白的-端共价相连 ，为蛋白与细胞膜提供稳定的连接。 锚定蛋白的-端包含疏水多肽，当细胞蛋白 被合成，前体蛋白通过羧基末端的疏水序列 锚定在内质网膜上，其余蛋白则位于内质网 的内腔中。在极短的时间内，疏水序列在转 酰氨基酶作用下位点裂开并同时被 锚置换，然后蛋白被运输到高尔基体再通过 分泌途径分泌至细胞膜外。在蛋白水解酶作 用下，分泌信号序列被切除，细胞蛋白被 -从细胞膜上释放以锚定形式 与葡聚糖