《无菌检查培训》PPT课件.ppt

无菌检查用培养基的灵敏度检查无菌检查用培养基的灵敏度检查 四川省食品药品检验所四川省食品药品检验所 检查范围检查范围： 无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养 基及改良马丁培养基。基及改良马丁培养基。 目的目的： 确证实验所用培养基是否符合无菌确证实验所用培养基是否符合无菌 性检查及灵敏度检查的要求。性检查及灵敏度检查的要求。 检查时间检查时间： 供试品的无菌检查前或无菌检查同供试品的无菌检查前或无菌检查同 时进行。时进行。 注意注意： 1.1. 培养基配置应使用洁净的玻璃容培养基配置应使用洁净的玻璃容 器，不能使用金属容器。配置好的器，不能使用金属容器。配置好的 培养基应尽快进行灭菌处理，以免培养基应尽快进行灭菌处理，以免 长菌。长菌。 2.2. 灵敏度检查是基于培养基的灭菌灵敏度检查是基于培养基的灭菌 程序已经经过验证。程序已经经过验证。 3. 3. 如果实验室使用的是购买的成品如果实验室使用的是购买的成品 培养基，供应商应随培养基提供相培养基，供应商应随培养基提供相 应批次的培养基质量检测报告，报应批次的培养基质量检测报告，报 告包括培养基的告包括培养基的PHPH值、无菌检查值、无菌检查 结果和促菌生长（灵敏度）试验结结果和促菌生长（灵敏度）试验结 果等项目。同时应注意培养基有效果等项目。同时应注意培养基有效 期。期。 4. 4. 建议在进行正式实验前先完成对建议在进行正式实验前先完成对 培养基质量的检查。如果在进行灵培养基质量的检查。如果在进行灵 敏度试验的同时，也使用该培养基敏度试验的同时，也使用该培养基 进行样品检查，那么，一旦培养基进行样品检查，那么，一旦培养基 的无菌性或灵明度不符合规定，则的无菌性或灵明度不符合规定，则 检验结果应无效。检验结果应无效。 菌种菌种 培养基灵敏度检查所用的菌株传代次培养基灵敏度检查所用的菌株传代次 数不得超过数不得超过5 5代（从菌种保存中心获得代（从菌种保存中心获得 的冷冻干燥菌种为第的冷冻干燥菌种为第0 0代），并采用适代），并采用适 宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株 的生物学特征。实验用菌应是生命活的生物学特征。实验用菌应是生命活 力旺盛的新鲜培养物，至少应是第三力旺盛的新鲜培养物，至少应是第三 代的培养物。代的培养物。 灵敏度检查所需的六种菌灵敏度检查所需的六种菌： 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 CMCC (B)26003CMCC (B)26003 铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌 CMCC (B)10104CMCC (B)10104 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌CMCC (B)63501CMCC (B)63501 生孢梭菌生孢梭菌CMCC(B)64941CMCC(B)64941 白色念珠菌白色念珠菌CMCC(F)98001CMCC(F)98001 黑曲霉黑曲霉CMCC(F)98003CMCC(F)98003 菌液制备菌液制备 1. 1. 接种接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞 菌、枯草芽孢杆菌菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营的新鲜培养物至营 养肉汤或营养琼脂培养基中，养肉汤或营养琼脂培养基中， 3030 3535培养培养18182424小时小时 接种接种生孢梭菌生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇的新鲜培养物至硫乙醇 酸盐流体培养基中，酸盐流体培养基中，30303535培养培养1818 2424小时小时 2. 2. 接种接种白色念珠菌白色念珠菌的新鲜培养物至改的新鲜培养物至改 良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基 中，中，23232828培养培养24244848小时小时 上述培养物用上述培养物用0.90.9无菌氯化钠溶液逐无菌氯化钠溶液逐 管稀释成每管稀释成每1ml1ml含菌数小于含菌数小于100cfu100cfu（ 菌落形成单位）的菌悬液。菌落形成单位）的菌悬液。 3. 3. 接种接种黑曲霉黑曲霉的新鲜培养物至改良的新鲜培养物至改良 马丁斜面琼脂培养基上马丁斜面琼脂培养基上 23232828培养培养5 57 7天，用适量天，用适量0.90.9 无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。 吸出孢子悬液至无菌试管内，用吸出孢子悬液至无菌试管内，用 0.90.9无菌氯化钠溶液逐管稀释成无菌氯化钠溶液逐管稀释成 每每1ml1ml含孢子数小于含孢子数小于100cfu100cfu的孢子的孢子 悬液。悬液。 无菌性检查无菌性检查 在进行灵敏度检查前应先进行在进行灵敏度检查前应先进行 培养基的无菌性检查培养基的无菌性检查 方法：方法：每批培养基随机抽取不每批培养基随机抽取不 少于少于5 5瓶，在相应温度下培养瓶，在相应温度下培养1414 天，应无菌生长。天，应无菌生长。 培养基的灵敏度检查培养基的灵敏度检查 1.1.分别接种小于分别接种小于100cfu100cfu的的 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌、生孢梭菌枯草芽孢杆菌、生孢梭菌 至每管装量为至每管装量为12ml12ml的硫乙醇酸盐流的硫乙醇酸盐流 体培养基中（各接支）体培养基中（各接支） 另取一支不接种作为空白对照，另取一支不接种作为空白对照，3232 3737培养培养3 3天天 2.2.分别接种小于分别接种小于100cfu100cfu的的 白色念珠菌、黑曲霉菌白色念珠菌、黑曲霉菌 至每管装量为至每管装量为9ml9ml的改良马丁培养基的改良马丁培养基 中（各接支）中（各接支） 另取一支不接种作为空白对照，另取一支不接种作为空白对照，2323 28 28 培养天培养天 3.3.逐日观察结果逐日观察结果 结果判断结果判断 1. 1. 空白对照管应无菌生长空白对照管应无菌生长 2. 2. 加菌的培养基管均应生长良好加菌的培养基管均应生长良好 可判断培养基灵敏度检查符合规定可判断培养基灵敏度检查符合规定 注意事项注意事项： 1.1. 配置培养基配置培养基用水应使用满足要求的配制用水应使用满足要求的配制 用水。用水。 2. 2. 微生物的生长繁殖除需要一定的营养物微生物的生长繁殖除需要一定的营养物 质以外，还要求适当的质以外，还要求适当的pHpH范围。不同微生范围。不同微生 物对物对pHpH的要求不一样，霉菌和酵母菌的培的要求不一样，霉菌和酵母菌的培 养基的养基的pHpH是偏酸性的，而细菌和放线菌的是偏酸性的，而细菌和放线菌的 培养基的培养基的pHpH为中性或微碱性的。为中性或微碱性的。 pH pH 测试：培养基冷却后须进行测试：培养基冷却后须进行 pH pH 测试。测试。 如果如果 pH pH 测得值与预期值相差测得值与预期值相差 0.2 0.2 单位，则单位，则 需要酸碱调节。需要酸碱调节。 3. 3. 如对实验结果有怀疑，可如对实验结果有怀疑，可将新、老将新、老 批号培养基在相同的条件下同时进行批号培养基在相同的条件下同时进行 试验。或试验。或设立对照培养基（如进口培设立对照培养基（如进口培 养基）。养基）。 4. 4. 标准菌株（如标准菌株（如 ATCC ATCC 或或NCTCNCTC标准标准 菌株或菌株或CMCCCMCC）及经过准确鉴定的临）及经过准确鉴定的临 床分离菌。床分离菌。试验前对菌种进行传代培试验前对菌种进行传代培 养，对照菌株必须使用新鲜培养物。养，对照菌株必须使用新鲜培养物。 一旦发现对照菌株污染或存在问题，一旦发现对照菌株污染或存在问题， 则应立即更换。则应立即更换。 5. 5. 培养基临用前检查：需气、厌气培养基临用前检查：需气、厌气 菌培养基应在临用前检查，培养基菌培养基应在临用前检查，培养基 上部约上部约1/101/51/101/5处呈现淡红色时可处呈现淡红色时可 以使用，若淡红色部分超过以使用，若淡红色部分超过1/51/5高高 度时，应将培养基用度时，应将培养基用100100水浴加水浴加 热至粉红色消失后，迅速冷却至热至粉红色消失后，迅速冷却至 4545以下再进行实验。只限加热一以下再进行实验。只限加热一 次，全管呈现淡红色时，不得再用次，全管呈现淡红色时，不得再用 。 6.6. 配制好的培养基应保存在配制好的培养基应保存在2 225 25 、避光的环境，一般在三周内使、避光的环境，一般在三周内使 用。生化鉴别用培养基，应在一周用。生化鉴别用培养基，应在一周 内使用；选择性分离鉴别培养基最内使用；选择性分离鉴别培养基最 好当日使用，必要时于冷暗避光处好当日使用，必要时于冷暗避光处 保存，最多不得超过三天。保存，最多不得超过三天。 7.7.各种基础营养培养基，用前应尽各种基础营养培养基，用前应尽 量避免反复加热，多次的加热会使量避免反复加热，多次的加热会使 营养成分被破坏。凡受污染、长过营养成分被破坏。凡受污染