《遗传工程的载体》PPT课件.ppt

遗传工程的载体 随着人们对遗传物质DNA的深入研究，许 多科学家尝试直接用DNA转化原核或真核 生物但成效甚微，理想重组体分子的发生 频率极低。 主要的原因是：外源DNA在宿主细胞连续 增殖的情况下，由于不能自我复制而丢失 ，只有少数被整合到质粒或寄主基因上的 片段才能幸存下来。 DNA能在寄主细胞中得到复制的一个必要条件就是 具备复制起点。细菌和病毒的基因组通常只有一个 复制起点。 这种能够自我复制，而且仅具有一个复制起点的 DNA分子称为复制子( replicon )。 大多数DNA片段不是复制子，因而不能自我复制； DNA分子即使包含复制起点，在外源寄主细胞中也 不一定有功能。 DNA重组技术的优越性在于利用寄主细胞中有复制 功能的复制子作载体，连上理想的外源DNA片段， 然后被送到寄主细胞中。 载体的功能及特征 通常把能携带外源基因进入受体细胞的运载工具 称为基因克隆载体。 载体的功能： 运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 载体应具备的条件： 1.具有针对受体细胞的亲缘 性或亲和性（可转移性） 2.具有与特定受体细胞相适 应的复制位点或整合位点 3.具有较高的外源DNA的载 装能力 4.具有多种单一的核酸内 切酶识别切割位点(多克 隆位点 ) 5.具有合适的筛选标记 质粒载体 质粒（plasmid)是生物细胞内固有的、能独立于 寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核 酸分子，绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封 闭、环状的分子结构，也成CCC-DNA。 质粒常见于原核细菌和真菌中，绝大多数的质粒 是DNA型的；质粒DNA的分子量范围：1 - 300 kb 质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外地游离 状态，但在一定地条件下又会可逆地整合到寄主 染色体上，随着染色体地复制而复制，并通过细 胞分裂传递到后代。 环形双链的质粒 DNA分子具有三种 不同的构型： 共价闭合环DNA（SC 构型）， 开环DNA（OC构型） ， 线性DNA（L构型）， 具有不同的电泳迁移率 ，可在琼脂糖凝胶电泳 中分开。 走在最前的是SCDNA 其后一次是LDNA和 OCDNA。 质粒的复制 质粒是一个独立的复制单元（复制子），带有复制 起始点及其相关的复制元件。 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制； 质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关 系。 有自己的复制起点和控 制复制频率的调控基因 质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制-质粒DNA复制启动控制 orirop （+） Rop RNA II RNA I 3 5 5 3 复制方向 然后在RNA酶H的作用下将 RNAII加工为成熟的引物（ 555个碱基)起始质粒DNA的 合成。 在开始复制时，首先由RNA聚合酶在复制起始位点上游550bp处开始合成一条约 750个核苷酸的RNA分子（称作RNAII）。 在质粒起始复制的过程中，有 一小段RNA分子（称作RNAI) 起负调控作用。 RNAI是由 RNAII基因的反义链编码的， 仅108个碱基。 以E.coli ColE1 质粒为例说明质粒复制 这条RNA分子的5端折叠形成一个富含G 的环与质粒复制起始位点上游约20个碱 基处的富含C的区域配对。 RNAI折叠成三叶草结构，它与RNAII前提结合使后者不能 形成特定的二级结构，从而影响了RNAII与DNA形成稳定的 杂种分子，是质粒DNA的复制不能正常进行。 在细胞中RNAI的半衰期很短，它的浓度是由自由基的剂量 （也就是质粒的拷贝数）决定的。 如果细胞中的拷贝数高于正常水平， RNAI的含量上升， 从而抑制了质粒的DNA的复制。相反，如果细胞中的质粒 拷贝数低于正常的水平， RNAI的含量下降，从而促进了 质粒DNA的复制。 这就是RNAI控制细胞中质粒的拷贝数的方式。 所以根据在每个细胞中的分子数（拷贝 数）多寡，质粒可分为两大复制类型： 严紧型质粒 1 - 3 拷贝 stringent plasmid 松弛型质粒 10 - 60 拷贝 stringent plasmid 一般来说，构建克隆载体是松弛型质粒。 质粒的不相容性（不亲和性） 当两个质粒带有相同的复制起始位点时，它们在复制 和向子细胞的分配中就会产生竞争，如果没有选择， 这两个质粒就不能在同一个细胞共存，这种现象被称 作质粒的不相容性（incompatibility of plasmid)或质 粒的不亲和性（plasmid incompatibility) 。 以大肠杆菌的质粒为例： ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容 pSC101、F、RP4拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相 容 质粒的不相容性：分子机制 两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时 各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质 粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期 和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内 两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时 受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质 粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以 后的细胞分裂周期中更具优势 质粒的改造 天然质粒是指那些没有经过以基因克隆为目标的体 外构建改造的的质粒，往往不能满足分子克隆对载 体的需要，只有按预定目标人工构建的质粒才能成 为优良的载体。 构建一种质粒载体需要考虑以下几个方面： 1.质粒载体的分子量（单位bp）应尽可能小。 分子量小的质粒作载体有很多有点：如容易从寄主细胞 中提取；较能抵抗机械（超声波）切割带来的危害；便于 限制性内切酶的酶切和连接等。 2.应该了解载体上基因位置、限制性内切酶的作用 位点。 如果有可能的话，最好还要了解核苷酸序列。 3.在理想寄主中，载体应该容易繁殖，拷贝数多 ；这样可以得到大量载体和DNA重组分子。 4.载体应该包含一个或两个可供选择的标记性状 （基因），从而可以区别含有载体的转化细胞和 不含有载体的非转化细胞。 5.在载体上有多克隆位点，便于质粒的酶切和外 源DNA片段的克隆。 右图显示了 pBR322质粒上的 四环素抗性基因（ Tcr或Tetr)和氨苄 青霉素抗性基因（ Ampr或ampr）和 对应的酶切位点。 常用的遗传标记基因及其作用机制 1. 四环素抗性基因（ Tetr ，Tcr） Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种 蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素 抗性基因编码一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜 结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。 2. 氨苄青霉素抗性基因（ Ampr ，Apr） Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类 的活性。Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的 酶，可特异地切割氨苄青霉素的内酰胺环，使氨苄青 霉素失活。 3. 氯霉素抗性基因（ Cmlr ，Cmr） Chlorophenicol可结合在核糖体50 S亚基上，阻止蛋白 质合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰 化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。 4.卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor)和G418抗性(G418r) 基因 Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡 萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。 Kanr等抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入 细胞内。 目前常用的质粒载体 1.带有多克隆位点的质粒 多克隆位点是一段人工合成序列，其中含有多个限制性核酸 的切割位点，如下图的Puc18fr 的多克隆位点上有十多个限 制性内切酶的切点。 2.带有噬菌体启动子的质粒 2743 bp MCS PT7 Apr pGEM-3Z PSP6 lacZ ori 许多质粒在多克隆位点 附近带有来自噬菌体（ T3、T7和SP6等）的 启动子。这样在多克隆 位点插入的外源DNA就 可以在体外得到转录。 右上图的大肠杆菌质粒载体 pGEM-3Z的多克隆位点的两边 各有一个来自不同噬菌体的启 动子，可以在两个不同方向转 录插入的DNA片段。 3.表达质粒 表达质粒载体在多克隆位点上的上游有强 启动子，使插入的外源基因可以在细胞内转 录和翻译成蛋白质。 单链噬菌体克隆载体 M13噬菌体 M13是一种丝状的大肠杆菌噬菌体，包含一个单 链的环状DNA分子，全长6407个核苷酸； M13噬菌体并不裂解他们的宿主，受侵染的细胞 可以继续生长和分解并释放出大量的新生的M13 噬菌体； M13噬菌体只有通过细菌外边的性伞毛（蛋白质 丝状物）才能将其DNA注入细菌，因此它只侵染 有性伞毛的大肠杆菌（细胞内有F因子）。 M13噬菌体感染其宿主的过程： +DNA （+）DNA RFDNA RFDNA - DNA II 以噬菌体单链DNA即（+）链作为模板，复制一条 与（+）链互补的（-）链，形成亲本复制型（RF) 的双链M13DNA，然后以这种双链DNA通过复制 或其他复制方式形成大量的RF拷贝。 RF NDA的（-） 链进行转录，产 生病毒mRNAs, 病毒基因II产物 使RF NDA（+） 链上的特定位置 产生一个切口。 滚换复制：以（-） 链为模板连续地合 成后代（+）链 形成的后代（+） 链经切割后组装 形成M13噬菌体 互补补 -半乳糖苷酶（ -gal）是大肠杆菌lacZ基因的产物，当培养 基中的一种色素原（X-gal）被-gal切割后即产生蓝色。 如果大肠杆菌lacZ基因区域（5端）缺失，则只能编码一种 在氨基酸端截短的多肽，形成无稳定活性的不完全酶，称为 受体。 如果M13的lacZ基因在相反的方向缺失，则产生在羧基端截 短的多肽，也无半乳糖苷酶的活性，但这种蛋白质可作为 供体。 受体一旦接受了供体（在体内或体外）即可恢复半乳糖苷酶 的活性，这种现象称为互补( complementation) M13及其宿主的构建 n对M13的构建： nM13上的基因II和基因IV之间存在着非编码区域，因此， 引进一部分lac操纵子序列不影响噬菌体的活力。 III VI I IV II X V VII IX VIII III VI I IV II X V VII IX VIII lacZpolylinker MCS 野生型M13RF-DNA M13mp系列载体 插入成分包含lac启 动子（P)、操纵子 （O)、和-gal基因 氨基端146个氨基酸 的编码 序列（Z， 即供体肽的编码 序 列）等。 还使供体肽的编码序列 里包含有多种限制性内切 酶的识别序列（多克隆位 点MCS），这对供体肽 的互补能力毫无影响。 n对M13寄主的改造： n使寄主细胞中仅包含一个有功能的lacZ基因，而且这个基 因的区域已被删掉。 n当改造的M13侵染这种寄主时，由M13产生的供体能够与 寄主细胞产生的无活性的-gal（ 受体）互作形成一种八 聚体，从而恢复-半乳糖苷酶的活性。 n如果培养基中含有X-gal和诱导物IPTG时，凡是包含半乳 糖苷酶活性的细胞将转变为蓝 色，由于互补作用受侵染 的细胞产生蓝色噬菌斑；反之不含有这种酶活性的细胞 将保持白色。 n如果一个外源DNA 片段插入到M13载体的多克隆位点上 ，阻碍了供体的产生，就观察不到互补现象。 nM13 DNA载体的特点： n使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外 ，这在DNA定向突变中非常有用； nM13重组分子筛选简便； 被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。 而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大 n但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5 kb 噬菌粒 n噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列 、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的 特殊类型的载体。 n噬菌体载体兼具单链噬菌体和质粒的特点。 n噬菌粒载体的特点： n能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞 ； n像质粒那样在受体细胞中自主复制，双链DNA稳定，易于大量 提取； n装载量比常规的M13mp系列要大很多（10 kb），M13mp载体（ 4 kb） n通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA n重组操作简便，筛选容易 双链噬菌体克隆抗体 以大肠杆菌的以大肠杆菌的 噬菌体噬菌体 DNADNA为例：为例： 噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体 噬菌体由DNA（ NDA)和外壳蛋白组成，结构上分为 头部和尾部两部分， NDA集中在头部。 NDA是线状DNA分子全长是48502bp，左右两端 各有12个核苷酸组成的5凸出粘性末端，而且二者 的核苷酸序列互补，即： 5GGGCGGCGACCTNNNN3 3NNNNCCCGCCGCTGGA5 DNA 进入宿主细胞后，粘性末端连接形成环状DNA分 子。通常把能互补连接的粘性末端成为cos位点。 n噬菌体的基因族结构 cos头部合成基因 尾部合成基因 溶菌控制基因 晚期控制基因 DNA合成控制基因 阻遏基因 早期控制基因 阻遏基因 重组基因 l - DNA 删除与整合基因删除与整合基因 根据噬菌体和宿主的关系，把噬菌体分为温和性噬菌体和烈性噬菌体 某种噬菌体感染宿主细胞后，其DNA与宿主染色体DNA整合，一起复 制和传代，无感染其他细胞的能力，这样的噬菌体为温和型噬菌体。带 着种噬菌体的宿主细胞称为溶源性细胞。 溶源性细胞 溶源性细胞在一定的诱导因子作用下，噬菌体 DNA会脱离染色体DNA重新包装成噬菌体颗粒， 释放到宿主外，再去感染其他细胞，此过程被称 为溶源性增殖途径。 有些噬菌体感染宿主细胞后，其DNA不插入染色 体DNA，经过一定时间的潜伏期，就大量增殖新 的颗粒，使宿主细胞破裂，释放出来的噬菌体颗粒 又感染其他细胞，把此过程称为溶菌性增殖途径； 把这样的噬菌体称为烈性噬菌体。 温和性噬菌体不会导致宿主细胞死亡，并且溶源细胞可以 传代，因此温和性噬菌体是构建噬菌体克隆载体很好的材料 噬菌体的侵染 E.coli 吸附LamB受体 注入复制 包装 裂解 在大肠杆菌的的表面有一种外膜蛋白麦芽糖孔蛋白（又 叫噬菌体受体蛋白）受体，可以促进麦芽糖或麦芽糖糊精从 胞外进入细胞。这种蛋白是由大肠杆菌的lamB基因编码的， 它的表达受麦芽糖诱导，同时又受葡萄糖抑制。 噬菌体通过位于尾部顶端的J蛋白与麦芽糖孔蛋白受体互作吸附到大肠杆 菌表面。当噬菌体尾部的组分与大肠杆菌基因编码的甘露糖磷酸转移酶 互作后，噬菌体和受体就形成了一个不可逆的复合体。 噬菌体载体的构建 选用噬菌体作为构建克隆载体材料的依据 1. 噬菌体是一种温和噬菌体。 它对大肠埃希菌具有很高的感染能力，以原噬菌体的形式可长 期潜伏在溶源细胞中，容易保存。在一定的条件下又可转入溶菌生长 途径，进行大量的增殖。 2.能承载比较大的外源DNA片段。 野生型噬菌体头部容许包装DNA分子大小为75%-105%的DNA 片段，约36.4-51kb，而且DNA上约有20kb的区域对噬菌体的生长 不是绝对 需要的，可以缺失或被外源DNA片段代替。 3. DNA分子上有多种限制性核酸内切酶识别位点，便于 多种外源DNA酶切片段的克隆。 构建噬菌体克隆载体的基本策略包括： 在DNA上切去部分非必需的区域；抹去多余的限制性核酸 内切酶切割位点；插入可供选择的标记基因和建立体外 包装系统等 1）利用限制性核酸内切酶切去DNA上的非必需 区 DNA长达48.5kb ，在如此长的DNA分子上，一种限制性核酸内切酶 往往有多个识别 序列。这些限制性核酸内切酶的识别 序列有的在非 必需区内，有的在必需区内，某些限制性核酸内切酶切割时，可以切 去非必需区，但同时也会切去必需区，使DNA上的某些功能消失。 因此对于某种限制性核酸内切酶来说，在构建的克隆载体上只能保 留1-2个识别 序列作为克隆位点，用于插入或替换外源DNA片段。此 外，必须用点突变或甲基化酶处理等方法是必需区内的这种酶的识 别序列失效，以避免外源DNA片段插入必需区。 2.在DNA的非必需区内插入选择标记 基因 噬菌体只容许包装小于51kb个大于36.4kb的DNA片段，不在这个 区间长 度片段的重组DNA不能被包装成噬菌体颗粒，而在外包装过程 中自然被淘汰。这本身就是一种根据重组DNA分子大小进行筛选 的 方法。但这种方法不能区别野生型噬菌体与包装了重组DNA分子的 噬菌体。 野生型的噬菌体不能在P2噬菌体溶源性的细菌中繁殖（Spi+）， 这种生长抑制表型受DNA上的red和gam两个基因控制。若将外源DNA 取代red和gam，重组噬菌体便拥有Spi-表型，能在P2噬菌体溶源性的大 肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑。这种选择标记同样存在局限性 ，只能用P2噬菌体溶源性细胞作为受体菌。 构建噬菌体克隆载体时，最好是在非必需区内插入新的筛选 基因 ，如大肠埃希菌的lacZ基因。用具有lacZ基因的噬菌体克隆载体转染 的受体菌处在含X-gal的培养基上时会出现蓝 色的噬菌斑。 3.建立DNA分子体外包装系统 DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重 组颗粒，方可高效导入受体细胞； 用于体外包装的蛋白质可直接从感染了噬菌体的大 肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互 互补的两部分： 一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时 ，当且仅当这两部分包装蛋白与重组DNA分子混合后，包 装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组DNA污染后 ，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安 全而设计的。 野生型DNA包装的上限为51kb，本身长度为 48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb 时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。 因此缩短野生型DNA的长度，可以提高装载量。 其实野生型DNA上约有40-50%的片段是复制和裂 解所非必需的。根据切除的多少，可将DNA分成 两大类载体： 插入型载体 取代型载体（置换性载体） 粘粒载体（考斯质粒） DNA载体和M13-DNA载体的装载量最大分别为25 kb和1.5 kb，但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源DNA片段 ，考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌 体DNA的装载量。 在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNA的长度 ，就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体DNA与包装有 关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的 长度，同时又能保证重组DNA分