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临床科研设计和方法 从一篇SCI文章中透视其科研设计 熊 清 芳 立题 题目：简明、具体、新颖、醒目、能高度概括 整个研究内容。 题目的内容反映出研究因素、研究对象及试验效 应这三个主要环节及它们之间的联系。 Role of the Coinhibitory Receptor Cytotoxic T Lymphocyte Antigen-4 on Apoptosis-Prone CD8 T Cells in Persistent Hepatitis B Virus Infection 医学科研的程序 基本步骤有5个阶段 1.科研选题 2.科研设计 3.实施方法 4.统计分析 5.总结归纳 1.科研选题 选题是确定所要探索的题目，是科研 的起点，也是关系到科研成败和成 果大小的关键性问题. 基本程序 提出问题文献评估假设形成立项 选 题 题意来自： （1）直觉引起的预想“一闪念” （2）既往的实际经验 （3）从书籍、文献或别人的经验中获 得启示 胰岛素的发现 班廷是加拿大的一位外科医生。童年时他的一 位朋友因患糖尿病而死去，使他对糖尿病有很 深的感受，以后一直试图找到医治糖尿病的方 法。年，他偶然在一本外科杂志上看 到一篇文章，报导结扎胰导管可以使分泌胰酶 的细胞萎缩，而胰岛细胞却不受影响。这篇文 章给了班廷很大启发，他在笔记本上写道：“ 结扎狗的胰导管。等候到个星期使胰腺萎 缩。然后切下胰腺进行抽提。” ，大胆尝试后 。年，胰岛素在临床上应用。班廷由 于这一贡献获得了诺贝尔奖金。 选 题 1、选题要小，开掘要深；不要题目 很大，内容却很单薄。 2、“选题新、方法新、资料新” 3、“新题新做”和“小题大做” 1、创新性原则 2、科学性原则 3、可行性原则 4、效益性原则 5、需要性原则 选题应遵循的原则 文 献 检 索 围绕以下5个问题： （1） 有助于认识本课题意义的文献 （2） 有关本课题的既往研究工作 （3） 本课题研究的现状 （4） 可供借鉴的方法 （5） 关于本课题的不同见解与争论，特 别是与自己假设相反的见解及工作。 CTLA一4作用模式图 CTLA一4 在非T淋巴细胞如NK细胞、巨噬细 胞、肝细胞及脑细胞上几乎不表达 CTLA一4作用模式图 CD28与B7分子结合，可以使IL-2mRNA增加，促 进T细胞活化和增殖，上调免疫反应。 CTLA-4与B7结合后抑制T细胞的增殖与活化，使 细胞周期停滞在G0G1期，不向S期发展。 CTLA-4还可促进T细胞分泌TGF-，下调T细胞的 反应性和细胞因子的分泌，抑制IL-2R基因表 达，减少细胞分泌IL-2，介导不依赖Fas途径的 T细胞凋亡，从而在T细胞应答过程中起负性调 节作用。 CD8 T与CHB关系 CD8 T cells有清除HBV的作用；在 CHB患者中显著下降。（背景） CHB治疗以抑制病毒为主，并有费 用高、耐药、毒性等缺点。 因此以 减少T耐受，从而达到持久的抗病 毒的免疫治疗是非常重要的。（背 景） Bim研究基础和CHB关系 We have identified Bim mediated apoptosis as a key mechanism resulting in the depletion of HBV-specific CD8 T cell responses in CHB. Interruption of this pathway reconstituted multispecific CD8 T-cell responses against HBV, confirming its functional relevance.（前 期工作） Virus-specific CD8 T cells have also been shown to be highly prone to apoptosis in patients with HCV infection.（相关研究） 肝脏T细胞凋亡与Bim关系 We hypothesize that the proapoptotic defects in these hepatotropic viral infections are imposed by the tolerogenic liver environment they target. This is line with recent data showing that the premature death of T cells primed in the liver is Bim-dependent. HBV特异性T细胞与协同抑制信号关系 We postulate that in this setting,virus-specific T cells are driven towards apoptosis by persistent high-dose antigen with insufficient costimulatory signals, outweighed by an excess of coinhibitory signals. HBV特异性T细胞与PD-1关系 One such coinhibitory signal is mediated through the PD-1 pathway, which has been shown to be critical for engendering intrahepatic tolerance and to contribute to the failure of the T-cell response in CHB. Blockade of the PD-1 pathway only results in a partial recovery of some HBV CD8 specificities in a proportion of patients with CHB, implicating a role for additional mediators. CTLA-4 、PD-1与T细胞的关系 Tolerogenic antigen presentation can be mediated through the combination of both PD -1 and cytotoxic T lymphocyte antigen-4 (CTLA-4); the latter coinhibitory receptor has recently been shown to act synergistically （ 协同）with PD-1 to promote T-cell exhaustion in HCV infection. CTLA-4与免疫缺陷的关系 The crucial role of CTLA-4 in peripheral tolerance has been demonstrated in CTLA-4 knockout mice that develop a lethal lymphoproliferative disorder. Conversely,CTLA -4 expression inhibits clearance of a number of pathogens and in particular correlates with reversible immune dysfunction and disease progression in human immunodeficiency virus (HIV) infection. CTLA-4多态性与HBV关系 A role for CTLA-4 in the pathogenesis of HBV disease has been suggested by a study linking single nucleotide polymorphisms of CTLA-4 to the outcome of HBV infection. 文 献 检 索 围绕以下5个问题： （1） 有助于认识本课题意义的文献 （2） 有关本课题的既往研究工作 （3） 本课题研究的现状 （4） 可供借鉴的方法 （5） 关于本课题的不同见解与争论， 特别是与自己假设相反的见解及工作。 医学科研假设 假设的特征 1、科学性 以一定的科学理论为依据，绝不是随意的幻 想和毫无根据的猜测。也就是假设要有两个条 件；事实、科学理论。 2、假定性 它是在观察和实验材料不足的情况下，凭思维活 动做出的，尚有待于实践的检验。 研究假说 1、In this study we examined the propensity of CD8 T cells from patients with CHB to up-regulate CTLA-4. 2、We found a link between the expression of CTLA -4 and the proapoptotic mediator Bim in HBV- specific CD8. 3、Longitudinal study of a cohort of CHB patients commencing antiviral therapy showed that viral load reduction did not reduce CTLA-4 or Bim levels in antiviral T cells. 4、We therefore explored the potential to manipulate this coinhibitory pathway in vitro to restore expansion of HBV-specific CD8 T cells. 2、科研设计 基本要素：被试因素、受试对象、实验效应 如何正确选择三个要素，是科研设计的关键问题 被试因素（处理因素） n1、概念研究者根据研究目的欲施加的能作 用于受试对象并引起直接或间接效应的因素， 称为处理因素。 n2、注意点-（1）确定试验中的重要因素。 （2）确定被试因素与非被试因素。（3）被试 因素必须标准化。 受试对象 n1、正常人的选择。所谓“正常人” 是指排除了影响所研究指标的疾病 和有关因素的同质人群。 n2、病例选择。基本要求是正确诊 断、正确分期和病情的正确判断。 应制定统一的诊断标准。 试验效应 n1、尽可能选择敏感度高、客观性 强、特异度高的指标。 n2、注意观察处理与效应之间的时 序关系。 n3、多选硬指标，少用软指标。 实验设计的基本原则 一、对照原则 二、随 机 原 则 三、重 复 原 则 实验设计的基本原则 一.对照原则：常用的有以下几种 1.空白对照 2.安慰剂对照 3.实验对照：对照组不施加处理因素,但施加某种 与处理因素有关的实验因素. 4.标准对照； 5.历史对照 6.自身对照 7.相互对照 二、随 机 原 则 1、意义；贯彻随机化原则是提高组间均 衡性的一个重要手段,也是资料统计分析时, 进行统计推断的前提. 2、随机化方法. （1）随机抽样:单纯随机抽样,系统抽样,整群 抽样,分层抽样. （2）随机化分配. 可采用随机数字表和随机 排列表来进行.还可以用抽签的方法 ,如预 先规定奇数到实验组,偶数到对照组. 随机化分配虽然能提高比较组间的均衡 性,但不能保证比较组间具有可比性 三、重 复 原 则 重复-指各处理组及对照组的例数(或实 验次数)要有一定的数量.如果例数太少, 有可能把个别情况误认为普遍情况.如果 例数太多造成不必要的浪费. 主要涉及下列几个方面：诊断标准、纳入 标准和排除标准。 研 究 指 标 研究对象:CHB患者（PBMC、肝组织） 研究指标：HBVDNA、ALT、 HbsAg、 CD8 T 细胞、 CD4 T细胞、 r-IFN、CTLA-4、Bim 、 PD-1 (关联性、客观性、灵敏性、特异性、 精确性、观察性) nAll participants were HCV and HIV seronegative and cytomegalovirus (CMV) seropositive. n Patients with CHB were stratified by HBV DNA levels above or below 2,000 IU/mL (determined by real-time polymerase chain reaction PCR), naccording to European Association for the Study of the Liver (EASL) guidelines. nAll CHB patients were treatment-naive at recruitment; na subgroup of seven patients was followed longitudinally after commencing lamivudine and adefovir (Table 2). nHepatitis B s-antigen(HBsAg) was quantitated with the Architect assay. nPaired peripheral blood and liver biopsy specimens(surplus to diagnostic requirements) were obtained from eight patients with CHB (Table 1). 临床试验的伦理学问题 知情同意权和伦理学：The study was approved by the local Ethical Committees and written informed consent was obtained from all patients. 病例特征 研 究 内 容 CHB患者CD8 T细胞中CTLA-4增加 CTLA-4增高的HBV特异性CD8T细胞中Bim水平上升 抗病毒治疗不能降低HBV特异性CD8T细胞CTLA-4和 Bim 的高表达 阻断CTLA-4能减少HBV特异性CD8T细胞耗竭 在乙肝病毒持续感染中CTLA-4 对CD8T细胞的作用 CHB患者CD8 T细胞中CTLA-4增加 1、健康人与CHB患者（空白对照）， CD8T细胞数量、CTLA-4水平、以及CTLA- 4分别与HBVDNA和r-IFN的关系。 2、 CHB患者和感染CMV和EBV患者（标准 对照），外周PBC在体外刺激后， CD8T细 胞数量、CTLA-4水平、以及CTLA-4分别与 HBVDNA和r-IFN的关系。 CTLA-4增高的HBV特异性CD8T细胞中 Bim水平上升 1、 CTLA-4阳性的HBV特异性CD8T细胞与CTLA- 4阴性细胞相比Bim水平差异。 2、阻断CTLA-4后 Bim的改变。 证实CTLA-4通过Bim对HBV特异性CD8T细胞起作 用。 抗病毒治疗不能使HBV特异性CD8T细胞中 高表达的CTLA-4和Bim下降 7例未抗病毒治疗CHB患者用阿德福韦酯 和拉米夫定抗病毒，观察病毒载量、 HbsAg、 HBV特异性CD8T细胞、以及 HBV特异性CD8T细胞中CTLA-4、Bim 的水平。（自身对照） 阻断CTLA-4能恢复HBV特异性CD8T细胞 1、分离CHB患者血中的HBV特异性CD8T细胞， 用CTLA-4阻断剂或者IgG抗体培养，IFN-r 的变化。 2、加入阻断剂后，CHB患者与CMV、EBV感染 者相比， HBV特异性CD8T细胞的反应性改 变。 阻断CTLA-4能恢复HBV特异性CD8T细胞 3、肝脏淋巴细胞分离培养，用CTLA-4阻 断剂，部分不能阻断。 4、有报道，PD-1参与T细胞耐受，加入 PD-1阻断剂，能部分阻断，同时加入 CTLA-4 、 PD-1 阻断剂能完全恢复 HBV特异性CD8T细胞的功能。 研 究 内 容 CHB患者CD8 T细胞中CTLA-4增加 CTLA-4增高的HBV特异性CD8T细胞中Bim水平上升 抗病毒治疗不能降低高表达CTLA-4和 Bim的HBV特异性 CD8T细胞 阻断CTLA-4能恢复HBV特异性CD8T细胞 在乙肝病毒持续感染中CTLA-4 对CD8T细胞的作用 实 验 方 法 nPeripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) Isolation,Culture, and Analysis of Virus-Specific CD8 T Cells. nIntrahepatic Lymphocyte Isolation, Culture, and Functional Assay. nFlow-Cytometric Analysis of Total and Virus-Specific CD8 T Cells. 实 验 方 法 For detection of intracellular CTLA-4 on virus-specific CD8 T cells ex vivo,cells were stained with human leukocyte antigen A2 (HLA-A2)/c18-27, HLA-A2/e183 -191, HLA-A2/e335-343, and HLA-A2/e348-357 HBV dextramers (Immudex)before stimulation with HBV- specific peptides for 4 hours in the presence of Brefeldin A. CMV-specific CD8 T cells were detected by HLA-A2/NLVPMVAYV pentamers (Proimmune).（ 难点） 实 验 方 法 For functional detection of virus-specific CD8 T cells, cells were stimulated with HBV or control viral peptide and cultured for 10 days, supplemented with 20 U/mL IL-2 at 0 and 4 days,restimulated with 1 lM peptide for 16 hours in the presence of 1 lg/mL Brefeldin A (Sigma-Aldrich), and identified by intracellular staining for IFN- c. 统 计 学 方 法 Data were analyzed using the nonparametric Mann-Whitney, Wilcoxon matched pairs test or Spearman correlation coefficient as appropriate(*P 0.05; *P 0.005; *P 0.0005). CD8 T Cells in CHB Have an Enhanced Propensity to Up-Regulate CTLA-4. nBlocking CTLA-4 Can Rescue Functional HBVSpecific CD8 T Cells. s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x- A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x- A1D5G8KbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x- A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w- A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w- A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!p!s&w)z1C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w- A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#p#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq!t*w- A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w- A1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w- z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9Lc