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第四章第四章 分子生物学常用技术分子生物学常用技术 .核酸分子杂交（核酸分子杂交（DNA/DNA or DNA/RNADNA/DNA or DNA/RNA）技术技术 核酸分子杂交技术，是在核酸分子杂交技术，是在19681968年由华盛顿卡内基年由华盛顿卡内基 学院（学院（Cavnegie Cavnegie Institute of WashingtonInstitute of Washington）的的RoyRoy BrittenBritten及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补 的特定核苷酸序列的单链的特定核苷酸序列的单链DNADNA或或RNARNA，当它们混合在一当它们混合在一 起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。 1 1、萨瑟恩、萨瑟恩DNADNA印迹杂交印迹杂交 根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNADNA片片 段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNADNA或或 RNARNA探针的杂交作用检测这些被转移的探针的杂交作用检测这些被转移的DNADNA片段，这种实验方法片段，这种实验方法 叫做叫做DNADNA印迹杂交技术。由于它是由印迹杂交技术。由于它是由E.SouthernE.Southern于于19751975年首先年首先 设计出来的，故又叫设计出来的，故又叫Southern DNA Southern DNA 印迹转移技术。印迹转移技术。 （a） （b） （c） （d） （e） 基因组DNA DNA限制片段 硝酸纤维素滤膜 同探针同源杂交的 基因DNA片段 X光底片 Southern Southern 凝凝 胶转移杂交胶转移杂交 技术技术 Southern DNA Southern DNA 印迹杂交之印迹杂交之X X光显像图片光显像图片 水稻（水稻（OryzaOryza sativa L sativa L.) .)的叶绿体的叶绿体DNADNA分别用核酸内切限制酶分别用核酸内切限制酶BglBgl(A-(A- C)C)、BamHBamH（D-FD-F）、）、EcoREcoR（G-IG-I）、）、和和HindHind（J-LJ-L）消化，加样在含消化，加样在含 有有EtBrEtBr染料的染料的1%1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32 32P P标记的玉米 标记的玉米 psbApsbA探针作探针作SouthernSouthern杂交。杂交。X X光底片中显现的阳性条带光底片中显现的阳性条带 ，表明含有水稻，表明含有水稻 的的psbApsbA基因序列。基因序列。 2 2、诺赛恩、诺赛恩RNARNA印迹技术印迹技术（Northern blottingNorthern blotting） 19791979年，年，J.C.J.C.AlwineAlwine等人发展而来，是将等人发展而来，是将RNARNA分子从电泳凝分子从电泳凝 胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行 核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩DNADNA印迹杂交印迹杂交 技术十分类似，所以叫做技术十分类似，所以叫做诺赛恩诺赛恩RNARNA印迹技术（印迹技术（Northern Northern blottingblotting）。）。 而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后然后 同放射性同位素同放射性同位素125 125I I标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技 标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技 术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（Western blottingWestern blotting）。）。 3 3、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交 斑点印迹杂交（斑点印迹杂交（dot blottingdot blotting）和狭线印迹杂交（和狭线印迹杂交（ slot blotting slot blotting ）是在是在SouthernSouthern印迹杂交的基础上发印迹杂交的基础上发 展的量种类式的快速检测特定核酸（展的量种类式的快速检测特定核酸（DNADNA和和RNARNA）分子分子 的核酸杂交技术。由于在实验的加样过程中使用了特的核酸杂交技术。由于在实验的加样过程中使用了特 殊设计的加样装置，使众多待测样品能够一次同步转殊设计的加样装置，使众多待测样品能够一次同步转 移到杂交滤膜上，并有规律地排列成点阵或线阵。这移到杂交滤膜上，并有规律地排列成点阵或线阵。这 两项技术更适应与核酸样品的定量检测。两项技术更适应与核酸样品的定量检测。 检测重组体克隆的菌落杂交技术检测重组体克隆的菌落杂交技术 4 4、菌落杂交、菌落杂交 核酸杂交常用几种膜的 性能比较 . 蛋白质蛋白质/ /DNADNA、蛋白质蛋白质/ /RNARNA杂交技术 杂交技术 1 1、凝胶阻滞实验（、凝胶阻滞实验（Gel retardation assayGel retardation assay） 又叫又叫DNADNA迁移率变动实验（迁移率变动实验（DNA mobility shift assayDNA mobility shift assay ），），是在是在8080年代初期出现的用于在体外研究年代初期出现的用于在体外研究DNADNA与蛋白质型胡与蛋白质型胡 作用的一种特殊的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点，作用的一种特殊的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点， 也是当前被选作分离纯化特定也是当前被选作分离纯化特定DNADNA结合蛋白质的一种典型的实结合蛋白质的一种典型的实 验方法。验方法。 凝胶阻滞实验的基本原理图凝胶阻滞实验的基本原理图 放射性标记的放射性标记的DNADNA由于同一种细胞蛋白质由于同一种细胞蛋白质B B结合，于是在凝胶结合，于是在凝胶 电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带 A A C C B B 放射自显放射自显 影影 * * * * * * * 凝胶电泳凝胶电泳 放射性标记的放射性标记的DNADNA 细胞蛋白质提取物细胞蛋白质提取物 蛋白质与蛋白质与DNADNA结结 合合 * * * * * * * * * * * B B DNA-DNA-蛋白质结蛋白质结 合物电泳迁移缓合物电泳迁移缓 慢慢 滞后带表明滞后带表明DNADNA与与 蛋白质结合蛋白质结合 (a)(a)(b)(b) ( (c)c) 在凝胶阻滞实验中竞争在凝胶阻滞实验中竞争DNADNA与探针与探针DNADNA之间的竞争作用之间的竞争作用 （a a）没有加入竞争没有加入竞争DNADNA的正常的凝胶阻滞实验，探针的正常的凝胶阻滞实验，探针DNADNA与特异蛋白质结合，出与特异蛋白质结合，出 现阻滞条带；（现阻滞条带；（b b）加入的超量竞争加入的超量竞争DNADNA与探针与探针DNADNA竞争结合同一种蛋白质，阻滞竞争结合同一种蛋白质，阻滞 条带消失；（条带消失；（c c）竞争竞争DNADNA与探针与探针DNADNA分别结合不同的蛋白质，出现同（分别结合不同的蛋白质，出现同（a a）一样的一样的 阻滞条带。阻滞条带。 * * * * * * * * * * * * * * * * 蛋白质与未蛋白质与未 标记的竞争标记的竞争 DNADNA结合结合 凝胶电泳凝胶电泳 放射自显影放射自显影 蛋白质与标蛋白质与标 记的探针记的探针 DNADNA结合结合 * * * * * * * * * * * * * * * * * * 2 2、DNaseDNase足迹实验（footprinting assay） 是一类用于检测与特定蛋白质结合的是一类用于检测与特定蛋白质结合的DNADNA序列的部序列的部 位及特性的专门的实验技术。足迹实验的一个明显优位及特性的专门的实验技术。足迹实验的一个明显优 点是，可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特点是，可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特 定定DNADNA片段之间的结合区域。如果使用较大的片段之间的结合区域。如果使用较大的DNADNA片段片段 ，通过足迹实验便可确定其中不同的核苷酸序列与不，通过足迹实验便可确定其中不同的核苷酸序列与不 同蛋白质因子之间的结合单位的分布状况。如同凝胶同蛋白质因子之间的结合单位的分布状况。如同凝胶 阻滞实验一样，我们也可以加入非标记的竞争阻滞实验一样，我们也可以加入非标记的竞争DNADNA序序 列，列，来消除特定的来消除特定的“足迹足迹”，并据此测定其核苷酸序并据此测定其核苷酸序 列的特异性。列的特异性。 3232 p p 1 5 1 5 1010 * * 1 4 8 1 4 8 1010 * * 加入蛋白质加入蛋白质X X 加入加入DNaseIDNaseI 凝胶电泳放凝胶电泳放 射自显影射自显影 1 1 5 5 1010 A BA B 足迹足迹 (a)(a) (c)(c) (b)(b) DNaseI DNaseI 足迹实验足迹实验 3 3、甲基化干扰实验（、甲基化干扰实验（methyltion methyltion interference assayinterference assay） 根据根据DMSDMS（硫酸二甲酯）能够使硫酸二甲酯）能够使G G残基甲基化，而六氢吡啶又残基甲基化，而六氢吡啶又 能够特异切割甲基化的能够特异切割甲基化的G G残基这一原理，设计出了另一种研残基这一原理，设计出了另一种研 究究DNADNA与蛋白质相互作用的实验方法，即甲基化干扰实验。与蛋白质相互作用的实验方法，即甲基化干扰实验。 这种技术可以检测靶这种技术可以检测靶DNADNA中特异中特异G G残基的优先甲基化对而后的残基的优先甲基化对而后的 蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示 DNADNA与蛋白质之间相互作用的模式。与蛋白质之间相互作用的模式。 DMSDMS化学干扰的主要局限性时，它只能使化学干扰的主要局限性时，它只能使G G残基甲基化。尽管残基甲基化。尽管 如此，它仍不愧为足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴如此，它仍不愧为足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴 定足迹区段中定足迹区段中DNADNA与蛋白质相互作用的精确位置。与蛋白质相互作用的精确位置。 具体操作如下页图所示。具体操作如下页图所示。 G G G G G G G G G G G G mm G G G G G G mm G G G G G G mm G G G G G G mm G G G G G G mm G G G G G G mm DNADNA 局部甲基化局部甲基化 与蛋白质提取物混合与蛋白质提取物混合 与蛋白质结合与蛋白质结合 不与蛋白质结合不与蛋白质结合与蛋白质结合与蛋白质结合 凝胶电泳 与蛋白质结合的与蛋白质结合的DNADNA带含带含 有有和两种类型两种类型DNADNA片片 段段 不能与蛋白质结合的不能与蛋白质结合的DNADNA 带含有全部三种类型带含有全部三种类型DNADNA 片段片段 切除所有结合与不切除所有结合与不 结合蛋白质的结合蛋白质的DNADNA 带，并用六氢吡啶带，并用六氢吡啶 切割甲基化的切割甲基化的GG残残 基基 结合带结合带 非结合带非结合带 缺失的缺失的DNADNA带表带表 明相应明相应GG残基的重残基的重 要意义，它得到要意义，它得到 结合蛋白质的保结合蛋白质的保 护护 甲基化干扰实验甲基化干扰实验 4 4、体内足迹实验、体内足迹实验 G GG G G GG G me G GG G G GG G Me Me Me Me 完整的细胞完整的细胞裸露的裸露的DNADNA DMSDMS 分离DNA并用 六氢吡啶切割 凝胶分析凝胶分析 PCRPCR扩增扩增 受保护的受保护的GG残基残基 应用甲基化保护作用进行的体内足迹实验应用甲基化保护作用进行的体内足迹实验 5、Southwestern杂交 6、Northwestern杂交 .PCR技术 1、基因扩增原理条件 (c)(c) (b)(b) 引物引物2 2 5533 33 33 55 55 ( (d)d) 新引物新引物 5533 靶靶DNADNA的扩增的扩增 (a)(a) 5533 引物引物1 1 3 3 55 3355 引物引物2 2互补链互补链引物引物1 1互补链互补链 单位长度的链单位长度的链 不同长度的链不同长度的链 5 5 3 3 3 3 5 5 引物引物1 1互补链互补链 引物引物2 2互补链互补链 目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出） 聚合酶链式反应示意图聚合酶链式反应示意图 (e)(e) (f)(f) (g)(g) 温度（温度（ ） 时间（时间（minmin ） 9494 7272 6060 9494变性（变性（ 1 1minmin） 60 60 退火退火 （1 1minmin） 72 72 延伸延伸 （1.51.5minmin） 循环循环1 1 循环循环2 2 循环循环3 3 PCRPCR反应的温度循环周期反应的温度循环周期 PCR PCR 反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由DNADNA变性、引变性、引 物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反 应参数是应参数是9494变性变性1 1minmin， 60 60 退火退火1 1minmin， 72 72 延伸延伸1.51.5minmin。如此周而复始，重复进行，直至扩增如此周而复始，重复进行，直至扩增 产物的数量满足实验需求为止。产物的数量满足实验需求为止。 Reaction Condition for a Typical PCR AssayReaction Condition for a Typical PCR Assay Typical PCR Thermal ProfileTypical PCR Thermal Profile *This cycle is normally included in a PCR assay in order to *This cycle is normally inclu