蛋白质的生物合成及其在细胞内的降解.ppt

第三十九章 蛋白质的生物 合成及其在细胞内的降解 提纲提纲 1参与翻译的主要生物大分子 2翻译的一般特征 3翻译的详细机制 1.细菌的蛋白质合成 2.真核生物的细胞质翻译系统 3.细胞器翻译系统 4.古菌的翻译系统 4mRNA的质量控制 5翻译的抑制剂 6蛋白质在细胞内的降解 核糖体的主要功能定位 1.A部位氨酰tRNA结合部位，也称为受 体部位； 2.P部位肽酰tRNA结合部位； 3.E部位空载tRNA临时结合的部位； 4.肽酰转移酶活性部位催化肽键形成的 部位； 5.mRNA结合部位； 6.多肽链离开通道正在延伸的多肽链离 开核糖体的通道； 7.一些可溶性蛋白质因子（起始因子、延伸 因子和终止因子）的结合部位。 核糖体的分类与组成 核糖体的三维结构模型和主要的功能部位 原核细胞核糖体的各种功能部位 细菌核糖体的各种功能部位 真核细胞多聚核糖体的结构 细菌多顺反子mRNA和真核生物单顺反子mRNA的翻译 tRNA的结构与功能 二级结构与三级结构 同工受体tRNA-携带同种氨基酸的不同 tRNA个性- “第二套遗传密码” 某些特殊的tRNAs 1. 起始tRNA: tRNAf Met 和 tRNAiMet 2. 校正tRNA 3. tmRNA 常见的tRNA的个性（大肠杆菌） tRNA个性 丙氨酸 丝氨酸 缬氨酸 谷氨酰胺 苯丙氨酸 异亮氨酸 蛋氨酸 受体茎中的G3:U70碱基对 受体茎中G1:C72、G2:C71、A3:U70碱基对,D 茎中的C11:G24碱基对 反密码子 反密码子,特别是其中的U 反密码子,D环中的G20, 3端的A73 U35 反密码子 一种人工合成的保留有G3:U70的微螺旋仍能携带Ala 氨酰-tRNA合成酶（aaRS ） 两步反应机制： 1. ATP + 氨基酸 (AA) AA-AMP + PPi 2. tRNA + AMP-AA AA-tRNA + AMP 分类 1. 第一类 aaRS 2. 第二类II aaRS 校对机制- 在装载氨基酸水平的质量控制 1. aaRS是对氨基酸“身份”进行检查唯一的场所 2. 核糖体不在乎哪一种氨基酸与tRNA相连 3. 实载的tRNA被修饰后仍然能起作用 4. 装载前和装载后编辑 5. 双筛机制 两类氨酰-tRNA合成酶的催化机理 两类aaRS 第一是单体酶，含有一个平行-折叠核心和由两段同源的氨基酸 一致序列HIGH和KMSKS组成的Rossman折叠，该结构模体参与 ATP的结合和酶的催化。此类 aaRS识别的tRNA个性通常包括反 密码子环内的核苷酸残基和受体茎，一般在受体茎小沟一侧与 tRNA结合，紧握反密码子环，将tRNA接受氨基酸的一端置于活 性中心，最后总是先将氨基酸转移到tRNA 3端腺苷酸的2-OH上 ，然后再通过转酯反应转移到3-OH 。由此类酶催化的氨基酸有 Arg、Cys、Gln、Glu、Ile、Leu、Met、Trp、Tyr和Val。 第二类通常为寡聚酶，具有另外的保守序列，由它们形成三种首 尾相连的同源结构基序，其中第一种参与二聚体的形成，另一种 是 “签名”模体，由7段反平行的折叠、3段相邻的-螺旋和一种 不多见的负责结合核苷酸的折叠组成，由它和第三种结构基序一 起组成了酶活性中心的核心部分。这些酶结合tRNA分子的另一 面（受体茎大沟一侧），识别的个性不包括反密码子环，最后总 是将氨基酸转移到tRNA3-端腺苷酸的3-OH上（苯丙氨酰-tRNA 除外）。由此类酶催化的氨基酸有Ala、Asn、Gly、Asp、His、 Lys、Phe、Pro、Ser和Thr。 aaRS的校对机制 装载前编辑 1.有时aaRS激活错误的氨基酸 2.正确的tRNA与酶的结合诱导aa-AMP的水解，而不是装载 3.aa-AMP被转移到酶的编辑中心而水解 装载后编辑 1.有时 aaRS 激活错误的氨基酸，并将其转移到tRNA上 2.错误的aa-tRNA在被释放之前被转移到酶的编辑中心水解 双筛机制 1.难以建立完美的活性中心 2.活性中心和编辑中心层层把关，排除错误的氨基酸 使用双筛机制的实例-IleRS 一筛：酶活性中心优先结合正确的同源氨基酸，体 积比同源氨基酸大的因为无法进入活性中心首先被 排除； 二筛：酶的编辑中心对错误的非同源氨基酸进行编 辑，大小合适小的误载的氨酰-AMP 或氨酰-tRNA 在校对中心被水解“出局”。 以 IleRS为例，如果Val进入它的活性中心，并发生 了第一步反应，生成Val-AMP，但Val-AMP 会被送 入编辑中心进行编辑，水解误载的Val。由于aaRS 具有内在的校对机制，因此在细胞内形成误载的氨 酰-tRNA的可能性非常低。 氨酰-tRNA合成酶的双筛机制 辅助蛋白因子 蛋白质合成的每一步都需要一些特殊的 可溶性的蛋白质因子的参与，包括起始 因子（IF）、延伸因子（EF）、释放因 子（RF）和核糖体循环因子（RRF）， 它们分别参与肽链合成的起始、延伸、 肽链释放和核糖体循环。其中的某些蛋 白质因子为小G蛋白。 细菌参与翻译的起始因子、延伸因子和终止因子的结构与功能 真核生物参与翻译的起始因子、延伸因子和终止因子的结构与功能 蛋白质生物合成的一般特征 1.mRNA、tRNA和核糖体起相同的作用 2.翻译的极性：阅读mRNA的方向都是从5端3端 ，多肽链生长的方向总是从N-端C-端。 3.三联体密码 4.正确的氨基酸的参入取决于mRNA上的密码子与 tRNA上的反密码子之间的相互作用，与tRNA所 携带的氨基酸无关 5.密码子与反密码子的相互识别遵守摆动规则 6.在核糖体上同源tRNA的识别是诱导契合的过程 兔网质红细胞 3H-Leu 在不同的时段完成标记 纯化全长的多肽 降低温度以降低翻译的速率 证明多肽链生长的方向总是从N-端C-端的实验 使用胰蛋白酶消化，分 离肽段，用放射性对肽 端位置作图 在保温60分钟后分离出的珠蛋白几乎所有的Leu残 基都是带放射性的。而在保温仅几分钟后分离到的 珠蛋白，其带放射性的Leu则集中在肽链的C-端 实验 (1962)：证明正确的氨基酸的 参入与tRNA所携带的氨基酸无关 tRNACys-ACA 反密码子 (识别编码Cys的 UGU 密码子) 无细胞抽取物, 氨基酸,aaRS Cys-tRNACys-ACA 蛋白质含 有Cys RNA模板 UGUGUGUGUG. 使用金属镍催化 剂，去除巯基 Ala-tRNACys-ACA RNA模板 UGUGUGUGUG. 蛋白质含 有Ala 遗传密码的破译 Marshall Nirenberg和Heinrich Matthaei 建立了大肠杆菌无细胞翻译系统 无细胞抽取物 核糖体 各种tRNA 氨基酸 aaRS ATP, GTP + mRNA = 蛋白质 他们使用多聚核苷酸磷酸化酶得到同聚物 破译第一个遗传密码 在1961年，Matthaei发现，当将Poly U加到大肠杆 菌无细胞翻译系统中以后，一种仅由苯丙氨酸组 成的多肽即多聚苯丙氨酸被合成了，这就意味着 他们成功破译出第一个密码子即UUU的密码子。 即：nNDPs (NMP)n + nPi 破译其余的遗传密码 在1964年，由Nirenberg发明的核糖体结合技术使得 遗传密码最终完全得以破译。 该技术是建立在两个基本的事实上：一是人工合成 的三聚核苷酸可以作为模板；二是在无GTP时，三 聚核苷酸可以促进同源的氨酰-tRNA结合在核糖体 上，而不生成蛋白质。这样，利用由核糖体和三聚 核苷酸及其同源的氨酰-tRNA形成的三元复合物能 被硝酸纤维素滤膜吸附的性质，可将结合的氨酰- tRNA与其它没有结合的氨酰-tRNA分开。通过分析 结合在硝酸纤维素滤膜上的氨酰-tRNA上氨基酸的 性质和原来的三聚核苷酸序列可以弄清某种氨基酸 的密码子。 19AAs + 14C-Pro + aaRSs 核糖体结合技术 使用NC滤膜过滤 放射性在滤出液 19AAs + 14C-Phe + aaRSs 使用NC滤膜过滤 放射性留在滤膜上 标准的遗传密码表 遗传密码的主要性质 1. 简并与兼职 2. 密码子的选定不是随机的 3. 通用和例外 4. 不重叠 5. 无标点 6. 同一种氨基酸的不同密码子使用的频率 不尽相同 线粒体内遗传密码的例外 摆动规则 摆动规则由Crick于1966年提出，用来解释一种tRNA反 密码子如何能够识别一种氨基酸的几个同义密码子以 及某些含有稀有碱基（如次黄嘌呤）的反密码子是怎 样识别由正常碱基构成的密码子的现象。 该规则的内容是：密码子在与反密码子之间进行碱基 配对的时候，前两对碱基严格遵守标准的碱基配对规 则，第三对碱基则具有一定的自由度。但并非任何碱 基之间都可以配对，当反密码子第一位碱基是A或C者 ，只能识别一种密码子；第一位碱基是G或U者，则能 识别两种密码子；第一位碱基是I者，则能识别三种密 码子。 摆动规则的意义在于使得在翻译的过程中，tRNA和 mRNA更容易分离。 摆动规则 反密码子第一个碱基密码子第三个碱基 A C G U I U G C、U A、G A、C、U 在核糖体上同源tRNA的 识别是诱导契合的过程 以细菌为例，在A部位上同源tRNA与mRNA的结合诱 导A1492和A1493 从16SrRNA螺旋44的内部环中被挤 出来，同时还造成通用保守的G530从原来的顺式构象 编成反式构象。在新的构象之中，A1493和A1492分别 与密码子/反密码子的前两个碱基对螺旋相互作用，而 G530 同时与反密码子的第二个位置和密码子的第三个 位置相互作用。这些构象诱导变化的结果是密码子/反 密码子的前两个碱校对受到核糖体的检查，以区分正 确的Watson-Crick碱基对和错配的碱基对，而“摇摆”位 置似乎能够容忍摆动规则允许的碱基对。 大肠杆菌在翻译的五个阶段所必需的主要成分 翻译的详细机制 4步骤反应： 1. 氨基酸的活化 2. 起始 3. 延伸 4. 终止和释放 细菌的蛋白质合成 氨基酸的活化 1. fMet-tRNAfMet的形成 2. 其他氨酰-tRNA的形成 起始阶段 1. 起始密码子的识别 2. 起始复合物的形成 延伸阶段：在起始复合物形成以后，翻译即 进入延伸阶段，延伸阶段所发生的主要事件 是进位、转肽和移位且不断的循环。 多肽链合成的终止与释放 起始密码子的识别 细菌翻译系统起始密码子的识别主要是依赖于mRNA 5端的SD序列与16S rRNA3端的反SD序列之间的互 补配对。 SD序列位于起始密码子上游约7个碱基的区域，由 45个碱基组成，富含嘌呤碱基，它是由John Shine 和Lynn Dalgarno在1974年，通过比较多种原核细胞 蛋白质mRNA的5端核苷酸序列之后总结出来的。在 16S rRNA 3端有一段富含嘧啶碱基的序列，可以和 SD序列互补配对，因而被称为反SD序列。 许多实验证明，正是SD序列与反SD序列的互补关系 ，才使得位于mRNA 的SD序列下游的第一个AUG用 作起始密码子。 SD序列和反SD序列 起始复合物的形成 起始复合物的形成与起始密码子的识别紧密联 系在一起，起始阶段的总反应式可写成： 30S + 50S + mRNA + fMet- tRNAfMet +IF1 + IF2 + IF3 + GTP 70SmRNAfMet- tRNAfMet + GDP + Pi + IF1 + IF2 + IF3 在形成的三元复合物中，起始密码子正好处于 P部位，而fMet- tRNAfMet通过密码子与反密码 子的互补作用定位于P部位，A部位是空着的， mRNA像一根细线一样，通过小亚基上弯曲的 通道，将作为模板进行翻译。 无活性的 70S核糖体 SD 序列 30S 起始复合物 70S起始复合物 GDP + Pi 多肽链合成的延伸 每添加一个氨基酸需要三步反应进位、转 肽和移位 三步反应循环多次，循环的次数取决于mRNA上 的密码子的数目 原核生物和真核生物在延伸循环上非常相似 快：15-20个氨基酸/秒 精确：每参入10 000氨基酸出现1个错误 进位 转肽 移位 重复 多肽链合成的延伸 进位 进位是指正确的氨酰-tRNA进入A部位，它是在EF-TuGTP的帮助 下完成的。进位的具体过程是：首先EF-TuGTP和fMet-tRNAfMet 以外的氨酰-tRNA形成三元复合物，随后三元复合物进入A部位； 氨酰-tRNA的结合导致小亚基的构象发生变化，致使16S rRNA上 一段高度保守的碱基与密码子/反密码子复合物前两个碱基对上的 小沟能够紧密地发生作用，有利于确保正确的tRNA的结合。如果 上述相互作用没有能够稳定特定的核糖体构象，进入A部位的错 误氨酰-tRNA 在肽键形成之前被释放。 核糖体上的一个结构域充当EF-Tu的GAP，该功能依赖于密码子/ 反密码子的相互识别而使得进入的氨酰-tRNA相对于大亚基处于 一个正确的位置。一旦正确的氨酰-tRNA进入A部位，EF-Tu所具 有的GTP酶活性就被激活，与它结合的GTP水解成GDP和Pi。当 GTP水解以后，EF-Tu的构象发生较大的变化，这种构象的变化促 进了EF-Tu的释放。而EF-Tu的释放引起氨酰-tRNA在核糖体上的 重新排布，以便于肽键的形成，为进入转肽反应创造条件。释放 出来的EF-TuGDP在EF-Ts的催化下，由细胞质基质的GTP取代 GDP而重新转变成为有活性的EF-TuGTP。 多肽链延伸过程中的进位和移位反应 转肽 当正确的氨酰-tRNA进入A部位以后，紧接着就发生转 肽反应，由转肽酶催化与A部位结合的氨酰-tRNA上的 氨基N亲核进攻与P部位结合的tRNA上的肽酰基或氨 酰基而形成肽键。第一个肽键在甲酰甲硫氨酸和第二 个氨基酸之间形成。 转肽反应牵涉到由23S rRNA上1个高度保守的腺苷酸 参与的酸碱催化。该腺苷酸的周围并没有发现蛋白质 。目前已有充分的证据表明，大肠杆菌的肽酰转移酶 由50S亚基上的23S rRNA承担。 转肽酶活性中心的腺苷酸嘌呤环的一个N通过抽取氨 酰-tRNA的氨基N上的质子而促进转肽反应。A2451在 所有的已知23S rRNA中是绝对保守的，它处于特殊的 微环境中，致使其pKa从7.6下降到4，能够作为广义的 酸碱催化剂发挥作用，被抽取的质子在氨酰-tRNA上 的酯键被切开后，供给P部位上tRNA上的羟基。 蛋白质合成过程中的转肽反应 23S rRNA催化的转肽反应 转肽酶是核酶的主要证据 C 还没有发现一种蛋白质单独或者和其它蛋白质一起催 化肽键的形成； C 小亚基的16S rRNA特殊的区域在A部位和P部位与反密 码子区域相作用。相反，大亚基的23S rRNA与肽酰- tRNA的CCA末端相作用，从而使之位于转肽酶合适的 位置； C 红霉素和氯霉素抑制转肽酶的活性，但某些23S rRNA 序列发生突变的菌株对这两种抗生素具有抗性； C 核糖体的三维结构显示转肽酶的活性中心由RNA组成 ，最近的蛋白质离活性中心有2nm，这样的距离太远， 不可能参与催化； C 人工筛选到的核酶能催化肽键的形成； C 碎片反应。 23S rRNA催化的转肽反应 移位 转肽反应完成以后，P部位的tRNA成为空载的tRNA，空载的 tRNA随后进入E部位，与此同时，移位反应发生了，在A部位上 形成的肽酰-tRNA同与其结合的mRNA一起移动到P部位，这为肽 链延伸的下一轮循环做好了准备。注意在移位反应中，肽酰- tRNA上的反密码子与密码子的相互作用已不再是决定氨基酸特异 性的因素，但是它对于维持移位反应的准确性以保持正确的可读 框至关重要。 移位反应需要EF-G的帮助，EF-G也是一种小G蛋白，其大小、形 状以及电荷分布与和氨酰-tRNA结合的EF-Tu相似。EF-GGTP在A 部位附近与核糖体结合，推动移位反应的进行。EF-G-GTP的结合 可能将带有新生肽链的tRNA从A部位“推”到P部位，与此同时， 空载的tRNA则从P部位转移到E部位。既然tRNA与mRNA通过密 码子/反密码子的碱基配对结合在一起，mRNA也就随之发生移位 。 在移位过程中，GTP并不水解，只是在移位完成以后，核糖体再 次充当EF-G的GAP，导致EF-G水解与其结合的GTP成为GDP和Pi 。一旦GTP被水解，EF-G立刻与核糖体解离。EF-G的解离是下一 轮肽链的延伸反应所必需的，这是因为EF-G和EF-Tu与核糖体的 结合位点部分重叠。在EF-G-GDP从核糖体上释放出来以后，其 分子本身的一个结构域似乎作为自己的GEF以再生出EF-G-GTP。 翻译过程中的分子模拟 EF-Tu和EF-G各自与核糖体结合的相互排斥 多肽链合成的终止与释放 随着肽链的不断延伸，位于mRNA上的终止密码子最 终进入A部位，由于没有相应的氨酰-tRNA的结合， RF1或RF2便识别并结合上去，RF3又是一种小分子G 蛋白，它与GTP形成的复合物RF3GTP促进RF1和RF2 的作用。 一旦释放因子结合到A部位，核糖体上的肽酰转移酶的 活性就会发生改变，它催化肽酰基转移给水分子，导 致肽酰-tRNA的水解，肽链因此被释放出来。随后空载 的tRNA离开核糖体，释放因子因为RF3的GTP酶活性 将结合的GTP水解而得以释放。 最后，在RRF的帮助下，核糖体与mRNA解离，解离 的核糖体进入下一轮翻译。 细菌多肽链合成的终止与释放 损伤mRNA的抢救合成 细菌mRNA一般很快水解，其半寿期较短，因此， mRNA有很大的可能性丢掉了它的3-端。如果这种情 况真的发生了，后果很可能非常严重。不妨设想，假 定一个mRNA分子因此丢失了它的终止密码子（基因 突变也可以导致一个mRNA丧失终止密码子），那么 将没有终止信号促进核糖体的解离。任何与这种有缺 陷的mRNA结合的核糖体当翻译到断裂的末端，将裹 足不前，难以解离。 E. coli和其它细菌已发展了一套专门的机制处理这些无 终止密码子的有缺陷的mRNA，这种机制为反式翻译 。反式翻译不同于一般的顺式翻译，它将两个mRNA 翻译成一条融合的肽链，其中有一个mRNA分子无终 止密码子，另一个mRNA分子是tmRNA。 tmRNA(10Sa RNA)的结构 使用tmRNA 的反式翻译 真核生物的细胞质翻译系 统与细菌翻译系统的差别 核糖体的沉降系数为80S，比原核系统大； mRNA模板的结构差别很大，通常是单顺反子，有帽子和尾 巴，但没有SD序列； 转录和翻译在时空上分离，分别发生在细胞核和细胞质，两 者不存在偶联关系； 起始tRNA不进行甲酰化，也不能进行甲酰化； 只能使用AUG为起始密码子，而且识别起始密码子的机制也 完全不同； 起始阶段不仅消耗GTP，还消耗ATP； 起始因子的种类和结构更为复杂； 肽链延伸的速度低于细菌，大概是每秒钟参入2个氨基酸； 只有2种释放因子； 对抑制剂的敏感性不同。 真核生物的细胞质翻译 系统翻译的详细机制 氨基酸的活化此阶段的反应与细菌翻译系 统没有什么差别，所不同的是起始氨酰-tRNA 并不进行甲酰化。 起始与细菌差别较大 延伸与细菌非常相似 eEF-1 代替 EF-Tu和EF-Ts eEF-2 代替 EF-G 终止与释放与细菌相似，但没有RRF 真核生物的翻译的起始 mRNA的准备和检查 Met-tRNAiMet与核糖体40S小亚基的结合 43S预起始复合物与mRNA复合物结合通过扫 描发现起始密码子 60S 亚基的结合与起始因子的释放 mRNA的准备和检查 E 由于真核系统的mRNA要经历复杂的后加工，所以翻译系统首先 需要对mRNA进行检查，以确保只有加工完好的mRNA才能被用 作模板。参与这一步反应的起始因子为eIF4系列，其中eIF4E为帽 子结合蛋白，专门与mRNA的5端的帽子结合，eIF4G是一种接头 分子，既能与eIF4E结合，又能与结合在3端尾巴上的PABP结合 ，还能结合eIF3，使mRNA的5和3端在空间上相互靠近成环。 E mRNA的环化能很好地解释poly A尾巴为什么能提高翻译的效率 ：一旦核糖体完成翻译通过polyA成环的mRNA，新释放的核糖体 亚基所处的位置恰到好处，非常适合在同一个mRNA分子上重新 启动翻译。在哺乳动物中，PABP结合到一种可以与eIF4A结合的 mRNA结合蛋白PAIP-1上，加强mRNA的5端和3端相互作用 ，有助于核糖体识别并结合到mRNA的5端。一些翻译调控因子 可以直接结合到mRNA的3-UTR，与其它翻译起始因子或者40S核 糖体亚基相互作用，干扰mRNA 5-端和3端的相互作用，阻止或 者减缓mRNA的翻译。 真核生物mRNA成环模型 “扫描模型” 40S小亚基首先识别帽子结构，然后沿着mRNA“迁移” ，这个过程中核糖体可以解开稳定性小于126 kJ的二级 结构，但是稳定性更高的发夹结构则可以阻止核糖体 的迁移。当核糖体迁移到起始密码子AUG的地方就停 止迁移，通常以遇到的第一个AUG为起始密码子，但 是AUG本身并不足以阻止迁移，AUG必须在一个适当 的环境中才能被有效识别，其中最重要的是-4位和+1 位的碱基，在序列NNNPuNNAUGG中的起始密码子可 以被有效识别，在AUG之前第3位的嘌呤，以及紧跟着 AUG的G，都可以影响翻译效率达10倍以上。如果引 导序列比较长，在第一个40S亚基离开起始位点之前， 另一个40S亚基可以识别mRNA的5-端，从而在引导序 列到起