蛋白质及氨基酸的测定.ppt

生物技术第三组 蛋白质存在于一切生物的原生质中，是构 成生物体细胞组织的重要成分，是生命的物 质基础。凡是有生命的物体，无论是动植物 还是微生物，都还有蛋白质。蛋白质与营养 代谢、细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、 物质运转和遗传等密切相关，缺乏蛋白质生 物就不能维持生命。人及动物只能从食物中 得到蛋白质 及其分解代谢产物来构成自身蛋 白质，故蛋白质是人体重要的营养物质，也 是食品中重要的营养成分。 蛋白质是由多种氨基酸结合而成的复杂的高分子 化合物。其中含有的主要化学元素为碳、氢、氧 、氮等，大多数蛋白质还含有硫，某些蛋白质中 还含有微量的磷、铜、铁、碘、锌等元素，但含 氮则是蛋白质区分其他有机化合物的主要标志。 测定食物中蛋白质含量的方法有多种，一般可 分为间接方法和直接方法。 间接方法是通过测定样品中蛋白质的总氮量， 再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质含量 直接方法是根据蛋白质的物理和化学性质，直 接测定蛋白质含量的方法。 测定蛋白质最常用的方法是凯氏定氮法。它是 测定总有机氮的最准确和操作较简便的方法之 一，应用广泛。此外，双缩脲法、紫外吸收法 、考马斯亮蓝G-250法、福林-酚法等也常用于 蛋白质含量测定。 凯氏定氮法 双缩脲法 紫外分光光度法 福林-酚比色法 考马斯亮蓝染料比色法 由19世纪丹麦化学家Kieldahl首先提出。 它是测定蛋白质最常用的方法，也是测定 总有机氮最准确和操作简单的方法之一。 适用范围：此法只限于测定总氮量，然后 乘以蛋白质换算系数，可得蛋白质含量， 由于样品中常含有非蛋白质的含氮化合物 ，因此常将测定的结果称为粗蛋白质含量 。 凯氏定氮法 常量凯氏定氮法 微量凯氏定氮法 半微量凯氏定氮法 自动定氮仪法 常量凯氏定氮法 适用范围：适用于各类食品中蛋白质含量 的测定，也是测定蛋白质含量的国家标准 分析方法。 一 原理： 有机含氮化合物与浓硫酸和催化剂共热消化，氮转化为氨 ，再与硫酸结合成硫酸铵。硫酸铵与强碱反应，放出氨。 将氨蒸馏到过量的标准无机溶液中，再用标准碱溶液进行 滴定。根据测得的氨量，计算样品的总氮量。 A.样品消化 浓硫酸对含氮有机物的消化作用主要是氧化还 原作用，使有机物碳化的同时在高温下又有强氧化 性，能将有机物氧化分解成水和二氧化碳，使氮还 原为氨，氨与硫酸作用生成硫酸铵留在溶液中。 B.蒸馏 在消化完全的样品中加入浓氢氧化钠溶液，加热 蒸馏，生成气态氨。 C.吸收 用硼酸吸收蒸馏所放出的氨气。 D.滴定 标准盐酸或硫酸溶液滴定完全吸收后的溶液 为了加速反应进行，我们常需加入一定量加速剂。 按其效果不同可分为：增温剂、催化剂和氧化剂。 1.增温剂 当温度低于360C时，消化不完全，尤其是杂环氮化 物，会导致分析结果偏低。当温度高于410 C时， 铵盐就会分解，故消化温度最好控制在二者之间。 纯硫酸的沸点是340 C附近，因其温度达不到最适 ，则需要添加增温剂，常用的增温剂有：硫酸钾， 硫酸钠，主要原因是消化过程中硫酸不断被分解， 水分不断逸出使硫酸浓度增大。 注意：加入量不能过大，温度过高会引起已生成的 铵盐分解释放出氨而造成损失。 2.催化剂 其种类繁多，最常用的是硫酸铜。催化剂能降低反 应所需的能量，除此之外硫酸铜还可指示消化终点 的到达和下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。 3.氧化剂 由于氧化剂反应过于激烈，若使用不当易造成氮损 失结果不稳定，常需严格控制它的用量和次数。 常用的有：高氯酸，过氧化氢 A、凯氏烧瓶 规格：50ml、100ml、250ml、500ml、1000ml 特点：瓶颈长、耐高温 B、常量凯氏定氮装置 1、浓硫酸 2、硫酸铜 3、硫酸钾 4、4%硼酸溶液 5、甲基红-溴甲酚绿混合指示剂： 五份0.2%溴甲酚绿、95%乙醇溶液、一份0.2%甲基红乙 醇溶液均匀混合 6、40%NaOH溶液 7、0.1000mol/L盐酸标准溶液 测定 一、消化： 1、称量：准确称取固体样品1.003.00g（视样品含氮量多 少而定）或吸取液体样品10.020.0mL 2、试剂混合：小心将样品移入洁净的500mL凯氏烧瓶中， 加入0.50g硫酸铜、10.0g硫酸钾、20mL浓硫酸（小心）， 轻摇匀，安装消化装置，在凯氏烧瓶口放一漏斗，并将其 倾斜放置于放有石棉网的电炉上。 3、消化：先小火慢慢加热（尽量减少气泡，防止泡沫冲 到瓶颈而造成氮损失），待内容物全部碳化、泡沫消失， 升高温度（保持瓶内液体沸腾）至液体变蓝绿色透明后， 再继续加热微沸30min。 4、冷却：冷却至室温，小心加入200mL蒸馏水，再加入玻 璃珠数粒以防蒸馏时暴沸。 二、蒸馏 1、安装蒸馏装置：按图安装蒸馏装置，装置不能漏气，塞紧 瓶口，冷凝管下端插入吸收瓶液面下（瓶内有50mL 40g/L硼酸 溶液及指示剂23滴） 2、蒸馏：放松夹子，通过漏斗加入70mL400g/LNaOH溶液， 并摇动凯氏烧瓶，至瓶内溶液变为深蓝色或产生黑色沉淀， 再从漏斗中加入100mL蒸馏水，加紧夹子，加热蒸馏，约 30min 3、吸收：硼酸溶液吸收氨后，颜色由淡红色逐渐变成蓝绿色 ，收集吸收瓶中馏出液体积约250mL左右 4、蒸馏完毕：将冷凝管下端提离液面，用蒸馏水冲洗管口， 继续蒸馏1min，用表面皿接几滴馏出液，以纳氏试剂或红色 石蕊试剂检查氨是否蒸馏完毕。如无氨生成，即可停止加热 。 三、滴定 将上述吸收液用0.1000mol/L盐酸标准液直接滴 定至由蓝色变为微红色即为终点，记录盐酸溶液 用量，同时作一试剂空白，记录空白试验消耗盐 酸标准液的体积。 微量凯氏定氮法 1.原理：同常量凯式定量法 2.仪器：微量凯氏定氮法装置 3.试剂：a,b,c,d,e,f（同常量凯氏定氮法） g.0.01000mol/L盐酸标准溶液 4.测定：a.消化（步骤同常量法） b.蒸馏 c.滴定 蒸馏： 1、安置装置：将消化完全的消化液冷却后，全部移入 100mL容量瓶中，定容，摇匀。按图装好装置 2、蒸馏：准确移取消化液10mL与试管内，经漏斗再加 入10mL 400g/LNaOH溶液使呈碱性，用少量蒸馏水洗 漏斗数次，夹好漏斗夹，进行水蒸气蒸馏。冷凝管下 端预先插入盛有10mL 40g/L(或20g/L)硼酸吸收液的液 面下。 3、蒸馏结束：蒸馏至吸收液中所加的混合指示剂变为 绿色开始计时，继续蒸馏10min后将冷凝管尖端提离 液面再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管尖端后停止 蒸馏。 滴定： 流出液用0.01000mol/L盐酸标准溶液滴定至微红 色为终点。同时做试剂空白试验。 5.结果计算 同常量凯式定氮法 注意事项 1、水蒸气发生器内装无氮蒸馏水至2/3容积 处。 2、在蒸馏时，水蒸气发生要均匀充足，蒸馏 过程中不得停火断气，否则将发生倒吸。 3、加碱要足量，操作要迅速。 4、漏斗应用水封措施，以免氮由此逸出损失 。 双缩脲法测定蛋白质含量 实验目的 了解和掌握双缩脲测定蛋白质浓度的原理和方法 实验原理 蛋白质在强碱性溶液中与稀硫酸铜作用产生颜 色反应，生产紫红色配合物，称为双缩脲反应。蛋 白质分子中含有的肽键与双缩脲结构相似，因此也 能发生上述反应，生成紫红色配合物。 优缺点 不受温度影响，但灵敏度低 仪器：分光光度计；离心机 试剂：碱性硫酸铜溶液；四氯化碳 1、蛋白质在强碱性溶液中与稀硫酸铜作用产生颜色反 应，生产紫红色化合物，称为双缩脲反应。 2、具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应 ，蛋白质在碱性溶液中，能与Cu2+形成紫红色络合物 ，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可以用来测定蛋 白质的浓度。 3、在一定的浓度范围内，颜色的深浅与蛋白质含量呈 线性关系。因此可用比色法测定蛋白质浓度 当脲被小心加热至150-160时，可由两个分子间 脱去一个氨分子而生成双缩脲反应方程式如下： 双缩脲在碱性条件下与少量硫酸铜溶液作用生成 紫红色的配合物，此反应称为双缩脲反应 1.标准曲线的绘制 以采用凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品作为标准蛋白质 样按蛋白质含量40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg 、110mg分别称取混合均匀的标准蛋白质样于8支50mL纳氏比色 管中，然后各加上1mL四氯化碳，再用碱性硫酸铜溶液准确稀释 至50mL，振摇10min，静置1h，取上层清液离心5min，取离心后 的透明液于比色皿中，在560nm波长下以蒸馏水作参比液调节仪 器零点并测定各溶液的吸光度值A。以蛋白质的含量为横坐标， 吸光度值A为纵坐标绘制标准曲线 2.样品的测定 准确称取适量样品（即使得蛋白质含量在40-110mg之间） 于50mL纳氏比色管中，加1ml四氯化碳，按上述步骤显色后，在 相同条件下测其吸光度值A。用测得的A值在标准曲线上即可查 得蛋白质毫克数，进而由此求得样品中的蛋白质含量。 结果计算： 式中 C由标准曲线上查的的蛋白质含量，mg M样品质量，g 说明： 不同种类的蛋白质，对发色程度的影响不大 含脂肪量高的样品应先进行脱脂处理 若样品中含有不溶性成分时，会对比色带来困难，此 时可预先将蛋白质抽出后在进行测定 类脂、色素等要干扰比色，测定时注意消除干扰。 读数时要注意读的是A的值； 注意正确标记试管（用记号笔清晰标记于试 管2/3高处）； 准确记时。 注意事项 蛋白质及其降解产物的芳香环残基在紫外区对 280nm波长的光具有选择吸收作用。在此波长下， 光吸收程度与蛋白质浓度（3-8mg/mL）成线性关系 。因此，通过测定蛋白质溶液的吸光度，可求出样 品蛋白质含量。 紫外分光光度计法 紫外分光光度计 离心机（3000-5000r/min） 所需试剂 95%乙醇 无水乙醚 0.1mol/L柠檬酸水溶液 8mol/L尿素的2mol/L氢氧化钠溶液 1、绘制标准曲线 准备称取样品2.00g置于50ml烧杯中，加入 0.1mol/L柠檬酸溶液30mL，不断搅拌10min钟使其 充分溶解，使四层纱布过滤于玻璃离心管中，以 30005000r/min的速度离心510min，倾出上清液 。 分别吸取0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、 2.5mL、3.0mL于10mL容量瓶中，各加入8mol/L尿素 的2mol/L氢氧化钠溶液定容至刻度，充分震摇 2min,若浑浊，再次离心至透明为止。 2.样品的测定 准确称取试样1.00g,处理后使其蛋白质浓度为38mg/L ，然后按的步骤测定其吸光度，再从标准曲线中查出蛋 白质的含量。 .将透明液置于比色皿中，以8mol/L尿素的 2mol/L氢氧化钠溶液作参比液，在280nm波长 处测定各溶液的吸光度值A。以凯式定氮法测 得样品中蛋白质的质量为横坐标，上述吸光度 值A为纵坐标，绘制标准曲线。 本法操作简单迅速，适用于测定小麦面粉，糕点， 豆类，蛋黄，及肉制品中蛋白质的含量。 温度对蛋白质水解有影响，操作温度应该控制在20 -30摄氏度之间。 本法由于许多非蛋白质成分在紫外光区有吸收作用 ，加之光散射作用的干扰，故在食品分析领域中的 应用并不广泛。 蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或 色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的 磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨 蓝化合物），蓝色的深浅与蛋白质的含量 成正比，可用比色法测定。 实验原理 吸取一定量的样品稀释液，加入福林 酚试剂甲3.00ml，置于25中水浴保温10min， 再加入福利-酚试剂乙0.3ml，立即混匀，保温 30min，以介质溶液调零，于750nm波长下测定溶 液的吸光度A，与蛋白质标准液作对照，求出样 品的蛋白质含量。 本法在060mg/L蛋白质范围内呈良好的线性关系 。 福林-酚法的灵敏度比双缩脲法高100倍，肽键显 色效果增强，减少了因蛋白质种类引起的偏差。 该法由于两步呈色反应可以叠加，其灵敏度特别 高，所以适用于20250ug微量蛋白质的测定，可检 测的最低蛋白质量为 福林-酚法试剂配置繁琐耗时。 酚试剂仅在酸性条件下稳定，由于此实验的反应 只在PH=10时才发生，所以加酚试剂时必须立即混 匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏前即能发生还 原反应，否则会使显色程度减弱。 说明： 考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法 测定蛋白质浓度，是利用蛋白质染料结合的原 理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方 法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的 突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法 是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋 白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的 位置，由465 nm变为 595 nm，溶液的颜色 也由棕黑色变为蓝色。通过测定595 nm处 光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量 。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱 性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸 残基相结合。 1、牛血清蛋白标准液：精确称取牛血清蛋白10mg, 用蒸馏水配成100ug/ml的标准溶液。 2、染料试剂：称取考马斯亮蓝G-250 60mg溶于 100ml 3%过滤酸溶液中，滤去未溶解的染料，储于 棕色瓶中。 测定 吸取样品稀释液2ml，加染料试剂2ml,混匀，以介质 溶液调零，于620nm波长下测定的吸光度A，与蛋白质标 准液对照，求出样品蛋白质含量。 考马斯亮蓝染色法的突出优点是： (1)灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低 蛋白质检测量可达1 mg。这是因为蛋白质与染料结 合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有 更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变 化比Lowry法要大的多。 (2)测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个 样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白 质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色 可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间 ，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那 样费时和严格地控制时间。 缺点： (1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量 不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有 较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g球蛋白为 标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 (2)仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有 ：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)等。 (3)干扰素物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+ 、Tris缓冲液、甘油等均不干扰此测定法。 注意事项 在试剂加入后的5-20 min内测定光吸收，因为在这段 时间内颜色是最稳定的。 测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁 上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。 利用考马斯亮蓝法分析蛋白必须要掌握好分光光度计 的正确使用，重复测定吸光度时，比色杯一定要冲洗 干净，制作蛋白标准曲线的时候，蛋白标准品最好是 从低浓度到高浓度测定，防止误差。 1、单指示剂甲醛滴定法 2、双指示剂甲醛滴定法 3、电位滴定法 4、茚三铜比色法 5、挥发性盐基氮的测定 单指示剂甲醛滴定法 优点：简单易行，快速方便 缺点：Pro与甲醛作用时产生不稳定的化合物， 使结果偏低；Tyr含有酚羟基，滴定时会消消耗 一些碱使结果偏高；溶液中有铵则可与甲醛反应 使结果偏高。 适用范围：用于各类样品游离AA含量的测定 由于本法采用了0.1%百里酚酞作指 示剂，样液需先用NaOH标准溶液滴定到淡蓝色 后再加40%中性甲醛，若不中和则会造成测定结 果误差。 原理 由于氨基酸为两性结构，向AA的溶液 中加入甲醛溶液，十七碱性消失，这时可 以用标准强碱溶液滴定，后计算出AA的量 。 试剂 40%中性甲醛溶液（用百里酚酞作指示剂 ，用NaOH将40%甲醛中和至淡蓝色） 0.1%百里酚酞乙醇溶液 0.1mol/LNaOH标准溶液 测定 1、吸取待测液50mL于250mL锥形瓶中， 加 0.1%百里酚酞指示剂23滴 2、用0.1mol/LNaOH标准溶液滴定到淡蓝 色，再加40%中性甲醛溶液20mL 3、摇匀静止1min,继续用0.1mol/LNaOH 标准溶液滴定至淡蓝色，记录第二次滴定所消 耗的NaOH溶液的体积V. 双指示剂甲醛滴定法 原理 氨基酸具有酸性的COOH基和碱性的NH2基 。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时， NH2与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶 液来滴定COOH基，并用间接的方法测定氨基酸总量。 试剂 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将40%甲醛 中和至淡蓝色。 百里酚酞乙醇溶液：1g/L。 中性红50%乙醇溶液：1g/L。 氢氧化钠标准溶液：0.1mol/L 操作方法 移取含氨基酸约2030mg的样品溶液两份，分 别置于250mL锥形瓶中，各加50mL蒸馏水，其中 一份加入3滴中性红指示剂，用0.1mol/LNaOH标 准溶液滴定至由红变为琥珀色为终点；另一份加 入3滴百里酚酞指示剂及中性甲醛20mL，摇匀， 静置1min，用0.1mol/LNaOH标准溶液滴定至淡蓝 色为终点。分别记录两次所消耗的碱液体（mL） 。 结果计算 式中 X-氨基酸态氮的含量，g/100g； c -氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L； V1-用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠 标准溶液体积，mL； V2-用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化 钠标准溶液体积，mL； m-测定用样品溶液相当于样品的质量，g ； 0.014-氮的毫摩尔质量，g/mmoL。 电位滴定法 (1) 原理 根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性， 使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插入 被测液中构成电池，用氢氧化钠标准溶液滴定，依据酸度计指 示的pH值判断和控制滴定终点。 (2) 试剂试剂 酚酞乙醇指示液：1% 硼砂（标准物质）缓冲液：PH9.22 称取3.8克Na2B4O7 溶解后，定容至1000mL 中性甲醛溶液：% 氢氧化钠标准溶液：0.0500mol/ (4) 试验步骤 吸取含氨基酸约20mg的样品溶液，置于100mL容量 瓶中，加水至刻度，混匀后吸取20.0mL置于200mL烧杯 中，加水60mL，开动磁力搅拌器，用0.05mol/L氢氧化 钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2（记下消耗 0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的毫升数，可计算总酸含 量）。 加入10.0mL甲醛溶液，混匀。再用0.05mol/L氢氧 化钠标准的溶液继续滴定至pH9.2，记下消耗 0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的毫升数。 同时取80mL蒸馏水置于另一200mL洁净