关于western和酶切的问题.doc

4. Western Blot 定量分析（1）肾脏组织总蛋白的提取1）用4的0.01M PBS 稀释10细胞裂解液。取300l/EP管，标记，置冰上。2）从-80冰箱中取出约50mg冰冻组织，置于液氮中速冻。研磨后移入EP管；3）每个EP管中加入300mL细胞蛋白裂解液，反复吹打混匀，振荡器振荡15s，冰上静置反应20min；4）低温快速离心收集管壁残液；5）用UP200S超声粉碎仪在冰上进行超声粉碎，500Wx30s，以剪切DNA，降低粘稠度；6）低温(4)离心12000转15min，留取上清； 7）取2mL上清，测定蛋白浓度，其余分装后储于-80备用。(2) 基侧膜蛋白提取：取足量肾皮质于冰蔗糖（250mmol/l蔗糖，5mmol/l tris-hepes,pH 7.4, 0.1mg/ml PMSF）缓冲液，离心1200gx15min；留上层物，离心22000gx15min；将松散的上层悬于蔗糖缓冲液，吹打均匀，并加入Percoll，离心39250gx30min，保留最暗的一层，用KCL缓冲液（85mmol/l KCl, 83mmol/l 蔗糖，2mmol/l trishepes，pH7.4）清洗3次，最后将膜蛋白提取物重悬于250mmol/l甘露醇缓冲液（250mmol/l 甘露醇，10mmol/l tris-hepes, pH 7.4, 0.1mg/ml PMSF）。基侧膜成分以Na-K-ATPase活性鉴定，该酶在基侧膜活性比在匀浆中活性可高10倍【50】。 （2）蛋白浓度的测定1）标准曲线的绘制：将牛血清白蛋白（BSA）标准品用无菌生理盐水稀释成0l/ml、12.5l/ml、25l/ml、50l/ml、100l/ml、200l/ml共六管蛋白标准品。在核酸蛋白测定仪上设定相应的参数，以无菌生理盐水为空白管调零，在仪器上测定上述各管蛋白标准液的A值，然后绘制成标准曲线。2）样品蛋白浓度的检测：取2l蛋白样品溶液加入无菌生理盐水98l中，在仪器上测定A值，根据标准取曲线及稀释倍数即可得出样品总蛋白浓度。（3）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1）按Bio-Rad 说明书装好电泳用的玻璃装置2）灌注分离胶和积层胶：分离胶 水 1.9ml30%丙烯酰胺 1.7ml 1.5M Tris HCL 1.3ml 10%SDS 0.05ml 10%过硫酸氨 0.005ml TEMED 0.005ml (灌胶前加)按上述成分和比例混匀，先加分离胶至玻璃缘下2cm 左右（预留梳子1cm 和积层胶1cm 左右），去离子水覆盖。1020min 待分离胶聚合后，可见凝胶和水层之间明显的界面。积层胶水 1.4ml30%丙烯酰胺 0.33ml1.0M Tris-HCL 0.25ml10%SDS 0.05ml 0.02ml10%过硫酸氨 0.002mlTEMED 0.005ml (灌胶前加)灌积层胶：待分离胶聚合后倒掉去离子水，加按上述成分和比例混匀的积层胶。插入梳子，避免气泡混入。放置至凝胶完全聚合。3）样品准备：2上样缓冲液和蛋白溶液按体积1：1 混匀，100加热10min，瞬时离心。4）电泳：待浓缩胶完全聚合后，小心拔出梳子，去离子水冲洗梳孔，吸去多余水分。将玻璃板固定于垂直电泳槽中，充满1电泳缓冲液。按照预定的上样顺序，每样本20l，上样完毕在剩余的加样孔中加入等体积1SDS上样缓冲液。积层胶电压90V，待蛋白在积层胶和分离胶交界线压薄后，换成电压140V 至溴酚蓝达分离胶底部，结束电泳。5）转膜：将与分离胶大小一致的NC 膜100甲醇中浸泡1min，与分离胶、滤纸垫和海绵垫一起放入预冷的1转膜缓冲液中15min。按操作说明安装转膜系统：从负极到正极依次为海绵垫、滤纸垫、分离胶、NC 膜、滤纸垫和海绵垫。充满预冷的1转膜缓冲液，在负极侧放入冰盒，以维持转膜系统温度不致太高。恒压100V，转90min。6）抗原抗体反应：电转结束后，取出NC 膜，标记正反面后在TBS 中漂洗。7）丽春红溶液染膜2min，去离子水漂洗，可以看到红染的分子量大小不一的蛋白。TBST 洗去丽春红。8）5脱脂奶粉室温下阻断60min，TBST 洗，10min3 次。9）孵育一抗：分别加入1：800 一抗稀释液 稀释的兔抗大鼠OAT1多克隆抗体，1:400一抗稀释液稀释的兔抗大鼠OAT3多克窿抗体和1:1000 TBST 稀释的-actin。4振荡过夜后，TBST 洗，10min3次。10）孵育二抗：加入1：1000 5脱脂奶粉稀释的HRP 标记的抗兔二抗，室温下孵育60min 后，TBST 洗，10min3 次。11）显影检测：按Phototope-HRP Western Blot Detection System（CST，USA）操作规范，去离子水稀释20X LumiGLO 和20xPeroxide 成1x工作液。把NC 膜浸入ECL 发光液1min，滤纸吸除过多水份，保鲜膜包裹后放入暗盒。暗室中把KODAK胶片放入暗盒，曝光1min。然后放入自动洗片机中冲洗和烤干。12）图像分析：在凝胶成像和化学发光图像分析系统上扫描和进行灰度分析。5.Na,K-ATPase活性：按照南京建成生物研究所Na-K-ATPase活性试剂盒说明书测定基侧膜Na，K-ATPase活性小弟是新人，最近要用Xho和Hind酶切pGL2载体的MCS，由于两种酶的Buffer不一样所以只好分开两次酶切。设第一次酶切的体系为20l，那反应后怎样才能回收这20l中的载体以用作第二次酶切的底物呢？谢谢！我是直接用1/10醋酸钠（PH5.2），2倍体积的无水乙醇直接沉淀过夜或者35个小时，然后离心，晾干，水溶后再用第二个酶进行切割。第一， 一般建议同时进行双酶切（在两种酶有通用buffer的情况下）第二，采用酒精沉淀的方法。（1）在你第一次酶切后的产物中直接加入2.5-3倍体积的95%的乙醇，同时还要加入十分之一体积的3M的醋酸钠（PH=5.2),混匀 放入-20度冻几个小时或者过夜都没有关系（2）13000RPM离心，倾倒出上清（但建议你最好用枪头慢慢吸取上清，以免DNA有损失），应该可以看到颗粒状的贴壁沉淀物（3）再加入一定量的70% 乙醇，轻轻洗涤沉淀后，离心去上清（同上面）（4）超静台里吹干（不能太干，10分钟左右就好），水溶，加入第二种酶切体系对于第二次酶切产物，建议用回收试剂盒回收纯化，这样的话，DNA的损失是不大的第三，可以对第一次的酶切采取去另酸化处理，然后再进行二次酶切，这样也可以酶切充分的以上三种方法，你可以根据具体条件进行选择没必要，第一次酶切完后高温使酶失活（具体温度要看酶的失活温度），然后再加入第二个酶及buffer，两种酶的使用先后应该视所用的buffer而定，先用盐离子浓度低的酶切再用盐离子浓度高的酶切酶切，如果要使用两种BUFFER不一样的酶进行酶切，则应该先用盐浓度低的再用盐浓度高的去切。系统配好好，放37温箱4个小时，4小时后取出，加入第二个酶系统，记得扣除先前加的那些液体的量，具体操作见我的那个本子。北大徐国恒教授做westernBLOT 的心得“1， 样品制备尽量用标准的protocol，因为步骤越多，则越容易出错。蛋白样品制备步骤过于繁琐，是很多新手失败的原因。2， 忠告，不要用所谓的蛋白制备方法，把所有的蛋白裂解在loading buffer里就可以了。3， 抗体浓度高，可能是做不出来的主要原因。商品化的抗体很少做不出来。要是浓度太高了，背景可能漆黑一片。建议一抗1：1000-1：2000，二抗1：40001：10000.4， 关于转膜液中加入SDS，最好不要这样做。标准的做法是转膜前洗胶，把SDS洗掉。因为加SDS可能增加某些大分子150kd蛋白的溶解度，但是小分子则可能就此穿膜而过。5， 转膜前的泡胶最好小于十分钟，因为过小的蛋白可能被洗去，要小心。6， 电转的问题，电泳的时候最好用恒压80-100 2h（不要小于两个小时。），但是转膜的时候最好用恒流，200-400mA，保证充足的电流和时间。虽然低温有利于保存抗原性，但是稍高一点也没太大损失。（不正规操作，慎）、7， 转膜最好用硝酸纤维素膜。8， 关于多余条带。含天冬氨酸脯氨酸的蛋白，如IL-10，容易在偏酸性的条件下加热降解，样品bufferPH中性即可避免，应尽量避免过分煮沸2-5分钟即可。热变性是非常重要的，甚至重要过sds变性。9， 在转膜液中需不需要加甲醇，甲醇可防止大于20%的凝胶在水中膨胀变形，但小于15%的胶，不轻易变