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分子杂交技术 一、分子杂交种类 二、分子杂交的一般程序 三、杂交样品膜的制备 四、标记探针的制备 五、分子杂交与结果检测 六、核酸分子杂交实验因素的优化 分子杂交技术 o 分子生物学中用于检测生物样本中是否含有特定的生物 分子的一门技术。 样 品 制 备 电 泳 杂 交 转 膜 结果显示 探 针 制 备 分 子 杂 交 流 程 图 核酸分子杂交 一. 分子杂交种类 1. 按其分子种类划分 1） DNA杂交探针为DNA或RNA 2） RNA杂交探针为DNA或cDNA 3） 蛋白质免疫分析探针为抗体 2. 按样品制备过程划分 1） 原位杂交(in situ hybridization) i. 原位菌落杂交 ii. 原位噬菌斑杂交 iii. 原位细胞杂交 iv. 原位组织块杂交 原位裂解细胞，不需要分离DNA，RNA或蛋白质样品，可同时处理 大量样品，常用于目的基因的筛选或检测某类细胞或组织中是否存在某 一特定的DNA、RNA或蛋白质序列。 一. 分子杂交种类 3）印迹转移杂交(blotting hybridization) 先纯化样品，然后使不同大小的分子在凝胶上分离，转移到固体基 质上，与探针杂交。该法可检测出感兴趣分子的分子量。用于转移的方 法有： i. 扩散法 ii. 毛细管法 iii. 电泳转移法 iv. 真空转移法。 根据转移对象的不同分为Southern印记法（DNA）、Northern印迹法（ RNA）和Western 印迹法（蛋白质）。 一. 分子杂交种类 2）斑点杂交(dot hybridization) 先分离DNA，RNA或蛋白质，然后将样品液直接点在固体基质上进 行杂交，放射自显影后，判断是否有杂交及其杂交强度，主要用于基因 缺失或拷贝数改变的检测，半定量分析。 它利用两种探针与待测DNA结合，先 将不带标记的探针固定在基质上，然后用 待测样品与之杂交，洗去非特异性结合后 ，再与第二种带标记的探针杂交。这种方 法可用于粗制DNA样品，可检测出0.2ng的 DNA样品 4) 夹心杂交法(sandwich hybridization) 一. 分子杂交种类 1) DNA和RNA的杂交 制备DNA或RNA样品与固定基质结合80真空固定 预杂交加入标记探针杂交洗涤放射自显影或显色反应。 2）蛋白质的免疫分析 制备蛋白质样品与固定基质结合常温空气中固定封 闭剂封闭 一抗反应洗涤二抗-酶偶联物反应洗涤显色 反应（EIA） 或 一抗放射标记物洗涤放射自显影（RIA） 二、 分子杂交的一般程序 1. 固定基质的种类与特性 1）硝酸纤维素滤膜(Nitrocellulose filter, NCF) 可与三类大分子的结合，其机理不清楚，可能为被动吸附。 NCF不能结 合小分子DNA，RNA和蛋白质（20,000） 优点：i. 用于DNA，RNA杂交分析时结果可靠，灵敏，本底低。 ii. 用于蛋白质分析时，容量大（80g/cm2)；可直接染色；分辨率高； 不需要预激活；易于操作 缺点： 结合低分子蛋白质不稳定，反复使用探针次数有限（2-3次） 2）重氮化纸：DBM纸与DPT纤维素纸 最大特点是能结合小分子的DNA，RNA和蛋白质，共价结合，可用不同 探针进行 多次杂交分析。该类基质结合生物大分子的能力差，需要激活，分析 蛋白质时最好用放射性标记物。这类基质对生物大分子是主动吸附。 三、 杂交样品膜的制备 3) 尼龙膜 i. 阳离子尼龙膜 i) 容量大, 蛋白质可结合480g/cm2 ii) 可结合不同大小的DNA，RNA和蛋白质。 iii) 韧性好 iv) 可用于电转移 v) 可进行反复多次杂交试验 vi) 广泛的化学耐受性和可高温消毒 *不能用于蛋白质的直接染色。 ii. 尼龙66 广泛用于核酸印迹分析，静电荷可从pH4时阳离子状态转变为pH7时阴离子状态， 电转移时要注意。 4）离子膜 i. DEAE-纤维素纸 ii. CM-纤维素纸 三、 杂交样品膜的制备 2. 固定基质的选择依据 1）强度，耐久性，操作简便 2）高信噪比（低本底高信号） 3）生物大分子的结合容量和稳定性 4）重现性好 三、 杂交样品膜的制备 3. 各种杂交样品膜的制备 1）原位杂交样品膜的制备 i. 原位菌落杂交样品膜 (1) 在含有选择性抗生素的琼脂平板上放一张硝酸纤维素滤膜。 (2) 用无菌牙签将各个菌落先转移至滤膜上,再转移至含有选择性抗生素但未放滤膜的琼脂 主平板上。应按一定的格子进行划线接种(或打点)。每菌落应分别划线于两个平板的相同 位置上。最后，在滤膜和主平板上同时划一个含有非重组质粒（如pBR322)的菌落。 (3) 倒置平板,于37培养至划线的细菌菌落生长到0.5-1.0mm的宽度。 (4) 用已装防水黑色绘图墨水的注射器针头穿透滤膜直至琼脂,在3个以上的不对称位置作 标记。在主平板大致相同的位置上也作上标记。 (5) 用Parafilm膜封好主平板,倒置贮放于4,直至获得杂交反应的结果。 (6) 裂解细菌,按下述方法,使释放的DNA结合于硝酸纤维素滤膜。 i) 细胞培养（高密度，几百十万个菌落或低密度，几百个 以下） ii) 细菌细胞原位裂解与DNA变性 ii. 原位噬菌斑杂交样品膜 i) 细胞感染和噬菌斑形成（10,000-20,000/平板） ii) 噬菌体转移用NCF作影印 iii) DNA变性与固定（与上同） 三、 杂交样品膜的制备 2） 斑点杂交样品膜的制备 制备样品点样固定（可用斑点杂交仪或直接点样） 三、 杂交样品膜的制备 3）转移杂交样品膜的制备 i. 扩散法（Difusion blotting method ) 简单但不能定量 转移，与电转比 较只能转移25- 50%的蛋白质。 ii. 毛细管法 (Capillary blotting method ) 毛细管转移法借助吸水纸吸收转移缓冲液时所产生的牵引力量 将DNA或RNA自胶体转移至膜上。要转印完全，起码需要作用 6 h以上。 虽然所需花费的时间比较长，以其不须要特别的仪器 设备，毛细管转移法目前仍被普遍采用。 Southern、 Northern 印迹 iii. 电转移法 (electro blotting ) ：半干法和湿法电转。 iv. 真空转移法 (Vaccum bllotting ) 转移速度与凝胶的厚度成反比，在相同转移率（50%）时 ，真空法比毛细管法快13倍，其损失仅6%，而毛细管法损失 率20%。 v. 各种转移方法的比较 i) 扩散法和毛细管法：操作简便，不需要特殊转移仪器，但转移效率低,（扩 散法为70%，毛细管法80%）耗时多。 ii) 电转移法：效率高，耗时少，需特殊转移仪，对转移条件要求较严。 iii) 真空转移法：效率高，耗时最少，需特殊真空转移仪。 vi. 转移的最佳条件 i) 固定基质的选择 ii) 转移前预处理：DNA和RNA分子变性，蛋白质则需除去凝胶中的SDS。 iii)大分子的转移 对于分子量较大的DNA片段，必须进行原位断裂后再进行转移，断裂DNA分子 最佳长度为1-2kb。 其步骤是： 0.25M HCl处理凝胶两次（每次15分钟）水洗0.5M NaOH/1M NaCl 两次，每次15分钟转移。 对于大分子蛋白质，可采用下述三种方法之一： 解偶联剂使凝胶解聚；蛋白酶作用；转移缓冲液中加入SDS。 四. 标记探针的制备 1. 标记化合物的种类 1）放射性同位素标记物 125I，3H，14C用于蛋白质标 记；32P，3H，35S用于核酸 标记，其中32P和35S使用频 率高。32P标记核苷酸的位 或位，35S则是标记核苷酸 的位. 2) 非放射性标记物 i. 生物素 分离自蛋黄的水溶性维生素，它可以和分离自蛋清中的一 种碱性蛋白抗生物素蛋白牢固地结合。每个抗生物素蛋白可 结合4个生物素分子。此外，链霉菌抗生蛋白与生物素结合更 牢固，可大大提高其灵敏度。 生物素可以经过化学法与不同的化合物结合形成标记化合 物。 ii. 半抗原 包括汞，2-乙酰胺二苯丙茂，地高辛配体和金属铕。 地高辛配体是一种脂质半抗原，可将其连在dUTP（脱氧尿三 磷酸）上，然后用酶将其掺入新合成链中。检测上述标记物的 方法是利用二抗-酶偶联物反应和显色反应。 iii. 蛋白质检测标记物 i) 酶偶联二抗（0.05ng） ii) 蛋白质A（来自金黄色葡萄球菌）。可作用于大多数哺乳动 物的IgG（免疫球蛋白），灵敏度较低（5ng） iii) 免疫金（immunogold） 0.1-0.5ng 3) 两类标记化合物的比较 i. 灵敏度 i ) 检测蛋白质，两种方法差不多。 ii) 检测核酸，放射法比酶法敏感。 ii. 稳定性 酶法探针可在4保存一年，放射性标记需每次制备 。 iii. 安全性 非放射性标记安全。 iv. 效率 非放射性标记所需时间短。 2. 标记探针的制备方法 1）链标记法 2) 末端标记 3) 标记化合物的纯化 1）链标记法 i. 切口移位法 ds-DNA+DNase I+DNApol I+dNTP(32P-dCTP) ii. 随机DNA引物延伸法 ds-DNAss-DNA-(6n,t)Klenow片段+dNTP(32P) iii. 反转录法 mRNA+dNTP(32P) cDNA（标记） iv. 转录法 含有待标记DNA片段的重组质粒+NTP(32P)RNA（标记） SP6聚合酶 v. 引物延伸法 含待标记DNA的单链DNA分子(M13mp系列)+引物(15- 17n.t)+dNTP(32P)待标记DNA链 vi. T4 DNA聚合酶法 ds-DNAT4 DNA聚合酶, 无dNTP3-5外切酶活性加入dNTP和标记 核苷酸新合成链（32P） 2) 末端标记 i. 5-末端标记 ss-和ds-DNA, RNA脱磷酸化反应 (CIP) T4DNA连接酶(-32P )ATP ii. 3-末端标记 i) TdT加尾反应，用于dsDNA ii) 补齐反应 iii) T4 RNA连接酶反应 RNA-OH+*pNp（3-5-二磷酸核苷）+ATPRNA-*pNPp+pA+ppi 3) 标记化合物的纯化 i. 柱层析 利用Sephadex G-50，前峰-标记物，后峰-核苷酸 ii. 旋转柱层析 快速，简便, 可同时纯化多个样品。 下一节 双链DNA标记法一 切口移位法 （Nick Translation） o原理及过程：反应体系中DNA酶I随机在探针DNA上打开缺口，然后利用DNA 聚合酶I 5 3外切酶活性，在缺口处按5 3方向切除单核苷酸； 在切除的同时DNA聚合酶I有5 3的聚合酶活性，在缺口处3端链接底物 中的单核苷酸，弥补缺口处的核苷酸链。随着反应的进行，缺口平移，并 且底物中被标记的单核苷酸被随机掺入。DNA聚合酶I的两种作用交替进行 ，探针即被标记。 Nick Translation 返回 双链DNA标记法二 随机引物法（6核苷酸引物标记法） o原理及过程：利用E.coli DNA聚合酶I的Klenow亚单位，合成含有标记 核苷酸的DNA链。Klenow具有5 3聚合酶活性。被标记的DNA（探针 ）变性成单链，引物与模板结合。在Klenow的催化下，以引物3端为起 点，沿模板3 5方向合成DNA新链。反应体系中含有标记的dNTP,随 机掺入新合成的DNA链中，探针即被标记。 返回 1. 核酸杂交步骤与结果检测 1）预杂交： 预杂交液中常加入鲑鱼精DNA，若标记探针是cDNA或RNA， 预杂交液中还需加入多聚A以阻止特异性结合, 42 4-6h或过夜。 2）杂交：探针100变性，迅速冷却，加入预杂交液中，42一天 五. 分子杂交与结果检测 3）洗涤：2SSC+0.1%SDS常温洗涤两次，1SSC+0.1%SDS 65洗涤两次，每次15分钟。若使用低聚核苷酸探针，洗涤温度按下式计算 ： T=4GC+2AT * 高强度与低强度杂交：若具高度特异性同源序列，采用高强度杂交条件 ；若使低同源性DNA之间杂交，则采用低强度杂交条件。这两种条件之差异 表现在杂交液和洗涤液的离子强度以及杂交和洗涤时的温度。 4）放射自显影或显色反应 使用放射性同位素标记物，采用放射自显影。若采用非放射性同 位素标记物，则采用显色反应。显色反应将依据偶联的酶类而定。主 要有两种酶： i. 辣根过氧化物酶: 可将3，3-二氨基苯胺氧化成褐色沉淀或将4-氯 萘酚氧化成紫色沉淀物。 ii. 碱性磷酸酶的作用底物是5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，在酶作用下 ，该化合物可转变为兰色沉淀物，该反应中释放的氢离子可将硝基兰 四唑还原成深紫色沉淀，这些沉淀物都是沉积在酶的作用位点。 iii. 两种酶偶联物的比较 i) 碱性磷酸酶的灵敏度比辣根过氧化物酶高10倍左右，但噪声大 。 ii) 碱性磷酸酶的显色反应可持续几个小时，其显色结果可长期保 存，但辣根过氧化物酶的显色反应仅能持续30分钟。 5) 杂交结果 2. 蛋白质的免疫分析 封闭剂，明胶，牛血清蛋白，卵清蛋白等。 杂交结果示意图 六、核酸分子杂交实验因素的优化 o 探针的选择 在大多数情况下，可以选择克隆的DNA或cDNA双链探针 在检测单链靶序列时应选用与其互补的DNA单链探针或 RNA探针 长的双链DNA探针特异性较强，适宜检测复杂的靶核苷酸 序列和病原体，但不适宜于组织原位杂交 o 探针的标记方法 选择什么标记方法主要视个人的习惯和可利用条件而定； 但还应考虑实验的要求，如灵敏度和显示方法等 一般认为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高 在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技 术和比较稳定的碱性磷酸酶显示系统 六、核酸分子杂交实验因素的优化 o 探针的浓度 总的来说，随探针浓度增加，杂交率也增加 在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加 膜杂交中32P标记探针与非放射性标记探针的用量分别为5 10ng/ml和251000ng/ml，而原位杂交中，无论应 用何种标记探针，其用量均为0.55.0g/ml 受不同类型标记物的固相支持物的非特异结合特性的影响 六、核酸分子杂交实验因素的优化 o 杂交率 现代杂交实验无论在液相杂交还是固相杂交均在探针过剩 的条件下进行 在探针过量的条件下，杂交率主要依赖于探针长度（复杂 度）和探针浓度。下面列出的公式适用于过剩单链探针 对靶序列杂交的情形 t1/2=ln2/kc t1/2半数探针与固定靶序列杂交所需的时间（s） k =形成杂交体的速率常数mol/(Lxntxs)决定于探针长度（L）、探针复 杂度（N）、温度、离子强度、粘度和pH c =溶液中的探针浓度（mol/L） 六、核酸分子杂交实验因素的优化 o 杂交最适温度 杂交技术最重要的因素之一 反应温度低于Tm 1015，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳 定的双链，错配对减少。若反应温度再低（Tm-30），虽然互补 链之间也可形成稳定的双链，但互补碱基配对减少，错配对增多、氢 键结合的更弱 最适复性温度（Optimunm renaturation temperature, TOR）