微生物药物研究开题报告.doc

曲靖师范学院本科毕业论文（设计）开 题 报 告论文题目： 作 者： 姜洪波 学号：2012162123学 院： 生物资源与食品工程 年 级： 2012级专 业： 生物科学指导教师：田雪莲 职称：讲师 日 期：2016年3月26日毕业论文（设计）开题报告填写说明1封面上的“论文题目”一栏填写时一律不用书名号；外语学院学生的论文（设计）题目统一填写英文题目，不用中文。2封面上的“学号”一栏统一填写如：“2003131150”含年级、系别、班级和学号顺序的数字。不能填写为：“63”、“04号”的等样式。3封面页上的“年级”一栏用阿拉伯数字统一填写为：“xxxx级”。不能填写为：“四年级”、“03级”、“2003”等样式。4封面页上的“日期”一栏统一填为带有年、月、日字样的日期形式，如“2006年12月21日”。5开题报告用A3纸打印，从中缝对折，其中封面页有文字信息，封二为“毕业论文（设计）开题报告填写说明”，封三、封底表格要大小一致。1、 国内外研究现状述评（文献综述） 微生物代谢产物的合成生物学是一门工程科学，其所涉及的基础学科广泛，包括数学建模、药物化学、天然产物化学、微生物学、分子生物学、代谢工程、基因组学、生物信息学等。合成生物学的概念最初是由 Hobom 于1980年提出用来表述基因重组技术，所以从狭义角度看合成生物学技术，我们可以认为是基因重组技术，但需要强调的是合成生物学针对代谢通路乃至生命系统的重新设计和合成，因而目的性强，具体体现在 DNA、元件(Parts)、装置(Devices)、系统(Systems)这 4 个层面上。微生物代谢产物的合成生物学最重要的应用就是微生物药物合成（或称为微生物制药），其主要包含来源于微生物（特别是放线菌和真菌）次级代谢产物的药物。合成生物学应用于微生物药物合成的研究对象主要就是微生物和植物来源的次级代谢产物等，因而我们可以从微生物细胞中得到源于植物细胞的次级代谢产物药物。可见合成生物学为微生物药物发展提供新契机。长久以来，微生物药物研究中都面临着两大挑战，一是如何将这些与次级代谢产物生物合成相关的基因簇“翻译”(转化）为对应的次级代谢产物，二是如何提高次级代谢产物的生物合成水平。而合成生物学技术为解决这两大问题开辟了道路。我们可以通过对底盘细胞进行遗传修饰改造，使其细胞环境有利于编码异源次级代谢产物生物合成的基因簇成功表达，而所谓的底盘细胞是指异源表达的宿主细胞，是生物元件、装置和代谢通路发挥生物学功能的基础，常常是大肠杆菌、放线菌、链霉菌等作为底盘细胞。之所以选择这些菌株作为底盘细胞，是因为它们易于培养和遗传操作容易、生长迅速、发酵友好及遗传稳定性，又或是和次级代谢产生菌株的亲缘关系接近。此外，要想使得次级代谢产物成功合成，我们不能单单靠对底盘的改造，还需要对生物合成基因簇进行加工，例如改变异源生物合成基因簇起始模块，引入起始单元。若想使得异源次级代谢产物基因簇高效表达，不妨利用合成生物学元件，例如基因扩增元件、耐药元件、调控元件，这些元件从不同角度出发为异源次级代谢产物生物合成基因簇的高效表达发挥着重要作用。此外，合成生物学为发现新次级代谢产物提供了助力。在DNA次序技术迅猛发展的今天，结合生物信息学，我们可以越发观察到其实微生物细胞基因组中存在着大量与次级代谢产物生物合成相关的隐性基因簇，这些沉默基因其实就是构造微生物次级代谢产物生物合成途径的丰富物质基础。采用合成生物学技术手段在恰当的宿主细胞中表达沉默的次级代谢通路中的生物合成酶, 有可能获得用于微生物制药的新次级代谢产物。不仅如此，我们可以通过合成生物学技术对这些沉默基因簇进行重新设计重新组装，往往可以得到新的次级代谢产物，当然这就涉及到了生物合成基因簇的加工。尽管微生物代谢产物的合成生物学前景备受关注，但是我们也应该高度认识到其面临的问题。目前, 人类对生物体系的认识有所局限,无法保证合成生物学设计的代谢途径是否可以发挥预期效果, 对设计代谢途径所用的模块元件的特性也没完全把握。因此,我们需要从基础做起，真正掌握自然界特别是微生物的初级与次级代谢的关系及其调控机制。在将合成生物学技术应用于微生物制药过程中,需要综合理性与非理性研究策略, 通过反复替换、测试与筛选, 才有可能实现预期目标，提炼得到相应次级代谢产物药物。（一） 国内研究现状阿维菌素是一种环保的绿色农药，易降解且持续作用时间长，对危害庄稼的昆虫有较大的杀虫效果。此外，它还可以作为抗寄生虫药应用于畜牧业。所以，研究人员都在为提高其产量和品质而努力着。合成生物学技术可以通过两方面来提高阿维菌素产量。一方面可以通过设计合适的底盘来提高阿维菌素的产量：例如优化前体供给配比、提高菌株自身耐药性等。另一方面可以通过优化阿维菌素的生物合成过程来提高阿维菌素的产量：例如通过不同的启动子来调节各个基因的转录水平，然后采用计算机模拟和实验操作测试对不同转录水平的各基因组合进行筛选从而获得最优的生物合成过程。中国科学院微生物研究所相关的研究人员，采用合成生物学大跨度的提高了阿维菌素B1a的产量1000倍，至9 g/L，市场价格由过去的每千克20000元降低到500元。这一成就也使得截止至2015年9月，中国已经成为阿维菌素的唯一生产国。此外，多拉菌素是一种比阿维菌素更好用、更有效的微生物农药, 其由经基因工程改造后的除虫链霉菌进行工业生产, 其工业菌因被国外垄断，所以多拉菌素在一段时间内价格很高。但是，我国科研人员通过删除阿维菌素生物合成基因簇中的支链酮酸脱氢酶基因bkdF 和寡霉素生物合成基因簇中的起始基因 olmA1 等,构造了我国专利的多拉菌素工业菌株，这对于我国在国际微生物农药创新竞争力方面起到了重要意义。红霉素是一种重要的大环内酯类抗生素，只有红霉素A是有效成分，而在红霉素A生物合成过程中会产生中间产物红霉素B和红霉素C，因而实际得到的红霉素品质并不高。华东理工大学和中国科学院上海有机化学研究所相关研究人员，通过调控红色糖多孢菌中参与红霉素生物合成的 PKS 后修饰酶 EryK (P450羟基化酶) 和 EryG (依赖 S-腺苷甲硫氨酸的 O-甲基转移酶) 的生物合成量, 最终实现了红色糖多孢菌发酵过程中红霉素 A的产量提升和红霉素的品质提升。螺旋霉素是另一种大环内酯类抗生素,虽然其作用机理、抗菌图谱与红霉素相类似，但是抗菌效应比红霉素稍差。中国医学科学院医学生物技术研究所的相关研究人员，通过构效关系研究表明，螺旋霉素分子的碳霉糖部分经过4-酰化可增加分子的脂溶性 , 因而提高其组织浓度从而增加其抗菌效应。将来自耐热链霉菌碳霉素生物合成基因簇中的编码异戊酰基转移酶基因导入并整合到螺旋霉素产生菌中, 这样做的目的是为了延伸螺旋霉素合成途径,最终获得4-异戊酰螺旋霉素的重组菌株，并开始产业化发酵生产得到相应的新合成螺旋霉素。中国科学院上海生物科学研究院植物生理生态研究所周敏教授和他的团队通过基因敲除，把天蓝色链霉菌基因组中的 10 个聚酮生物合成基因簇、非核糖体多肽生物合成基因簇、线型染色体左臂的亚端粒区等12 Mb，构建出 ZM11 菌株。并且又在新菌株导入了放线紫红素生物合成基因簇，通过与野生产放线紫红素菌株产的放线紫红素含量相比，该构造的菌株产放线紫红素的量明显有大幅度的提升。表明新构造的菌株能更好地表达出目标产物。目前，国家的多项重大科技计划和重大新药创制计划等帮助了与微生物药物合成生物学相关的项目和课题, 预计未来我国在微生物制药合成生物学将取得更多的成就。（2） 国外研究现状同国内的科学家一样，国外科学家对于抗生素的生产研究也是不懈努力着。就对于底盘细胞的设计和改造而言，国外生物工程学家对于发酵生产阿维菌素的工业微生物菌种阿维链霉菌提出了新的尝试。2010年Komatsu 和他的团队通过比较阿维链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌这三者的基因组发现，这些微生物都有一个大小为6.3Mb左右 的保守核心域，于是采用同源重组和位点特异性重组技术，敲除类胡萝卜素等 5 种次级代谢产物基因簇、还有一部分转座子和 多个插入序列，最终获得只有 17 个系列的最小化基因组阿维链霉菌。并在3年后，该团队又顺利将核糖霉素、福里波霉素、抗霉素生物合成基因簇分别导入到之前所得到的新阿维链霉素中，结果是各抗生素产量都有提升，而阿维菌素的却没有检测到。表明最小基因组阿维链霉素的稳定和高产性能。对于最小基因组微生物菌株的研究较为成熟的还有天蓝色链霉菌，天蓝色链霉菌作为一种模式微生物在抗生素生产研究中有重大的意义。2011年Gomez-Escribano和他的同事依次敲除 act、red、cpk、cda 生物合成基因簇，最终得到一个细胞生活、代谢通路都正常的最小基因组天蓝色链霉菌，进一步定点突变编码RNA pol亚基的基因rpoB、 和编码核糖体蛋白 S12的基因 rpsL，之后再突变株中分别导入放线紫红素生物合成基因簇、氯霉素生物合成基因簇，最后不仅降低了代谢产物的复杂度，还使得抗生素产量均高于原始菌株。在聚酮类抗生素在大肠杆菌中的高效表达中，底盘细胞大肠杆菌面临3个无法避免的问题。只有解决了这3个问题，这类抗生素才能在大肠杆菌中高效表达。这3个问题分别是聚酮合酶在大肠杆菌中的正确折叠及翻译后修饰; 聚酮化合物的合成前体物质供给; 聚酮合酶的生物活性和前体供给的同步。而美国塔夫茨大学的Pfeifer教授和他的研究人员在进行6-脱氧红霉内酯B(6-Deoxyerythronolide B,6-dEB，红霉素前体）在大肠杆菌中的异源高效表达过程中恰如其分的解决了上述3个问题。首先，在大肠杆菌基因组整合了编码Sfp型磷酸泛酰巯基乙胺转移酶基因，这种转移酶的底物专一性不高，但既可以修饰I型聚酮合成酶的脱辅基ACP,又可以修饰型聚酮合成酶的脱辅基ACP，所以解决了第一个问题。在上述编码转移酶基因整合到大肠杆菌基因组的同时，又删除删除了丙酸盐分解代谢的相关基因,只保留将丙酸盐转化为丙酰辅酶A的基因,从而丙酸盐不会被分解而是大多数转化为6-dEB的前体丙酰辅酶A，第二个问题解决。6一脱氧红霉内酯合成酶（DEBS，一种聚酮合酶）经诱导表达，同时外加丙酸盐，使得该聚酮酶活性和前体物质供给得以同步，继而第三个问题解决。青蒿酸是青蒿素生物合成的前体物质,可通过两步化学反应转化为青蒿素。美国加州大学的 Keasling教授通过合成生物学技术以酵母菌为宿主细胞，结合源于细菌、酵母及青蒿等的多种酶及代谢途径的组装和精密调控，又对青蒿素代谢途径进行了重新设计，目的是为了降低天然或非天然代谢产物对酵母的毒害作用，从而使得微生物生产青蒿酸成为可能，并且提高青蒿酸的产量。伴随青蒿酸的产量剧增，青蒿素的产量也大幅度上升，最终青蒿素的合成能力提高到 25 g/L。那时候青蒿素就从植物细胞次级代谢产物药物变成了微生物细胞次级代谢产物药物。在Keasling教授团队这一实验过程中，他们有些思想值得借鉴，如他们将合成底物的甲羟戊酸途径分成上下两个模块进行分别研究在组合, 大大降低了复杂度和实验难度; 建立了一套研究基因间可调区域控制基因表达水平的方法等。利用Keasling教授团队在生产青蒿素过程中想法，Stephanopoulos实验室开始致力于如何提高紫杉醇产量的研究。他们将从三磷酸甘油等底物到合成紫杉醇这系列代谢途径中的第一个中间产物紫杉烯（Taxadiene）的代谢途径分成2个模块了，第一个模块是合成焦磷酸异戊烯酯(IPP,Isopentenylpyrophosphate)，第二模块是从焦磷酸异戊烯酯（IPP,Isopentenylpyrophosphate就）到紫杉烯（Taxadiene）的过程, 然后利用多变量研究来协调两模块之间表达水平, 通过协调达到限制有毒代谢产物吲哚的积累的目的，最终将大肠杆菌中紫杉烯产量提高了约15000倍, 达到约1 g/L 的水平。原来自然界中天然合成的紫杉醇量很少，经过合成生物学的办法，实现了植物来源的活性小分子可以由微生物进行表达，并且大大提高了紫杉醇产量。在荷兰的一家名叫DSM的公司，在这里的相关研究人员将编码产黄头孢霉中的扩环酶基因和编码假单胞菌中的酰基转移酶基因导入到产青霉素的黄青霉中，并且在含有己二酸前体的特定培养基中培养, 从而实现了黄青霉生物合成己二酰化 7-氨基-3-去乙酰氧基头孢烷酸 (adipoyl-7-ADCA); 由于黄青霉中的青霉素发酵效价高, 所以该生物发酵也同样可以大量地获得 adipoyl-7-ADCA (头孢菌素化学半合成前体); 所获得的前体再经两步化学反应即可得到头孢氨