开题报告复合抗菌肽“泰康利保”对断奶仔猪肺脏CAT、—OH、T-AOC的影响.docx

四川农业大学本科毕业论文（设计）开题报告毕业论文（设计）题目复合抗菌肽“泰康利保”对断奶仔猪肺脏CAT、OH、T-AOC的影响选题类型应用基础型课题来源自选项目学院动物医学院专业动物医学（小动物方向）指导教师任志华职称副教授姓名田一男年级2011级学号201106471立题依据动物在养殖生产的过程当中，常会接触到各种病原体并引发一系列的疾病，生产中需要采取综合防御措施，才能有效防治动物疾病。自20世纪上半叶Fleming发现青霉素以来，抗生素作为治疗疾病的有力武器对人类健康以及畜牧生产业做出了巨大地贡献。在现代畜牧生产上，抗生素作为生长促进添加剂，以及对动物疾病进行诊断、资料、预防的药物起着举足轻重的作用。例如饲料中添加抗生素可以抑制消化道病原微生物的生长。但近年来，抗生素在微生物中存在广泛的耐药性有大量事实依据可查。由于生产中超时、超量、不对症使用或未严格规范使用抗生素可能导致细菌耐药性增强，并造成畜产品中抗生素残留增加，危害养殖业健康发展以及人类食品安全等1。因此，寻找一种不易产生耐药性、残留小、方便应用的新型抗菌药物已经成了近年来畜牧业药物研究的焦点所在。目前新型的抗菌药包括寡聚糖、益生菌、植物提取物、抗菌肽等2-4。抗菌肽作为一种广泛存在于生物体内的小分子多肽，具有明显抗菌等多种生物学功能和难以产生耐药性无残留等优点，其开发与应用技术研究在畜牧科研等领域展开。1.1抗菌肽（Antimicrobial peptides）抗微生物肽（Antimicrobial peptides，AMPS），又称为抗菌肽（Antibacterial peptides，ABPs）是指生物体经外界刺激后产生的对外源性病原体具有对抗作用的防御性多肽类物质。首先被发现的是北美天蚕血淋巴中产生的天蚕素(Cecropins)，在1972年由瑞典科学家Boman等5向眉纹天蚕蛾蛹注射阴沟肠杆菌及大肠杆菌后，在血淋巴细胞中发现一种具有抗菌活性的碱性多肽类物质，随后诱导惜古比天蚕蛹也发现了类似的物质。抗菌肽根据结构不同主要可分为三大类，包括：（1）-螺旋抗菌肽；（2）环形抗菌肽；（3）分子结构中含有大量特殊氨基酸的抗菌肽6。尽管随研究发展不断深入许多抗菌肽都有相应的研究进展，但是其作用机制等尚未确切阐明。不同抗菌肽可能存在多种作用机制；对于不同微生物而言，不同的抗菌肽作用机制可能不止一种7。1.2抗菌肽的作用机理研究进展1.2.1抗菌肽主要作用机理 抗菌肽对于微生物的抗菌作用一直在研究当中，但具体的杀菌方式至今仍不清楚。但根据现有的研究提出了两种不同的观点，第一，抗菌肽能够选择性结合于细菌胞膜形成跨膜孔道，破坏胞膜的完整性、发挥杀菌作用；第二，抗菌肽能够进入细菌胞内，作用于特定靶点从而发挥杀菌作用8。一般认为由于细菌胞膜上磷酸壁和脂多糖均带有负电荷，因此对阳离子的抗菌肽具有吸引作用。抗菌肽分子被吸引至细胞表面后疏水部分通过分子间柔性的连接部分插入到细胞膜中间，随后抗菌肽分子中的两性亲a螺旋也随即插入到质膜中，改变了质膜中的蛋白质和脂质的原有构造。有的学者认为抗菌肽在通过静电作用被细菌胞膜吸引之后通过多个抗菌肽分子的共同作用，与细胞膜结合并达到一定浓度，抗菌肽就会发生结构或构型的过渡和变化，在质膜上交互位移，形成了离子通道，进入胞内，作用于核苷酸等靶点从而达到杀菌作用。1.2.2抗菌肽的广谱抗菌活性研究表明，抗菌肽除类似常规抗生素对细菌有抑制或杀灭作用外，对真菌、病毒也有一定作用，甚至对肿瘤细胞也具有杀伤性的作用。其最小抑菌浓度（MIC）在0.110g/mL 之间，研究认为其作用模式与他们的结构特性有很大关系。某些抗菌肽能抑制细菌抗生素外排泵的作用从而阻止细菌内抗生素的外泄9加强杀菌作用。除此以外，抗菌肽具有一定的选择性，由于真核细胞的磷脂成不对称性分布，外层大部分为中性磷脂，因此对抗菌肽小分子的电荷作用小，从而阻止抗菌肽渗透入真核细胞。临床上将Daptomycin和内酰胺类抗生素联合使用可以显著治疗由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌引发的感染，在MRSA持续或顽固性感染中还能避免对Daptomycin耐药突变的选择性10。1.2.3抗菌肽对真菌的杀伤作用抗菌肽除了具有抗细菌的活性外还具有抗真菌作用。最早发现的具有抑制真菌作用的抗菌肽是从蛙类皮肤中分离得到的蛙皮素（magaining），其不仅能抑制革兰氏阴性菌和阳性菌，对于真菌原虫均有杀灭作用。而抗菌肽抑制真菌的作用机理为：阻碍真菌细胞壁的正常合成。线粒体作用，抗菌肽与真菌细胞内线粒体及核酸等细胞器相互作用，在细胞不裂解的情况下导致胞内ATP外流，ATP与特定的嘌呤受体结合后，抑制线粒体的呼吸，最终引起真菌细胞的死亡。胞膜攻击作用，通过扰乱细胞膜的平衡，破坏细胞的膜结构，使得重要内容物外渗，从而导致细胞死亡，这一作用是抗菌肽杀伤细胞的最基本作用11-12。1.2.4抗菌肽对病毒的杀伤作用某些抗菌肽除了常规的抗菌活性之外，还具有抗病毒的作用。例如Magainin 2及合成肽modelin 1和moderln 5对疱疹病毒I型（HSV-I）和疱疹病毒II型（HSV-II）有一定的抑制效果。抗菌肽的抗病毒作用以证明是通过三种不同机子完成的：直接与病毒可理解和而抗病毒，如-防御素等谁疱疹病毒的作用。抑制病毒的复制过程，如蜂毒素和杀菌肽对人免疫缺陷病毒的作用。通过模仿病毒的侵染来干扰病毒的正常组装。例如蜂毒素蛋白分子可以伪装成烟草花叶病毒的病毒包被蛋白，参与病毒合成从而使病毒颗粒无法正常组装13。1.2.5抗菌肽的抗肿瘤作用抗菌肽能特异性的抑制某些肿瘤细胞的生长从而改善传统化疗方法造成的对正常人体细胞的伤害。美国马盖宁制药公司已与1990年开始对蛙类皮肤分泌物中的抗菌肽马盖宁（magainin）进行结构与分子设计，筛选出一种对病毒和肿瘤细胞均有较好杀伤作用的小肽MAI-78，目前已进入临床试验阶段。而抗菌肽maximin3来源于中国大蹼铃蟾。这种抗菌肽在其浓度达到微摩尔时就能表现出较强的肿瘤细胞杀伤作用14经研究抗菌肽的肿瘤抗性可能有两种作用机制：对肿瘤细胞股价的断裂作用。诱导肿瘤细胞凋亡。由于现在实验仍在不断深入，因此关于抗菌肽抗肿瘤作用的机制仍停留于推测阶段。1.2.6抗菌肽对寄生虫等的杀伤作用目前发现一种合成天蚕素-蜂毒素杂合体对莱什曼原鞭毛虫有损伤作用，起作用的靶目标是细胞质膜，它可以快速降低H-/OH+的通透性，破坏膜电势，质膜形态也受到破坏15。根据研究发现抗菌肽可以有效地杀灭人类及动物寄生虫病的寄生虫，如疟疾、Chagas氏病等，而且部分抗菌肽还可以杀死原虫。抗菌肽作用于原虫的膜，间接引起细胞内部结构和细胞器的变化，干扰细胞正常的代谢过程。1.2.7抗菌肽对机体抗氧化指标的影响新生仔猪缺乏先天免疫力，由于免疫抗体是一种大分子球蛋白，胚胎期由于母体血管与胎儿脐带血管之间被67层组织隔开，限制了母体抗体通过血液向胎儿的转移。因此只有在吃到初乳以后，靠初乳把母体的抗体传递给仔猪，才会是获得免疫力。而仔猪断奶后，供发育的营养物质发生了变化，引起生理方面很大的变化。抵抗力和免疫力降低易发病，因此这是一定要为断奶仔猪制定好的免疫以及管理方案。现代医学证明，生物体许多疾病的发生与机体内不饱和脂肪酸共价键上的一系列自由基反应有关。受控的自由基对机体是有利的，但自由基超过定量，并失去控制时，就会给机体带来伤害，如过量的-OH通过氧化过程对机体组织造成伤害。正常机体内存在一套有效的抗氧化防御系统，可以清楚氧自由基及其代谢产物，保护机体免受伤害，例如过氧化氢酶（CAT）。而机体中的总抗氧化能力（T-AOC）则可以衡量这种防御系统的工作能力。张捷16等在对枯草芽孢杆菌Y-6产生的抗菌肽抗氧化活性的研究中发现在试验范围内，抗菌肽的浓度越高，抗氧化效果越好。1.2.8抗菌肽泰康利保的介绍泰康利保是由四川华德生物有限公司生产的国内唯一的复合型抗菌肽。产品中包含有杀菌肽和防御素。对革兰氏阴性菌以及革兰氏阳性菌均有抑制和杀灭效果。产品具有高活性、稳定、耐高温的特点，与抗生素有协调作用，绿色安全。具有免疫调节功能，母猪方面能提高母猪机体的免疫细胞数量和抗体水平。仔猪方面可降低乳猪死亡率，作为饲料添加剂还可提高仔猪生长速度。1.3研究目的和意义抗菌肽作为最有可能替代抗生素的一种发现，它的应用潜力及可能带来的经济价值是无法估计的。抗菌肽广义上是指生物防御系统中产生的，广泛存在于生物体内，在先天性免疫细胞中与炎症反应、先天性免疫和适应性免疫相关的活性，具有抵御外界微生物侵害，清除体内突变细胞的一类带正电荷的两亲性小分子多肽，是先天免疫的重要组成成分，我们称之为第二防御体系。有些抗菌肽具有促中性粒细胞、T细胞的化学趋化、促进伤口愈合、诱导细胞凋亡、抑制蛋白激酶C、抑制促肾上腺皮质激素等多方面活性。在未来的研究发展中，人们可以根据不同抗菌肽所具备的性质，将其设计成各种不同类型的药物。例如单一性抗感染药、药物载体或抗生素的协同用药等得益于固相合成技术的优化，较长的多肽及小分子量蛋白的合成更为简易，这为抗菌肽从理论上应用到实际生活中提供了技术支持，抗菌肽现在已经逐步应用到医药、农业、视频等多个领域当中17-18。近年来，由食品和饲料安全问题而开展的饲用抗生素替代品的研究是畜牧业研究与生产的热点问题，抗菌肽由于自身的优点显示了其在饲料中广泛应用的前景，它的出现为解决抗生素应用的负面作用提供了新的手段。随着分子生物学及基因工程技术在抗菌肽研究与开发领域的应用，最终将实现抗菌肽的广泛应用，造福大众。2研究的主要内容及预期目标2.1研究的主要内容（1）复合抗菌肽“泰康利保”作用于断奶仔猪后，对肺脏内过氧化氢酶（CAT）的影响；（2）复合抗菌肽“泰康利保”作用于断奶仔猪后，对肺脏内OH、总抗氧化能力（T-AOC）的影响；2.2研究的预期目标（1）泰康利保作用于断奶仔猪肺脏后CAT含量受到不同程度影响；（2）泰康利保作用于断奶仔猪肺脏后，-OH和T-AOC受到影响；（3）确定泰康利保对断奶仔猪肺脏指标的影响程度，以及不同浓度对动物的影响，为实际生产上提供理论依据，指导泰康利保合理使用。3研究方案3.1试验动物规模化猪场体重相近、发育良好的健康断奶仔猪50头、仔猪饲料（饲料配方：玉米、麦麸、发酵豆粕、碳酸钙、磷酸氢钙、单间、食盐、赖氨酸、蛋氨酸、微量元素等）3.2实验试剂抗菌肽“泰康利保”、CAT试剂盒、-OH试剂盒、T-AOC试剂盒、蒸馏水、生理盐水、消毒液等。3.3实验器材水平式离心机、定量移液枪、试管、冰箱、组织匀浆机、可见分光光度仪（波长506nm）等。3.4试验方法3.4.1试验处理方案以猪场所用饲料为日粮进行常规饲养管理。每天定时定量饲喂。按猪场常规饲养管理程序驱虫及免疫。将50只断奶仔猪随机划分为A组健康对照组、B泰康利保200/kg组、C泰康利保300/kg组、D泰康利保400/kg组、E泰康利保500/kg组，A组对照组进行单独饲养管理。5个猪的仔猪分为一个对照组和4个实验组。实验过程中进行猪场常规管理，实验第14d、28d，每组宰杀两头仔猪取肺脏组织，测定组织CAT.-OH、T-AOC等指标3.4.2样品的采集与处理方法（1）肺脏组织处理 宰杀仔猪后迅速取出仔猪肺脏，滤纸拭干（2）严格按照各试剂盒说明进行肺脏CAT、T-AOC、-OH等指标的测定。3.4.3数据结果记录将处理的肺脏组织样品进行深化测定分析后，记录测定结果（表一）表一 泰康利保对肺脏组织CAT、-OH、T-AOC指标的影响指标组别CAT指标-OH指标T-AOC指标123412341234A组B组C组D组E组4试验进度安排2014年3月1日-2014年3月31日：试验准备阶段包括试验器材、药品、试剂准备。4月2日-4月22日：熟悉试验操作步骤。4月23日-5月5日：根据实验步骤修正试验方案。5月6日-8月31日：正式试验，选择并饲喂仔猪，根据计划添加泰康利保，取样并检测。9月1日- 10月31日：数据分析处理，试验总结。11月1日- 12月31日：论文撰写。2014年12月2015年1月 ：毕业设计（论文）答辩。5试验经费预算序号经费项目预算金额（元）说明1仔猪成本2饲料费3试剂盒费4试剂费5其他总计6主要参考文献1 阎克敏，任胤晓.动物滥用抗生素的危害与对策J.中国动物检疫,2008,(02):19-20.2 王建业, 王永坤.益生菌必备条件及其功效评价J. 中国家禽 2002, 24(2):4-9.3 朱俊玲, 卢智.功能性低聚糖的研究进展及其应用现状J. 食品研究与开发 2003, 24(3):72-75.4 张建东, 许梓荣, 詹勇.抗生素类饲料添加剂替代品研究进展J. 上海畜牧兽医通讯 2001, 3:6-9.5 Boman HG, Nilsson I, Rasmuson B. Inducible antibacterial defence system in Drosophila. Nature 1972, 237:232-235.6 王义鹏, 赖仞.昆虫抗菌肽结构、性质和基因调控J.动物学研究，2010，31（01）.7 庞英明，段金廒, 屈贤铭.昆虫抗菌肽结构与功能关系及其在分子设计中的应用J.生命科学,2001,13（5）.8 张晓巩, 方超, 白卉等.抗菌肽作用机制的研究进展J.生理科学进展，2011,42（01）.9 蔡菁.抗菌肽潜在抗生素替代品J.上海医药，2013,34（19）：55-56.10 Mehta S，Singh C，Rosato A E，et a113-Lactams increasethe antibacterial activity of daptomycin against clinicalmethicillinresistant Staphylococcus aureus strains andprevent selection of daptomycinresistant derivativesJ Antimicrob Agen Chemother，2012，56(12)：6192620011 SRISAlIAM S，ARUNKUMAR A I，WANG W ，et a1Conformationalstudy of a customantibacterial peptide cecropin B1：implications of the lytic activity JBiochim Biophys Acta， 2oo0(1，2)：27528512 GAUTIER M F，ALEMAN M E，GUIRAO A，et a1Tritieumaestivumpuroindolines，two basic cystinerich seed proteins：cDNA sequence analysis and developmental gene expressionJPlantMolBi0l，1994，25(1)：43-5713 梁立.抗菌肽的研究进展J.畜牧兽医科