课题申请报告书-蜱类生殖行为过程中的性信息素调节机制研究.doc

三、立论依据(包括科学意义和应用前景，国内外研究概况，主要参考文献目录。纯基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义；应用基础研究着重结合学科前沿，围绕国民经济和社会发展中的科技问题，论述其研究特色及应用前景)蜱类隶属节肢动物门、蛛形纲、蜱螨亚纲、寄螨目，分为三个科：硬蜱科 (Ixodidae)、软蜱科 (Argasidae) 和纳蜱科 (Nuttallielliae)。全世界约有850种1,中国已描述定名110种2。这个类群是专性吸血的外寄生动物, 传播病毒(如森林脑炎、出血热)、立克次体(如Q热、 蜱媒斑疹热)、细菌(如土拉菌、布氏菌)、螺旋体(如莱姆病)、原虫(如巴贝虫、泰勒虫)以及毒素(如蜱传麻痹症)等多种病原体而导致疾病，给人类健康和畜牧业发展带来极大危害 3。 据世界粮农组织（FAO）报道，全世界每年由蜱类造成的经济损失达70亿美元4,对人类健康的危害仅次于蚊类5 。因此,对其研究具有重要的意义。长角血蜱（Haemaphysalis longicornis Neumann）广泛分布于河北省太行山区、燕山山区、邯郸、满城、涞水和玉田等地，严重危害我省畜牧业的发展6。申请者在主持国家自然科学基金和河北省自然科学基金期间，发现该种蜱在邢台、衡水、沧州、张家口、承德等地也广泛分布，且种群数量极大（如在河北小五台山国家自然保护区每只羊体上寄生5000头若虫，每头牛体上寄生数量高达9600头若虫），构成河北省优势种类。由于长角血蜱是瑟氏泰勒虫 （Theileria sergenti）的主要传播媒介，引起寄主高热、出血、消瘦和体表淋巴结肿胀等症状及继发性感染而导致疾病，且种群数量大、繁殖率高（每头雌蜱可产卵3017粒）7，因此造成巨大危害。目前对蜱类的防治尚无有效的手段，主要是使用化学杀虫剂和人工去除法，杀虫剂的使用不仅使蜱产生抗性，而且对人、畜产生毒性并造成严重环境污染。因此，探索防治蜱类的有效对策，是亟待解决的问题。蜱类的危害程度与其种群数量密切相关，而种群数量主要取决于繁殖的成功率，特别是性信息素在雌雄识别和繁殖中起关键作用。由于该类群身体结构与生理的特殊性，有关蜱类性信息素的研究远远落后于昆虫，到目前为止，仅在少数种类中确定2，6-二氯酚（2,6-dichlorophenol, 2，6-DCP）作为早期雌雄识别的信息素成分8,9,10，其他性信息素成分尚不明确。刘敬泽等7对长角血蜱的生殖行为进行了较详细的研究，提出其生殖行为的完成可分为三个主要阶段，即雄蜱离开吸血附着点靠近雌蜱、雄蜱在雌蜱体上刺探和攀缘、雄蜱对雌蜱生殖孔的定位和精荚的输送，确定了第一阶段的完成是由雌蜱分泌的2，6-DCP引导11，并对2，6-DCP的合成分泌位点、分泌动态和内分泌调控机制进行了系统研究12，13，14，15，提出了2，6-DCP作用的模型，但雌雄识别过程中后两个阶段的性信息素成分、结构、生物学功能等尚不明确，其他蜱种也未有发现。本项目以河北省优势蜱种长角血蜱为研究对象，在申请者前期工作积累的基础上，运用生物化学、层析色谱（TLC）、气相色谱（GC）、气相色谱/质谱（GC/MS）和生物测定等多学科交叉的研究技术，对其性信息素进行深入而系统的研究，揭示长角血蜱生殖行为过程中性信息素的成分、化学结构和生物学功能。并以长角血蜱为模式动物，综合分析蜱类生殖行为过程中的性信息素调节机制，为开展更为深入的研究以及制定蜱类的有效防治对策建立基础，具有重要的理论意义和实际应用潜能。主要参考文献1 Hamilton, J.G.C. The role of pheromones in tick biology. Parasitology Today, 1992 ，8(4): 130-133.2 邓国藩. 中国蜱螨概要. 北京：科学出版社. 1989.3 邓国藩，姜在阶. 中国经济昆虫志 第三十九册 蜱螨亚纲 硬蜱科. 北京：科学出版社. 1991.4 F.A.O. Report. A practical field manual. Vol. 1, Tick Control. (F.A.O. Rome, 1984).5 Chinzei,Y. and D. Taylor. Hormonal regulation of vitellogenin biosynthesis in ticks. In Advances in Disease Vector Research, Vol.10. New York：Springer-Verlag, 1994，pp: 1-22.6 李存栓等. 河北省长角血蜱的生物学特性及药敏试验研究. 中国动物科学研究，1999，pp: 373-378.7 刘敬泽（1）. 实验室条件下长角血蜱的生物学特性研究. 昆虫学报，1998 ，43 (4): 280-283.8 Sonenshine, D. E. Biology of Ticks. Volume 1, Oxford University Press, New York, 1991，pp:349-356.9 Hanson, P.E. et al. Biological activity of chlorinated phenols in the American dog tick, Dermacentor variabilis (Acari: Ixodidae). International Journal of Acarology, 2002; 28 (1): 55-60.10 Yoder,J.A. et al. On the role of 2,6-dichlorophenol as a tick sex pheromone (Acari: Ixodidae). International Journal of Acarology, 2002; 28 (1): 49-54.11刘敬泽（1）. 性信息素2,6-二氯酚在长角血蜱交配行为中的作用. 昆虫学报，1999，42 (1): 31-36.12刘敬泽（1）. 长角血蜱性信息素2,6-二氯酚含量变化及其生物学作用. 寄生虫与医学昆虫学报，1998，5（4）：253-257.13 刘敬泽（1）.长角血蜱性信息素生物合成的激素调控. 北京师范大学学报(自然科学版). 1997，33 (1): 130-134.14 Liu，J. Z. et al. Effects of juvenile hormone III on Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae). Systematic and Applied Acarology, 1999，4: 3-7.15 Liu，J. Z. et al. Relationship between ecdysteroids and sex pheromone, 2,6-DCP, of female Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae). Korean Journal of Entomology, 1999，29 (1): 65-67.四、研究内容和预期成果(说明项目的具体研究内容和重点解决的关键问题，预期成果和提供的形式。理论成果，应写明在理论上解决哪些科学问题及其科学价值；应用性成果或基础性资料，应写明其应用的可能性及预期效益)（一）主要研究内容1. 确定雌蜱性信息素的成分：选用不同极性的溶剂或溶剂配比，提取、分离、纯化长角血蜱雌蜱分泌的性信息素成分，结合生物测定方法，确定与雄蜱生殖行为有关的化学组分。2. 性信息素的结构鉴定：将分离纯化出的有效成分（生物活性成分）浓集到一定量后，用气相色谱 (GC)、气相色谱/质谱 (GC/MS) 等方法对各组分进行结构鉴定，确定其化学结构。3. 性信息素的分泌动态：测定雌蜱不同发育阶段性信息素成分和含量的动态变化，并结合雌雄个体的生殖行为过程，进一步阐明性信息素的生物学功能。（二）重点解决的关键问题有关蜱类性信息素的研究远远落后于昆虫，目前仅在某些蜱类中确定早期诱导的性信息素成分2,6-DCP,但生殖行为后期的性信息素成分尚不明确。本项目中的关键问题是揭示长角血蜱雌蜱性信息素化学结构、组成成分及其在生殖行为中的作用。（三）预期目标本项目在申请者前期工作积累的基础上，综合运用生物化学、层析色谱（TLC）、气相色谱（GC）、气相色谱/质谱（GC/MS）和生物测定等多学科交叉的研究技术，对长角血蜱性信息素进行深入而系统的研究，将阐明长角血蜱性信息素的组分、化学结构、生物学功能和分泌活性动态。提出长角血蜱生殖行为过程中性信息素功能组分、分泌和生物学功能的工作模型。项目完成后提交验收报告，组织专家对项目鉴定验收，预期在国内外重要学术期刊发表研究论文4-6篇。五、拟采取的研究方法和技术路线(包括理论分析、计算、实验方法和步骤及其可行性分析、创新处；研究工作的总体安排和年度进度)（一）研究方法和技术路线1. 确定性信息素的成分：用不同极性的溶剂或溶剂配比提取长角血蜱雌蜱体表分泌物，通过生物测定确定哪一提取物中含有性信息素活性成分。然后用生物化学和TLC等方法对有效成分进行分离纯化，再结合生物测定确定与生殖行为有关的化学成分。2. 性信息素的结构鉴定：将分离纯化出的有效成分进行气相色谱 (GC)分析。然后将其浓集到一定量后，用气相色谱/质谱 (GC/MS) 等方法对各组分进行结构鉴定，确定其化学结构。在色谱分析中，可根据该化合物的化学性质选择合适的衍生试剂，以提高仪器对性信息素的检测率。3. 性信息素的分泌动态与功能：用气相色谱法测定雌蜱不同发育阶段性信息素的含量变化，并结合生殖行为过程，进一步阐明性信息素的功能和分泌动态。（二）可行性分析与创新性评价以上研究方法已经过研究组充分论证，其中GC、GC/MS、TLC在昆虫信息素研究中经常使用（申请者已在蜱类研究中成功地运用）。申请者多年来应用气相色谱（GC）分析蜱类性信息素2，6-DCP和保幼激素，并首次应用衍生方法完成了2，6-DCP的动态分析，取得了重要的研究成果，积累了丰富的经验。主要参加者在GC、GC/MS分析和生物化学分析研究中有丰富的经验。因此，实验方法和技术路线可行，能完成项目中的预期结果。本课题用多学科交叉的研究技术，以长角血蜱为模式动物，对蜱类生殖行为的化学通讯机制进行深入而系统的研究，以阐明性信息素的组成成分、化学结构和分泌动态，填补该领域研究中的不足和空白，是前期工作的延续，项目完成后预期达到国际先进水平。（三）总体安排与年度进度本研究拟用3年的时间完成：2004年1月-2004年12月：进行性信息素的分离、纯化，分析其组成，并初步进行GC 、GC/MS的测试工作。2005年1月-2005年12月：（1）重点进行用GC、GC/MS确定性信息素的化学结构；（2）研究性信息素分泌活性的动态变化及在生殖行为中的作用。2006年1月-2006年12月：补充和重复上述某些实验结果。提交验收报告，组织专家对项目鉴定验收，预期在国内外重要学术期刊发表研究论文4-6篇。六、实现本项目预期目标已具备的条件(包括过去的研究工作基础，现有的主要仪器设备、研究技术人员及协作条件，从其它渠道已得到的经费情况，在研或完成的省基金资助项目情况)申请者，刘敬泽，39岁，博士学位，教授，博士生导师，学术带头人。现为国际系统与应用蜱螨学会（SAAS）理事、执行委员，中国昆虫学会昆虫生理生化与分子生物学专业委员会理事、中国昆虫学会蜱螨专业委员会理事、河北省动物学会常务理事、国际SAA和医学动物仿制编委，国家自然科学基金项目评议组成员。曾先后到美国Massachusetts大学和Harvard大学作高级访问学者，2002年参加在墨西哥举行的第11届国际蜱螨学大会并应邀作为专题会议主持人。自1990年以来一直从事蜱类的研究工作，对蜱类生物学、生态学、神经内分泌和化学通讯有较深入的研究。先后主持、主研完成有关蜱类方面的国家自然科学基金项目四项：“蜕皮激素在蜱类发育和生殖中的作用，批准号：39170126，主研”（1991-1993）、“保幼激素在蜱类发育和生殖中的作用，批准号：39370116，主研”（1994-1996）、“蜱类保幼激素的结构与功能研究，批准号：30170128，主持”（2002-2004）、“国家自然科学基金国际合作与交流项目，批准号：30210203145，主持”（2002）；主持完成河北省自然科学基金“利用昆虫病原线虫防治蜱类的研究，批准号：300168”（2000-2002）。近年来，在国内外重要学术刊物发表研究论文51篇，其中41篇为第一作者或独立完成，出版著作10部，其中主编4部。取得的主要成果有：（1）确定了蜱类蜕皮激素的结构、合成分泌部位和生理机能；（2）与美国麻省 （Massachusetts） 大学昆虫系合作，在蜱类保幼激素的研究领域取得突破性进展，首次在一种硬蜱发现存在保幼激素，并发现一种在昆虫中没有的保幼激素新成分，证明了保幼激素对蜱类发育和生殖的作用；（3）确定了蜱类雌雄早期识别的性信息素结构、合成分泌部位、分泌活性和内分泌调控以及在生殖行为中的作用；（4）首次利用昆虫病原线虫探索防治蜱类的研究，筛选出了蜱类敏感的线虫品系、敏感期，确定了线虫侵袭蜱类的途径、致病机理等。上述研究为本项目奠定了良好的基础，本研究是前期工作的进一步延续和更为深入的研究。主要参加者在气相色谱和质谱分析、蜱类形态学、生物学、生理生态学、生物化学分析等领域积累了丰富的经验，为顺利完成本项目奠定了坚实的基础。课题组所在单位为生物学一级学科博士学位授权点，所在学科为河北省重点学科，实验室为河北省重点实验室，具备了良好的实验条件。与本项目有关的主要仪器有GC一台，GC/MS联用仪一台，层析冷柜一台， Refrigerated condensation trap RT400一台，旋转蒸发仪一台，光照培养箱两台，动物饲养房和其他中小型生物化学与分析化学仪器等。并与北京化学所达成协议，可利用该部门高灵敏度的GC/MS联用仪，其最小检测量可达1ng。七、申请者和项目主要成员业务简历(按人填写最高学历、学位、身份证号和研究工作简历，近期发表的与本项目有关主要论著目录和科研成果名称及获奖情况，标明本人名次)刘敬泽（1964- ），男，河北冀州人，博士研究生学历，1997年取得理学博士学位，身份证号130102641021063。现为河北师范大学生命科学学院教授，博士生导师，学术带头人，生命科学学院副院长。国际系统与应用蜱螨学会（SAAS）理事、执行委员，中国昆虫学会蜱螨专业委员会理事、中国昆虫学会昆虫生理生化与分子生物学专业委员会理事、河北省动物学会常务理事、国际SAA和医学动物仿制编委。2002-2003到美国Massachusetts大学和Harvard大学作高级访问学者，2002年参加在墨西哥举行的第11届国际蜱螨学大会并作为会议主持人。曾获河北省十大优秀青年教师（三等功）、河北省人事厅首批优秀专家、河北省科技发明创造奖（一等奖）和中化园丁奖等荣誉称号。本人长期从事动物生理生态与分子生态学研究，主持、主研完成有关蜱类的国家自然科学基金项目四项：“蜕皮激素在蜱类发育和生殖中的作用，批准号：39170126，主研”（1991-1993）、“保幼激素在蜱类发育和生殖中的作用，批准号：39370116，主研”（1994-1996）、“蜱类保幼激素的结构与功能研究，批准号：30170128，主持”（2002-2004）、“国家自然科学基金国际合作与交流项目，批准号：30210203145，主持”（2002）；主持完成河北省自然科学基金“利用昆虫病原线虫防治蜱类的研究，批准号：300168”（2000-2002）。近年来，在国内外重要学术刊物Systematic and Applied Acarology、Korean Journal of Entomology、Entomologia Sinica、昆虫学报、寄生虫与医学昆虫学报等发表研究论文51篇，其中41篇为第一作者或独立完成。在科学出版社、高等教育出版社、人民教育出版社、中国农业出版社、河北科学技术出版社等出版著作10部，其中主编4部。取得的主要成果有：（1）确定了蜱类蜕皮激素的结构、合成分泌部位和生理机能；（2）与美国麻省 （Massachusetts） 大学昆虫系合作，在蜱类保幼激素的研究领域取得突破性进展，首次在一种硬蜱发现存在保幼激素，并发现一种在昆虫中没有的保幼激素新成分，证明了保幼激素对蜱类发育和生殖的作用；（3）确定了蜱类雌雄早期识别的性信息素结构、合成分泌部位、分泌活性和内分泌调控以及在生殖行为中的作用；（4）首次利用昆虫病原线虫开展防治蜱类的研究，筛选出了蜱类敏感的线虫品系、敏感期，确定了线虫侵袭蜱类的途径、致病机理等。有关的主要论文和著作有：1 Jingze Liu（1）. Effects of juvenile hormone III on Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae) . Systematic and Applied Acarology. 1999，4: 3-7.2 Jingze Liu（1）. Relationship between ecdysteroids and sex pheromone, 2,6-DCP, of female Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae). Korean Journal of Entomology. 1999，29 (1): 65-67.3 Jingze Liu（1）. Evidence for the existence of juvenile hormone synthesized by the synganglion of Haemaphysalis longicornis (Acari:Ixodidae). Systematic and Applied Acarology. 1997, 2: 51-56.4 Jingze Liu（1）. Ecdysteroids in the larva of Haemaphysalis longicornis Neumann (Acari: Ixodidae). Entomologia Sinica. 1999 , 6 (3): 267-270.5 Jingze Liu（1）. Structure and changes of the salivary gland of female Dermacentor silvarum Olenev（Acari：Ixodidae）. Entomologia Sinica , 2001，8 (3): 227-232.6 Jingze Liu（1）. Quantitative variation of 20-hydroxyecdysone in nymphs of Dermacentor niveus during its development. Entmologica Sinica, 1995, 2(4): 365-369.7 Jingze Liu（1）2002 Preliminary studies on the juvenile hormone of Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae). Abstract of International Congress of Acarology. 110.8 Jingze Liu（corresponding author）2002 Efficiency of entomopathogenic nematodes on the control of female Dermacentor silvarum Olenev（Acari：Ixodidae）. Abstract of International Congress of Acarology. 111.9 刘敬泽（1）. 性信息素2,6-二氯酚在长角血蜱交配行为中的作用. 昆虫学报, 1999, 42(1): 31-36.10刘敬泽（1）. 长角血蜱若虫发育期20-羟基蜕皮酮含量变化与表皮发生的关系. 昆虫学报, 2001, 44(1): 280-283.11刘敬泽（1）. 实验室条件下长角血蜱的生物学特性研究. 昆虫学报, 1998, 41(3): 280-283.12刘敬泽（1）. 长角血蜱性信息素2,6-二氯酚的含量变化及其生物学作用. 寄生虫与医学昆虫学报, 1998, 5(4): 253-257.13刘敬泽（1）. 长角血蜱若虫蜕皮激素的合成部位和成分. 兰州大学学报（自然科学版）.1999, 35：124-127.14刘敬泽（1）. 长角血蜱性信息素生物合成的激素调控. 北京师范大学学报 (自然科学版), 1997, 33(1): 130-134.15刘敬泽（主编）1999生命科学基础 河北科学技术出版社.16刘敬泽（主编）2000普通生物学中国农业出版社.17刘敬泽（主编）2000生物与环境科学词典人民教育出版社、辽宁教育出版社联合出版.18刘敬泽（独立）2002 蜱螨及其防制 医学动物防制（医学昆虫及鼠类防制专辑）出版.19刘敬泽（编委）2002 生物资源学. 北京：科学出版社. 20刘敬泽（编委）2002 进化生物学. 北京：高等教育出版社. 21刘敬泽（编委）2003 生态学. 北京：高等教育出版社. 刘敬兰（1955- ），女，河北保定人，本科学历，学士学位，身份证号130102550328002。河北师范大学化学学院副教授，研究方向为气相色谱和质谱分析。先后主持、主研完成省级以上课题6项，近年共发表论文32篇，与本项目有关的主要论文有：1 刘敬兰（1）. 中国梨木虱分泌物中氨基酸的分离与分析. 色谱，1999，17（4）:225-227.2 刘敬兰（1）. 梨木虱分泌物中糖的定性定量分析. 分析化学，1998，26（5）：520-523.3 刘敬兰（1）. 二元酸的气相色谱法分析. 色谱, 1999，17（1）：156-159.4 刘敬兰（1）.合成芥子油中异硫氰酸烯丙酯与硫氰酸烯丙酯的气相色谱法分析. 分析实验室, 1997, 16(5)：36-38.5 刘敬兰（1）. 3.5-二叔丁基甲苯的气相色谱法分析. 色谱, 1997, 15(1)：87-886 刘敬兰（1）. 二叔丁基过氧化氢分解产物的气相色谱法分析. 色谱, 1997, 15(4)：354-355.7 刘敬兰（1）. 肥皂霜中有机成分的分析. 分析化学，1999，27（5）:619.8 刘敬兰（1）.气相色谱法测定甲苯氧化产物中苯甲醛及苯甲酸.色谱,1996,14(1)：79.9 刘敬兰（1）.气相色谱法分析季戊四醇的溴代、二溴代产物. 色谱，2000，18（4）：370-371.10 刘敬兰（1）. 溴代季戊四醇的气相色谱法分析. 分析化学，2000，28（7）：825-828.11 刘敬兰（1）. 食品中苯甲酸和山梨酸的气相色谱法分离分析. 分析实验室，2002，21（3）：12 刘敬兰（1）. 山梨醇和甘露醇的气相色谱法分离分析. 分析化学，2001，29（10）：13 刘敬兰（1）. 中国梨木虱分泌物组成及其霉变原因研究. 河北农业大学学报，2001，24（2）：14 刘敬兰（1）. 氯甲酸乙酯和氰甲酸乙酯的气相色谱法分离分析. 分析化学，2001，29（11）。高志华（1977 ），女，硕士研究生学历，硕士学位，身份证号130102770904066。河北师范大学生命科学学院讲师，研究方向为动物生态学。主研国家自然科学基金、河北省自然科学基金和河北省教育厅自然科学基金各1项，发表的相关论文有：1 高志华（1）2002 Efficiency of entomopathogenic nematodes on the control of female Dermacentor silvarum Olenev（Acari：Ixodidae）. Abstract of International Congress of Acarology. 111.2 高志华（1）2003 蜱类防治的研究进展. 寄生虫与医学昆虫学报（接收发表）.3 高志华（1）2003 斯氏线虫和异小杆线虫对两种硬蜱的致病力. 昆虫学报（接收发表）.杨小龙（1977 ），男，在读博士研究生，硕士学位，身份证号130102770321063，研究方向为动物学，发表的相关论文有：1 杨小龙（1） 河北石家庄前大地林区森林革蜱的野外生物学研究. 河北省科学院学报，2002, 19（2）：141-144. 2 杨小龙（2）Preliminary studies on the juvenile hormone of Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae). XI International Congress of Acarology. 110. 3 杨小龙（2）保幼激素类似物法呢醇对长角血蜱雌虫唾液腺的影响. 昆虫学创新与发展, 2002, 143-146. 北京：中国科学技术出版社. 张岩（1979 ），男，在读硕士研究生，硕士学位，身份证号130503790519001，研究方向为动物学，发表的相关论文有：1 张岩（1）2003 昆虫信息素的研究进展. 生物学通报（接收发表）.2 张岩（1）2002 Effects of juvenile hormone III on Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae). Abstract of International Congress of Acarology. 109.魏转（1977 ），女，在读硕士研究生，学士学位，身份证研究方向为动物学。八、合作单位意见(对合作研究内容、参加人员科研素质及保证研究工作条件等签署具体意见) 单位(公章) 年 月 日九、申请者所在单位学术委员会或同行专家审查意见(对本项目的意义、研究方案、申请者和项目组主要成员的科研能力等签署具体意见，如单位无学术委员会，可由五人以上同行专家评议审查)本项目是申请者在前期工作积累的基础上，对长角血蜱性信息素进行的深入研究，内容上具有明显创新和重要的科学及应用价值。申请者刘敬泽教授为河北师范大学动物学博士点学术带头人、博士生导师、河北省首批优秀专家，多年从事蜱类的研究工作，具有严谨的科学态度、工作作风和组织能力，先后主持、主研完成国家自然科学基金项目4项，主持河北省自然科学基金1项，积累了丰富的经验，在蜱类激素和性信息素研究领域取得了突破性进展，受到国内外同行的高度评价，在国际上产生重要反响，并被邀请作为蜱螨学国际会议主持人。主要参加者在分析测试、生理生化分析、生物学与生理学等方面有多年的工作经验和良好的研究基础。本研究所采用的方法先进、多学科交叉、有创新、技术路线明确合理、研究方案可行，能达到预期目标，建议给予支持。我校将提供研究所需要的条件，并监督项目执行。主任或副主任委员(签章) 2003年 06月 30日十、申请者所在单位审查意见(对是否同意学术委会意见，经费预算是否合理，有无其他经费来源，能否保证研究计划实施所需的人力、物力、工作时间等签署具体意见)同意学术委员会意见，该项目经费预算合理、无其他经费来源，我单位保证研究计划实施中的人力、物力和工作时间。 单位领导(签章) 2003年07月01日 单位(公章)2003年07月 十一、参加审查人员姓名年龄专长职称、职务工作单位签 字孙大业段相林黄占景赵建成吴跃峰6647464545细胞生物学动物学遗传学生态学动物学院士教授、院长教授、书记教授、副院长教授、学科主任河北师范大学河北师范大学河北师范大学河北师范大学河北师范大学课题类别卫生厅编号湖南省医药卫生科学技术研究课题计划（合同）申 请 书课题名称：脑脊液中-淀粉样蛋白和tau蛋白的正常值及临床意义的研究 湖南省卫生厅一九九三年十月制简 表研究课题名称(25字内)脑脊液中-淀粉样蛋白和tau蛋白的正常值 及临床意义的研究 类别A.重点 B.一般 C.青年基金申请金额 2万元起止年月起2002年10月止 2003年9月申请者姓名性别男出生年月 1966年7月专业技术职务主治医师学位博士所在部门工作单位名称所在地性质A.高等院校 B.医疗卫生单位 C.科研单位 D.其它课题组总人数高级中级初级辅助人员博士硕士学士参加单位数52212211 课题组主要成员含负责人姓名年龄专业技术职务年参加月数工作单位项目中的分工签章35主治医师全程负责44副主任医师全程协作40主任医师全程负责31主管技师全程协作28医师全程协作-1-研究内容和意义摘要200字内脑脊液中-淀粉样蛋白（-Amyloid Protein, -AP，A）是淀粉样前体蛋白（APP）在分泌酶的作用下裂解出来的含有40-43个氨基酸的蛋白质，脑脊液中A有A40和A42两种形式；两者在正常老年人和Alzheimer病（AD）脑脊液中均存在，A42与AD老年斑形成密切相关。Tau蛋白是脑细胞内的一种功能蛋白，有形成细胞骨架、组装和稳定微管的作用。正常脑细胞内Tau蛋白磷酸化位点很少，因而不易被磷酸化，脑脊液中Tau蛋白的含量较少。AD患者脑细胞内Tau蛋白磷酸化位点增多，Tau蛋白呈异常磷酸化，脑脊液中Tau蛋白的含量增多。本研究拟采用放射免疫法检测不同年龄段人群（包括痴呆和非痴呆）脑脊液40、A42和Tau蛋白含量，通过大样本的分析，界定其参考正常值范围，为Alzheimer病的诊断提供可靠的实验室依据。脑脊液中-淀粉样蛋白（-Amyloid Protein, -AP，A）是淀粉样前体蛋白（APP）在分泌酶的作用下裂解出来的含有40-43个氨基酸的蛋白质，脑脊液中A有A40和A42两种形式；两者在正常老年人和Alzheimer病（AD）脑脊液中均存在，A42与AD老年斑形成密切相关。脑脊液中-淀粉样蛋白（-Amyloid Protein, -AP，A）是淀粉样前体蛋白（APP）在分泌酶的作用下裂解出来的含有40-43个氨基酸的蛋白质，脑脊液中A有A40和A42两种形式；两者在正常老年人和Alzheimer病（AD）脑脊液中均存在，A42与AD老年斑形成密切相关。-2-一 本研究的立项依据和目标本课题研究的意义及同类研究工作国内外研究现状与存在问题，列出主要参考文献随着社会人口逐步进入老龄化阶段，Alzheimer病（AD）已成为人类的第四大死因。AD的研究具有重要的经济意义和社会意义。目前AD的诊断主要靠临床表现、神经心理学测试和影像学检查，缺乏客观的实验室诊断依据。AD的基本病理变化是老年斑和神经元纤维缠结，前者的主要成分是淀粉样蛋白（A），后者的主要成分是Tau蛋白。AD患者脑脊液中A水平是增高还是降低，各家报道不一致1-4。其原因主要与没有分别测定A40、A42和总A有关；且因均采用ELASA法，测出的结果受主客观影响较大，致使A测定的应用价值降低。AD患者脑脊液Tau蛋白水平是增高的，国内外报道是一致的5-6。由此推断：脑脊液Tau蛋白和A联合测定可能会提高实验室诊断AD的应用价值。虽然，国外新近有脑脊液Tau蛋白和A正常值的报道7 ，但目前尚无国人脑脊液Tau蛋白和A的参考正常值。界定国人的脑脊液Tau蛋白和A的参考正常值可为Alzheimer病的诊断提供可靠的实验室依据。参考文献1 丁新生，程虹，张雪玲，等。脑脊液中淀粉样蛋白检测对老年期痴呆的诊断意义。临床神经病学杂志，2001，1：3-5。2 吴恺，胡刚，国泓，等。Alzheimer病患者脑脊液淀粉样蛋白的检测。中华老年医学杂志，1999，1：13-15。3 王磊，袁锦楣，郝洪军，等。Alzheimer病血清和脑脊液-淀粉样蛋白的测定。中国神经精神疾病杂志，1999，2：102-103。4 Kanai M,Matsubara E,Isoe K,et al.Longitudinal study of cerebraospinal fluid levels of tau, A1-40,A1-42(43) in Alzheimers disease:A stady in Japan,Ann Neurology,1998,44:17-26.5 王琨，丁新生，程虹。阿尔茨海默病患者脑脊液Tau、A1-40、A1-42（43）蛋白测及其临床意义。徐州医学院学报，2000，2：109-112。6 Shoji M,Matsubara E,Kanai M,et al.Combination assay of CSF tau , A1-40 and A1-42 as a biochemical marker of Alzheimers disease.J Neurol Sci ,1998,2:134-140.7 Sjogren M,et al .Tau and Abeta42 in cerebrospinal fluid from healthy adults 21-93 years of age:establishment of reference values .Clin Chem 2001;47(10):1776-81.-3-2研究内容、研究目标和拟解决的关键问题研究内容、研究目标： 本研究拟通过对不同年龄段非AD和AD病人脑脊液中 A40、A42和Tau蛋白的检测，确定脑脊液中A40、A42和Tau蛋白的参考正常值。为AD的诊断提供实验室依据。拟解决的问题：理论上说，只有痴呆患者（包括AD性和非AD性）的脑脊液A和Tau蛋白异常，正常人、非神经系统疾病患者和非痴呆神经系统疾病患者脑脊液中A40、A42和Tau蛋白含量是一致的。但为证实这一理论，先将非痴呆组分为正常人、非神经系统疾病患者和非痴呆神经系统疾病三个亚组的脑脊液分别检测，如这一理论得到证实，则将这三个亚组的脑脊液A和Tau蛋白的含量视为正常人的含量来分析，以增加样本量，克服真正的正常人脑脊液来源不足的弊端。 -4-3本课题的特色和创新之处及立论根据（与国内外类似研究比较） 脑脊液是存在于脑室及蛛网膜下腔内的一种无色透明液体，脑细胞的代谢产物可释放到脑脊液中，脑脊液中成分的变化一定程度反应了脑细胞的活动情况。脑脊液取材操作简单，放射免疫法检测受主观干扰因素少，结果可靠。 目前，国内外关于脑脊液A和Tau蛋白检测的报道主要是对已确诊为痴呆的研究，对非痴呆患者脑脊液Tau蛋白和A的检测的报道甚少。本课题拟通过对非痴呆患者的不同人群脑脊液A和Tau蛋白含量的研究，界定其参考正常值，为确诊AD提供实验室依据。 4研究工作的预期结果或成果 预期通过对不同年龄段的非痴呆人群脑脊液Tau蛋白和 A的检测，界定其人群的参考正常值。 -5-5本课题的情报查新情况及结论 检索关键词（个）： 检索年限（前3年以上）： 检索刊物名称（至少有种系国外刊物）： 检索手段（光盘、手工、其它）： 检索结论： 检索机构及检索人盖章-6-二、研究方法和路线、 拟采取的研究实验方法、步骤、技术路线及可行性、可靠性论证方法、步骤、技术路线：1） 脑脊液的收集：包括所有行腰穿（神经内科和非神经内科住院患者）时的脑脊液，除外有明显出血的脑脊液，经离心沉淀后分管于-20冰箱中保存待测。根据痴呆的临床诊断标准分为痴呆组和非痴呆组，然后再分亚组。详见表。 AD 痴呆组- 非AD 正常人 非痴呆组-非神经系统疾病 非痴呆神经系统疾病 2） 选用相应的试剂合，用放射免疫法测定。3） 实验数据的分析、处理。4） 书写论文。可行性、可靠性论证： 1） 腰穿留取脑脊液化验检查是神经内科诊断疾病常用的方法，因而收集足够的脑脊液是可行的。2） 本院核医学科有一流技术的医技人员和成套设备，能够完成该科题的实验检测。3） 试剂合可在国内外生物技术公司购买。 -7-2、研究工作的总体安排及进度： （1）2002年10月-2003年3月 规范实验程序，收集标本。（2）2003年4月-2003年6月 购买试剂