广西地方标准《猪蓝耳病病毒美洲型野毒株和疫苗株的鉴别检测多重荧光定量反转录聚合酶链反应法》（征求意见稿）.doc

ICS 11.220 B 41 DB45 广西壮族自治区 地方标准 DB 45/T XXXXXXXXX 猪蓝耳病病毒美洲型野毒株和疫苗株 的鉴别检测 多重荧光定量反转录 聚合酶链反应法 Multiplex real-time RT-PCR for differential detection of wild and vaccine strain of North American genotype porcine reproductive and respiratory syndrome virus 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 （征求意见稿） （本稿完成日期：2015 年 11 月 15 日） XXXX - XX - XX 发布XXXX - XX - XX 实施 广西壮族自治区质量技术监督局 发 布 DB45/T XXXXXXXXX I 目 次 前言II 1 范围1 2 术语和定义1 3 材料准备2 3.1 试剂2 3.2 仪器设备及耗材2 4 操作方法3 4.1 操作环境3 4.2 待检样品处理3 4.3 待检样品总 RNA 提取3 4.4 反转录3 4.5 多重荧光定量 PCR 3 4.6 阳性对照及阴性对照4 5 结果判定4 5.1 结果分析条件设定4 5.2 质控标准4 5.3 结果判定4 附录 A（规范性附录） 引物、探针序列及结果判定 .5 附录 B（规范性附录） 试剂盒 .7 附录 C（规范性附录） 重组质粒标准品制备 .9 DB45/T XXXXXXXXX II 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 请注意本标准的某些内容可能涉及专利。本标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由广西壮族自治区水产畜牧兽医局提出并归口。 本标准起草单位：广西壮族自治区动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：施开创、莫胜兰、韦建华、屈素洁、王海清、邹联斌、蒙振亩、粟艳琼、李 军。 DB45/T XXXXXXXXX 1 猪蓝耳病病毒美洲型野毒株和疫苗株的鉴别检测 多重荧光定量反 转录聚合酶链反应法 1 范围 本标准规定了用于鉴别检测猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型野毒株及疫苗株的多重荧光定量反转 录聚合酶链反应法的材料准备、操作方法及结果判定。 本标准适用于猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型野毒株及疫苗株的鉴别检测。 2 术语和定义 DB45/T 1010-2014所定义的以及下列术语和定义适用于本文件。 2.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒 porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV 又称猪蓝耳病病毒，属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，其基因组为单股正链 RNA。 2.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型经典株 classical porcine reproductive and respiratory syndrome virus，C-PRRSV 指在病毒 Nsp2 蛋白第 481 位和第 533561 位氨基酸未出现缺失的、以 VR-2332 毒株为代表的美 洲基因型猪繁殖与呼吸综合征病毒。 2.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型变异株 highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，HP-PRRSV 指在病毒 Nsp2 蛋白第 481 位氨基酸和第 533561 位氨基酸出现 30 个氨基酸的不连续缺失为特 征的、以 JXA1毒株为代表的高致病性美洲基因型猪繁殖与呼吸综合征病毒。 2.4 猪繁殖与呼吸综合征病毒野毒株 wild-type porcine reproductive and respiratory syndrome virus，W-PRRSV 指在临床上分离的具有致病性的猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲基因型经典株或变异株。 2.5 猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株 porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccine strain，V-PRRSV DB45/T XXXXXXXXX 2 指HP-PRRSV TJ毒株在 Marc-145 细胞上传代至 92 代后获得的致弱疫苗毒TJM-F92 株。该疫苗株除 了在Nsp2 蛋白存在 481位氨基酸 和 533561位氨基酸 共 30 个氨基酸的不连续缺失外，在628747位 氨基酸还出现120 个氨基酸的整段缺失。 2.6 反转录 reverse transcription，RT 以RNA为模板合成互补脱氧核糖核酸（cDNA）的过程。 2.7 聚合酶链反应 polymerase chain reaction，PCR 是一种由热变性复性延伸三步反应组成一个循环，经多次循环反应，在体外快速扩增特定脱 氧核糖核酸（DNA）片段的方法。 2.8 多重荧光定量聚合酶链反应 multiplex real-time polymerase chain reaction，Multi real- time PCR 简称多重荧光定量 PCR，是 PCR 技术的一种特殊形式。指在同一反应体系中加入多对引物及多条 标有不同荧光基团的探针，同时扩增多个模板并利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过 标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 3 材料准备 3.1 试剂 3.1.1 特异性引物及探针 引物和探针序列见附录A中的表 A.1和表 A.2。上、下游引物及探针的使用浓度均为 25pmol/L。 3.1.2 RNA 抽提试剂盒 商业化的 RNA抽提试剂盒主要成分见附录B 中的 B.1，使用前经技术验证合格。 3.1.3 反转录试剂盒 商业化的反转录试剂盒主要成分见附录B 中的 B.2，使用前经技术验证合格。 3.1.4 荧光定量 PCR 试剂盒 商业化的荧光定量 PCR 试剂盒主要成分见附录B 中的 B.3，使用前经技术验证合格。 3.2 仪器设备及耗材 3.2.1 仪器设备 本方法使用下列仪器设备： a）荧光定量 PCR 仪； b）核酸蛋白分析仪； DB45/T XXXXXXXXX 3 c）高速台式冷冻离心机； d）组织匀浆机； e）混匀器； f）微量移液器。 3.2.2 一次性耗材 一次性耗材包括： a）乳胶手套； b）离心管； c）PCR 反应管； d）吸头； e）荧光 PCR 反应管。 注：离心管、PCR 反应管、吸头、荧光PCR反应管等应使用无 RNA 酶的一次性塑料制品。否则，应在使用前经 DEPC水处理，然后用 1.034105 Pa 高压灭菌 30 min。 4 操作方法 4.1 操作环境 以下操作应在生物安全II级或II级以上防护实验室内、无RNA酶的环境下进行。 4.2 待检样品处理 采取病猪的肺脏、脾脏和淋巴结等组织共约 1 g，置于 2.0 mL 离心管中，加入灭菌的 1 mol/L PBS（pH 7.2）1 mL，用组织匀浆机充分研磨后，反复冻融 3 次；细胞培养物则直接反复冻融 3 次。 以 10 000 g离心 5 min，收集上清，用于总 RNA 抽提，或置 -20 保存备用。 血清样品可直接用于总 RNA 抽提，或置 -20 保存备用。 4.3 待检样品总 RNA 提取 取 200 L 待检样品于无 RNA 酶的 1.5 mL 离心管中，按照 RNA 提取试剂盒操作说明书抽提总 RNA 。 4.4 反转录 反应总体积为10L。在冰浴条件下，在 PCR 反应管中按下列用量分别加入各成分： a）10RT 缓冲液：1L； b）AMV反转录酶（5 U/L）：0.5L； c）dNTP混合物（各10mM/L）：1L ； d）RNA酶抑制剂（40 U/L）：0.25L； e）MgCl2溶液（25 mM/L）：2L； f）随机引物9聚体（50pmol/L）：0.5L； g）待检总 RNA 模板：4 L； h）灭菌双蒸水：补足总体积至 10 L。 DB45/T XXXXXXXXX 4 加完试剂后瞬时离心混匀。将PCR反应管置于普通 PCR 仪内进行反转录。反应程序为：30，10 min；42，30 min；95，5 min。获得的cDNA直接用于荧光定量 PCR 扩增，或置-20保存备用。 4.5 多重荧光定量 PCR 反应总体积为25L。在冰浴条件下，在荧光PCR反应管中按下列用量分别加入各成分： a）Premix Ex Taq 聚合酶：12.5 L； b）ROX 参比染料 II：0.5 L； c）NA-PRRSV-F、NA-PRRSV-R 引物（25 pmol/L）：各 0.3 L； d）TJM-PRRSV-F,TJM-PRRSV-R 引物（25 pmol/L）：各 1L； e）NA-V-PRRSV-P 探针（25 pmol/L）：0.25 L； f）NA-C-PRRSV-P 探针（25 pmol/L）：0.4 L； g）TJM-PRRSV-P 探针（25 pmol/L）：1 L； h）反转录获得的 cDNA：2 L； i）灭菌双蒸水：补足总体积至 25 L。 加完试剂后瞬时离心混匀。将荧光 PCR 反应管置于荧光定量 PCR 仪内，按如下程序进行反应：预 变性 95 20 s；95 5 s；56 20 s ，共 40 个循环；在每次循环的退火延伸时分别收集FAM、JOE和 TAMRA通道的荧光信号。 注：某些商业公司生产的荧光定量PCR仪需加入ROX参比染料。 4.6 阳性对照及阴性对照 4.6.1 阳性对照 以C-PRRSV VR2332毒株、HP-PRRSV JXA1毒株、V-PRRSV TJM-F92毒株的cDNA为阳性对照。病毒细 胞培养物的处理、总RNA的提取以及反转录获得cDNA分别按4.2、4.3、4.4的规定进行。 或者，使用C-PRRSV p-C-Nsp2 质粒、HP-PRRSV p-V-Nsp2 质粒及V-PRRSV p-TJM-Nsp2质粒作为阳 性对照标准品。用核酸蛋白分析仪测定其光吸收值( OD260nm )后计算浓度，用灭菌双蒸水稀释至 1.0106 拷贝/L，作为阳性对照标准品，-20 保存备用。 注：重组质粒p-C-Nsp2、p-V-Nsp2、p-TJM-Nsp2的制备方法见附录C。 4.6.2 阴性对照 用 灭菌双蒸水代替模板作为阴性对照模板。 5 结果判定 5.1 结果分析条件设定 阈值设定根据仪器背景噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过阴性对照样品扩增曲线的最高点为 准。 5.2 质控标准 5.2.1 阴性对照样品 Ct 值36。 5.2.2 阳性对照样品的 Ct 值均应 30，并出现典型的 S 型扩增曲线。反之，此次检测无效。 DB45/T XXXXXXXXX 5 5.3 结果判定 5.3.1 若被检样品出现 C-PRRSV 的特异性扩增曲线，且 Ct 值 36，判定为 C-PRRSV 阳性，记为 C- PRRSV（+）；反之，判定为 C-PRRSV 阴性，记为 C-PRRSV（-）。 5.3.2 若被检样品出现 HP-PRRSV 的特异性扩增曲线，且 Ct 值 36，判定为 HP-PRRSV 阳性，记为 HP-PRRSV（+）；反之，判定为 HP-PRRSV 阴性，记为 HP-PRRSV（-）。 5.3.3 若被检样品出现 V-PRRSV 的特异性扩增曲线，且 Ct 值 36，判定为 V-PRRSV 阳性，记为 V- PRRSV（+）；反之，判定为 V-PRRSV 阴性，记为 V-PRRSV（-）。 注：PRRSV多重荧光定量RT-PCR结果曲线图见附录 A中的图 A.1。 DB45/T XXXXXXXXX 6 附 录 A （规范性附录） 引物、探针序列及结果判定 A.1 PRRSV 特异性引物序列 A.1.1 引物序列及扩增片断长度见表A.1。 表 A.1 引物序列及扩增长度 引物名称引物序列（53）针对毒株长度（bp） NA-PRRSV-FGAGTGGGTCGGCTCCAGTTC NA-PRRSV-RGCCTCATATTCCGTCTGTGA C-PRRSV/HP-PRRSV 195 或 108 TJM-PRRSV-FCAACCCTGCACCTGTGTCAT TJM-PRRSV-RTTCTCCCTTGGAGGGTGCC V-PRRSV133 注：NA-PRRSV-F 和 NA-PRRSV-R 引物对扩增 C-PRRSV 时长度为 195 bp，扩增 HP-PRRSV 时长度为 108 bp；TJM-PRRSV-F 和 TJM-PRRSV-R 引物对扩增 V-PRRSV 时长度为 133 bp。 A.1.2 扩增的C-PRRSV Nsp2基因目的片段 扩增C-PRRSV Nsp2基因中195 bp 的片段。扩增C-PRRSV代表毒株VR-2332株（GenBank 登录号： AY150564）Nsp2基因目的片段的核苷酸序列如下： GAGTGAGCCGGCTCCAATTCCCGCACCTCGCGGAACTGTGTCTCGACCGGTGACACCCTTGAGTGAGCCGATCCCTGTGC CCGCACCGCGGCGTAAGTTTCAGCAGGTGAAAAGATTGAGTTCGGCGGCGGCAATCCCACCGTACCAGGACGAGCCCCTG GATTTGTCTGCTTCCTCACAGACTGAATATGAGGC A.1.3 扩增的HP-PRRSV Nsp2基因目的片段 扩增HP-PRRSV Nsp2基因中108 bp 的片段。扩增HP-PRRSV代表毒株JXA1株（GenBank 登录号： EF112445）Nsp2基因目的片段的核苷酸序列如下： GAGTGGGTCGGCACCAGTTCCTGCACCGCGTAGAACTGTGACAACAACGCTGACGCACCAGGATGAGCCTCTGGATTTGT CTGCGTCCTCACAGACGGAATATGAGGC A.1.4 扩增的V-PRRSV Nsp2基因目的片段 扩增V-PRRSV Nsp2基因中133 bp 的片段。扩增V-PRRSV TJM-F92株Nsp2基因目的片段的核苷酸序 列如下： CAACCCTGCACCTGTGTCATCAAGCAGCTCCCTGTCAAGTGTTAAGATCACACGCCCAACACGCATCCTCGGGAAAATAG GAGACACTGACGAGCTGCTTGACCGGGGTCCCTCGGTACCCTCCAAGGGAGAA A.2 PRRSV 特异性探针序列 探针序列相关信息见表A.2。 DB45/T XXXXXXXXX 7 表 A.2 探针名称及序列 探针名称针对毒株序列（53） NA-V-PRRSV-PHP-PRRSVFAM-TAGAACTGTGACAACAACGCTGA-BHQ-1 NA-C-PRRSV-PC-PRRSVJOE-AACTGTGTCTCGACCGGTGAC-BHQ-1 TJM-PRRSV-PV-PRRSVTAMRA-AGCTCCCTGGGTTCAGTGGCC-BHQ-2 A.3 PRRSV 多重荧光定量RT-PCR扩增曲线图 PRRSV 多重荧光定量RT-PCR扩增曲线见图 A.1。 1 HP-PRRSV（+）； 2 C-PRRSV（+）； 3 V-PRRSV（+）； 4 阴性对照。 图 A.1 PRRSV 多重荧光定量 RT-PCR 扩增曲线图 DB45/T XXXXXXXXX 8 附 录 B （规范性附录） 试剂盒 B.1 商业化的RNA抽提试剂盒 主要成分包括： a）细胞裂解液； b）Proteinase K； c）Carrier RNA d）洗液； e）无水乙醇； f）DEPC 水； g）过滤柱。 B.2 商业化的反转录试剂盒 主要成分包括： a）10RT缓冲液； b）AMV 反转录酶； c）dNTP混合物：包括 dATP、dTTP、dCTP、dGTP； d）RNA酶抑制剂； e）氯化镁（MgCl2）溶液； f）随机引物9聚体。 B.3 商业化的荧光定量PCR试剂盒 主要成分包括： a）Taq DNA聚合酶预混剂：包含 Ex Taq 聚合酶、dNTP 混合物、氯化镁（MgCl2）等； b）ROX 参比染料 II。 B.4 商业化的 RT-PCR 试剂盒 主要成分包括： a）10RT 缓冲液； b）AMV 反转录酶； c）dNTP混合物：包含 dATP、dTTP、dCTP、dGTP； d）RNA酶抑制剂； e）MgCl2 溶液； f）随机引物9聚体； g）5 RT buffer； DB45/T XXXXXXXXX 9 h）Ex Taq HS 聚合酶。 B.5 胶回收试剂盒 主要成分包括： a）GM缓冲液； b）WB缓冲液； c）洗脱缓冲液； d）离心柱； e）收集管。 B.6 T4 连接试剂盒 主要成分包括： a）T4 DNA连接酶； b）10T4 DNA 连接酶缓冲液。 B.7 质粒提取试剂盒 主要成分包括： a）RNase A（10 mg/mL）； b）溶液； c）溶液； d）溶液； e）WA缓冲液； f）WB缓冲液； g）洗脱缓冲液； h）离心柱； i）收集管。 DB45/T XXXXXXXXX 10 B B 附 录 C （规范性附录） 重组质粒标准品制备 C.1 特异性引物 特异性引物序列及扩增片段长度见附录A中的表A.1。 C.2 病毒核酸提取及RT-PCR扩增 分别取C-PRRSV VR-2332株、HP-PRRSV JXA1株、V-PRRSV TJM-F92株细胞培养物，反复冻融3次， 以10 000 g离心 3 min，收集上清，按4.3提取总RNA后，按4.4进行反转录（RT） ，获得cDNA。 以获得的cDNA为模板，分别利用NA-PRRSV-F/NA-PRRSV-R、TJM-PRRSV-F/TJM-PRRSV-R引物对，建 立50 L反应体系，进行单重PCR扩增。在冰浴条件下，在 PCR 反应管中按下列用量分别加入