2015-核酸分子杂交11-10.ppt

1 n5端加帽(cap)和3端多聚腺苷酸化(polyA) 的调控意义 nmRNA的选择剪接(alternative splicing)对 基因表达的调控 nmRNA 运输的控制 转录后水平的调控 P256 2 （一）“戴帽安尾（穿靴）”（核内）5加帽和多 聚腺苷酸化及其调控意义 1.mRNA caping5加上 GpppmNP帽子，tailing 加上AA（50200bp）尾巴。 意义（1）保护作用保护mRNA免受核酸酶降解， （2）标识作用为翻译提供识别位点（CBP） 。 2.rRNA 不易被降解的机理可能是因为其组成核糖 体是在核内组装的。 3.tRNA 合成后形成特殊的空间结构（三叶草，倒 L），可能抵抗降解，半寿期长。 3 4 hnRNA内含子剪接位点的碱基顺序具有最强的保守性 5GTAG 3 5 （二）mRNA的选择剪接对基因表达的调控作用 1. mRNA的选择剪接有多种方式 选择剪接方式要 点 （1）外显子选择Option exon或称外显子跳跃（exon skipping）全 部保留或至少删除1个或几个外显子。 （2）内含子选择Option intron 内含子全部删除保留1个（近来也有 内含子表达的报道）。 （3）互斥外显子Mutually exclusiveexon 2个外显互斥在同1个成 熟mRNA只出现1个。 （4）内部剪接位点Internal splice site 通过剪接供点或受点选择决定 选择或剪切。 m7Gppp m7Gppp intronexonexon AAA AAA P259 6 7 2. 可变剪接的调控机制 SR蛋白家族的调控 n剪接体的形成与多种蛋白质和RNA复合体密切相 关。在可变剪接上保守的SR磷蛋白家族因子的参 与起重要作用。 nSR蛋白家族以不同的质的组成与量的差异选择特 定的mRNA前体剪接位点，不同的SR家族蛋白对 适当的mRNA前体可以诱导出不同选择的剪接方 式，在选择剪接上起决定作用。 8 RNP的调节 nhnRNP-A1在不同组织中的含量变化很大，不 参与组成性剪接。在选择5和3剪接点时具有 可变剪接活性，成为参与可变剪接的调节因子 ，在体内与SR蛋白共同调节组织特异性的剪接 。 nU5hnRNP在酵母中参与5剪接点突变的可变剪 接。 9 外显子限定模型 n真核细胞mRNA前体中内含子远远大于外显子 ，5与3剪接位点可以跨越数万个核苷酸准确 地组合在剪接体中。 n有证据表明，在前速激肽原mRNA前体的可变 剪接中，外显子下游的5剪接位点可影响其上 游内含子3的剪接。 10 选择剪接对基因表达的调控作用（实例） （1）Bax基因转录产物的选择剪接 Bax基因编码产物是与细胞凋亡有关的分子，（ Bax/Bcl2调亡） Bax编码产生的Pr.有几种（、等），结构略有 差异，差异的产生来自mRNA的选择性剪接。 Bax 保留全部（6个）外显子共192个密码子 译出192AA多肽 Bax 保留全部外显子和第5个内含子（含终止码 ） 共218个密码子。 Bax 保留1、3、4、5、6外显子，删除第2个外 显子译出151AA多肽。 11 （2）选择剪接产生的IBr NF- B是非广泛存在的方式作用因子可与基 因上游启动子元件或增加子内部的 B元件结合而 调节基因表达。 NF- B与I Br结合时以无活性NF B/I Br复合体（105KD） 存在于胞浆 I Br基因表达时通过选择剪接删除其 mRNA中的178个或67个密码子阅读框移动产生2 种具有新C端Pr.异构体即I Br1和I Br2 2者缺 失了1个蛋白激酶A位该位点磷酸化调节I Br活性 。 剪接产生I Br异构体有可能使NF- B对胞 内作出不同响应，尚在研究中。 12 13 （三） RNA编辑 nRNA编辑（RNA editing）是在RNA分子上出 现的一种修饰现象。主要指mRNA在转录后因 插入、缺失或核苷酸的替换，改变了DNA模板 来源的遗传信息，从而翻译出氨基酸序列不同 的多种蛋白质。 nRNA编辑似乎是中心法则的例外。编辑扩大了 遗传信息，也可能是生物适应的一种保护措施 。 P260 14 1. 核苷酸的替换 U替换 n最典型的例子是载脂蛋白B的RNA编辑。 U替换使Apo-B 100 CAA编码的谷氨酰胺 突变为UAA的终止密码子，产生编码Apo- B48的mRNA。在蛋白质水平上只保留了 Apo-B100分子N端脂蛋白装配结构域，缺 少了C端低密度脂蛋白受体结合区。 15 16 AI替换 n在珠蛋白、c-Myc、成纤维细胞生长因 子基因中都有因AI替换使互补链的U 被RNA酶A水解的现象。 17 2. 可读框的改变 n可读框的改变主要是核苷酸的插入或缺 失。 nG或C的插入则往往是因为模板上连续几 个C（或G）之后，互补链因一种滑动力 而被添加到RNA中。 18 19 20 3. 向导RNA n向导RNA（gRNA）是一种线粒体内转 录的短RNA（约5570核苷酸），能以 正常碱基配对或GU配对的方式，选择其 5末端“锚区”在mRNA上的互补序列， 为随后插入或缺失U提供模板。 21 22 23 （四）mRNA运输的调控mRNA运输是受控制的 。 1.3H-udR显示约20%mRNA 胞浆，核内RNA约在 1小时内降解成小片段 2.核孔9nm，但可运输9nm颗粒（如核糖体15nm， 在核内组装 入胞作用） 用20nm金颗粒（gold sphere）包装小RNA（如 tRNA或5sRNA） 注射到蛙卵（frogoocyte） 可 迅速过核孔到胞浆。但注射入浆则不能入核说 明mRNA主动运输入胞，但机制不清楚。 P261 24 n翻译起始的调控 未受精卵：隐蔽mRNA(masked mRNA)；受精 ：招募因子(recruitment factor)，激活隐蔽 mRNA 阻遏蛋白的调控：铁结合调节蛋白(regulatory iron-binding protein) 翻译起始因子的调控：eIF-2，血红素对珠蛋白 合成的调节 5AUG对翻译的调控作用：减少正常AUG启动 翻译的作用，使翻译维持在较低水平 mRNA5 端非编码区长度对翻译的影响 翻译水平的调控 25 翻译水平的调控 n原核生物mRNA的半衰期很短，在翻译水平 上的调控对于基因表达的影响也很小。 mRNA的二级结构控制着翻译的起始，核糖 体蛋白的自体控制对蛋白质的合成起抑制 作用。 n真核生物mRNA的半衰期比原核生物长的多 ，因此翻译过程受调控的机会也较多。 26 n翻译水平的调控是真核生物基因表达多 级调控的重要环节之一。真核生物翻译 水平调控最普遍的机制是起始因子的磷 酸化。 n蛋白质合成装置各元件装配活力的改变 是导致蛋白质翻译速率变化的主要因素 。翻译的速度和细胞生长的速度是密切 协调的。 27 一、翻译因子磷酸化调控 n蛋白质合成因子的磷酸化状态与其对蛋白质生 物合成的激活或抑制作用密切相关。 n1 eIF-4F通过亚单位的可逆磷酸化对蛋白质 生物合成进行调控。 eIF-4E()和eIF- 4G(/P220)亚基的磷酸化对蛋白质的生物合成 有激活作用。 28 29 2其他因子磷酸化对翻译的激活作用 neIF-4B在促有丝分裂剂作用下，随eIF-4F和核 糖体蛋白S6一起，在细胞内被磷酸化，激活起 始因子eIF-4A和eIf-4B的活性。 3eIF-2的磷酸化对翻译的抑制作用 neIF-2亚基的磷酸化会导致eIF-2与eIF-2B紧 密结合，直接影响了eIF-2的再利用，引起翻 译起始作用受阻，从而抑制蛋白质的生物合成 。 30 阻遏Pr.的调控作用 进入胞浆并非所有的mRNA分子立即与核糖体 结合翻译成Pr. 一些特定的翻译抑制Pr. 可结合到mRNA5,抑 制翻译。如： 铁Pr.（ferritin）mRNA5端非编码区约30个核甘 酸序列称为铁反应元件（iron-response element） 可折叠成1个茎环（发夹结构） 可结合1个铁结合 调节蛋白（regulatoryiron-binding pro）。 31 3 3 （1）有铁不抑制，快译运输工具。 （2）无铁结合可运铁结合Pr.结合mRNA 抑制翻译。 铁结合调节蛋白 32 Met 40S 60S60S mRNA eIF-2B、eIF-3、 eIF-6 elF-3 ATP ADP+Pi elF4E, elF4G, elF4A, elF4B，PAB Met Met-tRNAiMetelF-2GTP 真核生物肽链 合成起始过程 60S60S 40S Met GDP+Pi 各种elF释放 elF-5 MetMet 80S 起始 复合物 33 34 35 翻译起始因子(eIF2)的调控 36 (2)翻译起始因子调节蛋白质合成的速度 无活 性的 elF-2 elF-2 有活性的 elF-2 P P P P P 37 5-AuG对翻译的调控作用 （1）按Pr.生物合成模型，90%真核mRNA符合第 1AUG规律译出正常Pr. （2）5AUG可以减少正常AUG翻译起始作用使翻 译维持在较低水平。原癌基因中是控制原癌基因表 达的重要因素缺失导致某些原癌基因翻译激活 。 5-AUG(1 个或数个) 第1-AUG 非编码区非 正常开放阅 读框 编码区正常 开放阅读框 53 mRNA 38 nmRNA稳定性调节 3端非编码区结构影响其稳定性：3端富含A 和U的结构，引起mRNA 不稳定 蚕蛹羽化成蛾后，需大量蛋白水解酶溶解蚕 丝蛋白，mRNA半衰期达100小时，其他仅 2.5小时 翻译水平的调控 39 mRNA 降解的机制 40 小分子RNA（lin-4）对翻译水平影响 Lin-14核Pr.调控生长发育的时间选择 Lin-4产生2个小分子RNA：1个长度22个核苷酸，另 1个在3端延长至40个核苷酸 Lin-4RNA结合Lin14mRNA3UTR中的特异顺序 去掉这种顺序mRNA就不会被抑制翻译。 n小分子RNA对翻译水平的影响 41 n新生肽链的水解：酶解 肽链N端的第一个氨基酸：稳定化氨基酸（Met 、Ser、Thr、Ala、Val、Cys、Gly、Pro）与 去稳定氨基酸 n肽链中氨基酸的共价修饰：磷酸化、甲基化、酰 基化 n通过信号肽(signal peptide)分拣、运输、定位 翻译后水平的调控 42 蛋白质合成后的靶向输送（ protein targeting ） n 蛋白质合成后的去向 留在胞浆 进入核、线粒体或其它细胞器 分泌至体液，输送至靶器官 n靶向输送-蛋白质合成后，定向地到达其 执行功能的目标地点 43 n分泌性蛋白质(secretory proteins) 穿过合成所在的细胞到其它组织细胞去的蛋白质 n信号肽(signal peptide) N-端的一段疏水氨基酸 1040个氨基酸 把合成的蛋白质移向胞膜并与胞膜结合，然后把 合成的蛋白质送出胞外 N- N 端碱性 疏水核心区 加工区 -C 碱性氨基酸 极性和小 侧链氨基酸 分泌蛋白 44 分泌性蛋白质转运的机制 SRP: signal recognition particles 45 信号肽 识别颗 粒 信号肽(signal peptide) 46 外膜 转运 体 内膜 转运 体 线粒体蛋白的靶向输送 47 细胞核蛋白的靶向输送 48 分子生物学 Molecular Biology 核酸的分子杂交 Nucleic Acid Hybridization Department of biochemistry and molecular biology 49 碱基碱基 核苷核苷 核苷酸核苷酸 RNA 腺嘌呤（A） 腺苷 腺苷酸(AMP) 鸟嘌呤（G） 鸟苷 鸟苷酸(GMP) 胞嘧啶（C） 胞苷 胞苷酸(CMP) 尿嘧啶（U） 尿苷 尿苷酸(UMP) DNA 腺嘌呤（A） 脱氧腺苷 脱氧腺苷酸(dAMP) 鸟嘌呤（G） 脱氧鸟苷 脱氧鸟苷酸(dGMP) 胞嘧啶（C） 脱氧胞苷 脱氧胞苷酸(dCMP) 胸腺嘧啶（T） 脱氧胸苷 脱氧胸苷酸(dTMP) DNA和RNA的碱基 核苷和相应的核苷酸 50 核苷酸之间连接 51 DNA双螺旋结构 52 Base pairing occurs in duplex DNA and also in intra- and inter-molecular interactions in single-stranded RNA (or DNA). 53 Content of Table 一、核酸分子杂交技术的原理 二、核酸探针的制备 三、核酸探针的标记 四、核酸分子杂交技术 五、DNA芯片技术 54 一、核酸分子杂交技术的原理 有互补特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混在 一起时，其相应同源区段将会退火形成双链结构。 如把一段已知基因（DNA或RNA）的核酸序列 用合适的标记物（如放射性同位素、生物素等）予 以标记，当作探针（probe), 与变性后的单链基因组 DNA或RNA等进行杂交。 用合适方法（如放射自显影或免疫组织化学等 技术）把标记物检测出来，就可确定靶核苷酸序列 的拷贝数及表达丰度等。 55 56 57 nDNA变性是指核酸双螺旋碱基对的氢键断裂 ，双链变成单链，从而使核酸的天然构象 和性质发生改变。变性时维持双螺旋稳定 性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏 ，但不涉及到其一级结构的改变。 n凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如加热、 极端的pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及 甲酰胺等，均可引起核酸分子变性。 58 n溶液粘度降低。DNA双螺旋是紧密的刚性结构，变 性后代之以柔软而松散的无规则单股线性结构， DNA粘度因此而明显下降。 n溶液旋光性发生改变。变性后整个DNA分子的对称 性及分子局部的构性改变，使DNA溶液的旋光性发 生变化。 n 增色效应。指变性后DNA溶液的紫外吸收作用增 强的效应。在DNA双螺旋结构中碱基藏入内侧，变 性时DNA双螺旋解开，于是碱基外露，碱基中电子 的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生增色效 应。 59 n复性指变性DNA 在适当条件下,二条互补链 全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象, 它是变性的一种逆转过程。热变性DNA一般 经缓慢冷却后即可复性,此过程称之为“ 退 火“(annealing)。这一术语也用以描述杂 交核酸分子的形成。DNA的复性不仅受温度 影响,还受DNA自身特性等其它因素的影响 。 60 应 用： 1）检测特定生物有机体之间是否存在 亲缘关系； 2）用来揭示核酸片段中某一特定基因 的存在与否、拷贝数及表达丰度。 61 影响杂交的因素 n核酸分子的浓度和长度 n温度 n离子强度 n杂交液中的甲酰胺 n核酸分子的复杂性 n非特异性杂交反应 62 1、核酸分子的浓度和长度： 浓度越大，复性速度越快 分子越大，复性速度越慢 单链探针，浓度增加，杂交效率增加 双链探针，浓度控制在0.10.5g，浓度 过高影响杂交效率 63 2、温度： （1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低 2025 （2）RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺 降低Tm值 （3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm 值低5 64 3、离子强度： （1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增 加，杂交率增加 （2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定 ，当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时， 必须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶 液的盐浓度 65 4、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降 低杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交 更稳定，当待测核酸与探针同源性不高时，加 50%甲酰胺溶液在3542 杂交 （2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则 用水溶液在68杂交 66 5、核酸分子的复杂性： （1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不 同顺序的总长度 （2）Cot与反应体系中核酸复杂性成正比 （3）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后 的相对杂交率取决于DNA的相对复杂性 67 6、非特异性杂交反应： （1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其 对探针的非特异性吸附 （2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA 和高分子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA ，Denharts溶液或脱脂奶粉 68 常用于预杂交的封闭物 n变性的非特异性DNA：常用鲑鱼精子DNA或小牛 胸腺DNA。当与滤膜一起孵育后，除滤膜上已吸 附样品DNA的区域外，它们可被吸附到所有其它 区域，使整个背景覆盖一层。由于它们与探针无 同源性，在交杂反应中可大大减少探针的非特异 性结合，使背影清晰。 n高分子化合物：某些高分子化合物具有封闭膜上 非特异位点的能力。一般常用小牛血清白蛋白。 Home 69 二、核酸探针的制备 探针（Probe): 一段带有检测标记的与目的 基因或目的DNA特异互补的已知 核苷酸序列。 70 理想的探针 1.要加以标记、带有示踪物，便于杂交后检测和鉴 定杂交分子。 2.应是单链，若为双链用前需要先行变性为单链。 3.具有高度特异性，只与靶核酸序列杂交，不与样 本中存在的其它核酸杂交。 4.探针长度一般是十几个碱基不等，小片段探针较 大片段探针杂交速率快。 5.作为探针的核苷酸序列要选取基因编码序列，避 免用内含子及其它非编码序列。 6.标记的探针应具有高灵敏度、稳定，标记方法简 便、安全。 71 (一）探针的分类 据制备方法及核酸性质不同，可分为： 基因组DNA探针（genomic probe） cDNA探针（cDNA probe） RNA探针（RNA probe） 寡核苷酸探针（oligonucleotide probe) 据探针标记物的类型不同： 同位素标记的探针 非同位素标记的探针 72 1、 Genomic probe 从基因组文库中筛选和纯化获得的一 个特定基因（或基因片段）的克隆片段 。多为某一基因的全部或部分序列（含 有内含子序列），或某一非编码序列， 或某一外显子序列。 73 这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁 殖，取之不尽，制备方法简便。 DNA探针不易降解（相对RNA而言），一般 能有效抑制DNA酶活性。 DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可 供选择，如缺口平移，随机引物法，PCR标 记法等，能用于同位素和非同位素标记。 特点： 74 cDNA（complementary DNA）是指互补 于mRNA的DNA分子。 这种DNA探针不含有内含子序列。因此 尤其适用于基因表达的检测。 2、 cDNA probe 75 采用基因克隆或体外转录的方法获 得。有些病毒的基因组是RNA，分离后 经适当标记可制成RNA探针。 3、 RNA probe 76 RNA探针 优势 杂交的效率高，杂交体 较稳定。 RNA中不存在高度重复 序列，因此非特异性杂 交较少。 杂交后RNase将未杂交 的探针分子消化掉，使 本底降低。 77 寡核苷酸探针是采用DNA合成仪人工合成的， 与已知基因DNA互补的，长度可从十几到几十个核 苷酸的片段。一般长度为 2050 个碱基。 亦可根据蛋白质氨基酸序列推导出核酸顺序加 以人工合成。 4、oligonucleotide probe 78 探针的制备方法 探针长度一般以50300bp为宜。 制备方法： 1）利用DNA重组技术（基因组DNA探 针制备） 2）PCR扩增（cDNA探针制备） 3）化学合成（寡核苷酸探针制备） 79 制备基因组文库 细胞DNA酶切 重组DNA 筛选获目的基因 转化细菌，培养 存在于转化细菌内，由克隆载 体所携带的所有基因组DNA的 集合称为基因组DNA文库（ genomic DNA library) 。 制备探针时，增殖细菌，扩增 、提取质粒，用限制酶切，回 收特定基因片段，经标记则成 为基因组DNA探针。 80 Construction of a Human Genomic Library 81 Restriction Enzyme - Action of EcoRI 82 DNA recombination 83 cDNA 探针制备 逆转录合成cDNA 分离纯化mRNA PCR扩增 84 根据已知的核酸顺 序，采用DNA合成仪 合成一定长度的寡核 苷酸片段或根据蛋白 质氨基酸序列推导出 核酸顺序加以人工合 成。 化学合成（寡核苷酸探针制备） Genetic code 85 合成寡核苷酸探针注意原则： 1）长度（18-50 bp); 2）G:C对含量40%-60%； 3）探针内避免互补； 4）避免同一碱基连续出现； 5）与非靶序列有70%以上同源性或连续8个 以上碱基序列相同，最好不用。 Home 86 三、核酸探针的标记 为确定探针是否与相应基因组 DNA杂交，有必要对探针加以标记， 以便在结合部位获得可识别的信号。 87 （一）标记物 1、理想标记物应具备的特性： 1）标记前后探针的基本结构、化学性质 相同; 2）特异性强、本底低、重复性好； 3）操作简单、节时； 4）安全、无环境污染。 88 放射性核素非放射性标记 主要有：32P、35S、3H、125I、131I等。 优点：灵敏度和特异性极高，可检出样 品中少于1000个分子的核酸量。 缺点：半衰期短，稳定性差，污染环 境、检测需时较长。 主要有：生物素、地高辛、辣根过氧 化物酶，碱性磷酸酶及FITC等。 优点： 具有稳定、安全、经济及实验周 期短等特点，近年来应用越来越 广泛。 缺点：灵敏度低于放射性核素标记的探针 2、 标 记 的 种 类 89 （二）探针的标记方法 n放射性同位素标记法 v缺口平移法(Nick translation) v随机引物延伸法(Random primer labelling) v末端标记法(End labelling) n非放射性同位素标记法 v酶促标记法、化学标记法 90 缺口平移法的原理 n 将DNAase I 的水解活性与大肠杆菌DNA polymerase I 的53聚合酶活性和5 3外切酶活 性相结合。 nDNAase I 在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助 于E.coli的DNA pol I的53外切酶活性，切去带有5 -磷酸的核苷酸；同时利用该酶53聚合酶活性，使 生物素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。 n 这两种活性同时作用，缺口不断向3方向移动， DNA链上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带 有标记的DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记 DNA探针。 91 切口移位（平移）法 92 93 94 随机引物标记法原理 用一些六核苷酸作为随机引物，将 这些引物和探针DNA片段一起热变性 ，退火后，引物与单链DNA互补结合 ，再在DNA聚合酶的作用下，按碱基 互补配对原则不断在其3- OH端添加 标记的单核苷酸修补缺口，合成新的 标记的探针片段。 95 96 97 末端标记法原理 （1）一种是在5末端加成标记法： 先用碱性磷酸酶（AP）去掉dsDNA 5- 磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化标记的 ATP转移加到DNA片段5-OH上。 （2）在探针3-末端用末端转移酶掺入一个 单标记的ddUTP。 98 末端标记法 99 100 非放射性同位素标记法 光敏生物素标记核酸 由一个光敏基团、一个连接臂和 一个生物素基团组成。光生物素 的光敏基团是-N3，它在光作用 下可与核酸中的碱基结合。 酶促标记法 将标记物预先标记在核苷酸分子 上，利用酶促聚合反应将其掺入 到待标记的探针分子中去，或将 核苷酸分子上的标记基团交换到 核酸分子上。 101 探针的纯化 1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可 去除dNTP和蛋白质 2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将 大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷 酸（80bp)等物质分离，常用凝胶基质是Sephadex G-50 3、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相 同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此 法则是利用离心的方式来纯化探针 102 103 核酸分子杂交信号的检测 n放射性同位素标记探针： 放射自显影。 n非放射性同位素标记探针： 偶联反应+显色反应 。 104 放射自显影 通过X光片检 测放射性核素标 记物。 其基本原理为： 同位素在不断衰 变过程中释放出 -粒子，粒子撞 击X光片感光层 ，形成潜在影象 ，经过显影即可 见到成像。 105 1偶联反应 可以通过抗原-抗体免疫反应系统与显色 体系偶联。地高辛系类固醇半抗原化合物，地高辛标 记探针杂交信号可通过酶联免疫法与抗地高辛抗体和 碱性磷酸酶的复合物结合，再进行酶促显色反应。 2显色反应 （1）酶促显色法：最常用的酶是碱性磷酸酶和辣根过 氧化物酶 （2）荧光法：荧光素探针主要用于原位杂交，最常用 的为FITC。 （3）化学发光法：化学发光指在化学反应过程中伴随 的发光反 应。 化学法检测 106 107 地高辛标记探针杂交信号检测 Home 108 四、核酸分子杂交技术 核酸分子杂交 固相杂交 液相杂交 印迹杂交 原位杂交 n固相杂交：结合于某种固相支持物上的待 测样品与溶解于杂交液中的探针进行的杂 交。包括膜上印迹杂交、原位杂交。 n液相杂交：待测样品和探针均溶于液体中 进行杂交反应。 109 菌落杂交 (Colony in situ hybridization) 常用的固相杂交类型 Southern印迹杂交 (Southern blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) 其他类型杂交 （Other hybridization) 斑点杂交 (Dot blotting) Northern印迹杂交 (Northern blotting) 110 核酸分子杂交的基本程序 111 此技术由Southern 1975年首先设计。被 检测对象为DNA。 （一）Southern 印迹杂交 112 Paper Towels Southern Blotting tissue SDS蛋白酶K 酚/氯仿 无水乙醇 离心 113 带有DNA片段的凝胶 DNA分子 限制片段 限制性酶切割 琼脂糖电泳 至膜（尼龙膜或硝酸 纤维素滤膜）上 转膜 杂交、显影 凝胶 滤膜 用缓冲液转移DNA 吸附有DNA 片段的膜 Southern 印迹杂交的技术流程 114 1、待测核酸样品的制备 、裂解或破碎细胞 、抽取纯化基因组DNA 、限制酶消化DNA为大小不同的 DNA片段 115 2、待测DNA样品的电泳分离 、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶 分离小片段用高浓度胶 、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子 DNA泳动慢,小分子DNA泳动 快，大小 相同的分子处于同一 条带 、分子量标准：经Hind消化的DNA，杂 交所用分子量标准可用核素 标记 116 3、凝胶中核酸的变性（碱变化） 凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性 断裂为较短的单链 DNA，中性缓冲液中 和凝胶中的缓冲液。 4、Southern印迹 指将电泳分离的DNA片段转移到 一定的固相支持物上的过程。 117 固相支持物的选择 （1）理想的固相支持物应具备的特性 具有较强结合核酸分子的能力 不影响与探针的杂交反应 与核酸分子结合稳定牢固 具有良好的机械性能 非特异吸附少 118 （2）常用的固相支持物 硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交 信号本 底低。缺点是DNA分子依靠疏水作用而吸 附在膜上，结合不牢固 尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能 力比硝酸纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高 化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合； 对不同大小的DNA片段有同等结合能力；缺点： 结合能力较低 119 120 121 122 123 Southern印迹的常用方法 利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中 的DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是： 容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸 钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥 、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时 带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的 DNA片段移出凝胶而滞留在膜上。 （1）毛细管虹吸印迹法 124 白瓷盘 玻璃板 滤纸 凝胶尼龙膜滤纸 吸水纸 玻璃板重物 吸水纸转膜 125 126 （2）真空转移法 此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以 滤膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一 个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液 从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真 空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下 面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。 127 真空转膜槽 滤纸 尼龙膜 凝胶 盖子 + - 真空转膜 128 129 （3）电转法 利用电场的电泳作用将凝胶中的 DNA转移到固相支持物上。 130 131 5、Southern杂交 、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点 预杂交液为不含DNA探针的杂交液 。 、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA 杂交，双链DNA探针需加热变性为单 链，再杂交。 、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合 的 DNA。 132 6、杂交结果检测 1、放射自显影：适用于放射性核素标 记的探针 2、比色或化学发光检测：适于非核素 标记的探针 133 7、Southern杂交在医学中的应用 1、酶切图谱分析 2、特定基因定性和定量 3、基因突变分析 4、限制性片段长度多态性的分析 134 （二）Northern印迹杂交 1、基本原理和基本过程与Southern blot基 本相同 2、检测目的RNA的存在与否及含量 3、探针可用DNA或RNA片段 4、待测样品为总RNA或mRNA 这是经典的RNA分析法，目前主要用于检测某一 组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平以及 比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。 135 Northern印迹与Southern 印迹的不同点 1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加 变性剂保持RNA处于变性状态，DNA电泳前 和电泳中不变性 2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理 ，Southern 印迹时，DNA转膜前需进行碱变 性及中和处理 3、靶核酸为RNA 136 28S 18S RNA电泳 137 138 -1，4糖基转移酶在损伤坐骨神经中的表达 139 Northern 杂交的主要用途 主要用于检测某一组织或细胞 中已知的特异mRNA的表达水平以 及比较不同组织和细胞的同一基因 的表达情况。 140 （三）Western印迹杂交 检测蛋白质，即将电泳分离的非 标记蛋白质转移到固相载体上，用特 异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量 的方法。 141 主要步骤： 蛋白质样品的制备 PAGE电泳 蛋白质的电转移：PVDF膜 靶蛋白的免疫学检测 n靶蛋白于第一抗体（一 抗）反应 n与标记的第二抗体（酶 标二抗）反应 n显色反应：酶促反应 142 143 144 （四）斑点印迹杂交和狭线印迹杂交 Dot blotting and slot blotting 原理：是将被检标本的RNA或DNA变性后直接点样 吸附于硝酸纤维膜上，然后用标记探针与之杂交。 这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同 时检测多个样品。 优点：用于基因组中特定基因及其表达的定性及定 量分析，方法简便、快速、灵敏、样品用量少。 缺点：不能鉴定所测基因的分子量，特异性不高， 有一定比例的假阳性。 145 146 147 (五）原位杂交in situ hybridization 又分为菌落杂交或噬菌斑、以及 真核细胞原位杂交。 它是利用标记的已知核酸探针，在组织 、细胞及染色体上检测特异的DNA或RNA 序列的核酸杂交技术。组织细胞原位杂交是 检测细胞内的核酸片段，它保持了细胞的形 态结构和组织的立体构型，适合于核酸定位 和分布研究。 148 核酸原位杂交的基本步骤 149 HPVHPV FISHFISH 150 菌落原位杂交 菌落原位杂交是将细菌从培养平板转 移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的 菌落裂菌以释出DNA。将DNA烘干固定于 膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影 检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对 位。 151 152 153 液相杂交 指待测核酸和探针都存