吸光光度法的灵敏度与准确度.ppt

1,吸光光度法的灵敏度与准确度,一. 灵敏度的表示方法:摩尔吸光系数 (),a= b c =a/bc (lmol-1cm-1), 越大, 灵敏度越高: 1045104 为中等灵敏度; 105为高灵敏度; 104为低灵敏度.,2,例1 邻二氮菲光度法测铁 (fe)=1.0mg/l, b=2cm , a=0.38 计算 和,解： c(fe)=1.0 mg/l=1.010-3/55.85 =1.810-5mol/l,3,c =1.0mg/l=1.010-3 g /1000ml = 1.010-4g/100ml,4,二. 准确度仪器测量误差,光度计的读数误差一般为0.22(t),由于t与浓度c不是线性关系，故不同浓度时的t引起的误差不同。,5,浓度测量的相对误差与t(或a)的关系,实际工作中，应控制t在1070, a在0.151.0之间 (调c, b, ),6,8.4 显色反应与分析条件的选择,8.4.1 显色剂与显色反应,无机显色剂: scn- fe(scn)2+ h2o2 tioh2o22+,有机显色剂:,7,有机显色剂,oo型：,on型：,par,s型：,双硫腙,nn型：,丁二酮肟,邻二氮菲,磺基水杨酸,8,显色反应的选择,*灵敏度高，一般104 *选择性好 *显色剂在测定波长处无明显吸收。 对照性好, max60 nm . *反应生成的有色化合物组成恒定，稳定。 *显色条件易于控制，重现性好。,9,8.4.2 显色条件的确定,c(r),c(r),c(r),1. 显色剂用量（c(m)、ph一定）,mo(scn)32+ 浅红 mo(scn)5 橙红 mo(scn)6- 浅红,fe(scn)n3-n,10,2. 显色反应酸度（c(m)、 c(r)一定）,ph1phph2,ph,11,邻二氮菲亚铁反应完全度与ph的关系,fe2+3r,c(r)r=10-4moll-1,31021.3,12,ph38为适宜 的酸度范围,13,3. 显色温度及显色时间,另外，还有介质条件、有机溶剂、表面活性剂等,t1(),t2(),t(min),a,14,8.4.3 干扰及消除,测co2(含fe3+) : (掩蔽法),1.化学法,15,测co2 :(生成络合物性质不同),如不能通过控制酸度和掩蔽的办法消除干扰， 则需采取分离法。,测fe3:(控制ph),16,2. 物理法,选择适当的测定波长,17,1. 仅络合物有吸收，溶剂作参比。 如 phenfe2+ 标准曲线 2.待测液也有吸收，被测液作参比。 如 测汽水中的 fe 3. 显色剂或其他试剂也有吸收，空白溶液作参比 例:邻二氮菲光度法测li2co3中的 fe， 参比溶液为不含li2co3样品的所有试剂。 4. 干扰组分与显色剂有反应,又无法掩蔽消除时： 1）掩蔽被测组分，再加入显色剂，作参比. 2）加入等量干扰组分到空白溶液中,作参比.,- 选择适当的参比溶液,18,8.5 吸光光度法的应用,1. 单一组分测定,1) 金属离子: fe-phen, ni-丁二酮肟, co-钴试剂,2) 磷的测定: dna中含p9.2%, rna中含p9.5%, 可得核酸量.,h3po4+12(nh4)2moo4+21hno3 =(nh4)3po412moo3+12nh4no3+12h2o,磷钼黄(小),磷钼(v)蓝(大),19,3) 蛋白质测定溴甲酚绿、考马司亮蓝等 4) 氨基酸测定茚三酮(紫色化合物) 5) 水质检测: nh4+、no2-、mn2+、fe2+、so42-、hg2+- 6) 药物含量测定比吸光系数定量；荷移光谱法测定. 7) 紫外吸收(uv): no2-、no3-、so42-、so32-、co32-、scn-、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋白质等。,20,2. 多组分的测定,xl1, eyl1, exl2, eyl2由x,y标液 在1, 2处分别测得,在1处测组分x, 在2处测组分y,b) 在1处测组分x; 在2处测总吸收,扣除x吸收,可求y,c) x,y组分不能直接测定 a1=exl1bcx+ eyl1bcy(在1处测得a1) a2 =exl2bcx+ eyl2bcy(在2处测得a2),21,3. 光度滴定,22,典型的光度滴定曲线,依据滴定过程中溶液吸光度变化来确定终点的滴定分析方法。,23,4. 络合物组成的测定,(1)摩尔比法: 固定cm ,改变cr,24,(2)等摩尔连续变化法:,25,表观形成常数的测定 (设m、r均无吸收),c(m)=c(r)=c,mmrn型 ?,26,5.一元弱酸离解常数的测定 p330,hl hl,kah+l/hl,高酸度下，几乎全部以hl存在，可测得ahlhlc(hl)； 低酸度下，几乎全部以l存在，可测得al lc(hl). 代入整理：,或,配制一系列c相同,ph不同的溶液,测a.,27,mo吸收曲线,由每份溶液的一对ph、a，可求得一个ka, 取平均值即可.,28,mo离解常数的测定 作图法,29,6. 双波长分光光度法消除干扰(不要求),在2， a2 = ax2+ay2 在1， a1= ax1+ay1,a= a2 - a1 = ax2+ay2 (ax1+ay1) = ax2 ax1 = ax,ay2 ay1,ax =(x2 x1)bcx 消除了y的干扰,30,双波长分光光度法消除浑浊背景干扰,1 2,a 1 -a 2 = a ac,例 牛奶中微量fe的测定,31,7. 导数分光光度法(不要求),a图,混合物导数光谱,0,1,2,3,4,32,常药降压片中氢氯噻嗪含量的测定,1.氢氯噻嗪. 2.硫酸双肼肽嗪 3. 盐酸可乐定 4.常药降压片,33,肝中茚满二酮类抗凝血杀鼠剂的固相萃取,方法：肝匀浆用乙腈浸提，浸提液用6的hclo4稀释，然后用gdx100大孔树脂萃取，用二氯甲烷5ml洗脱杀鼠剂，40挥干，剩余物用0.1moll-1naoh4ml溶解后，紫外导数光谱测定。,a.空白肝普通光谱 b.2.5 mg/l敌鼠溶液的普通光谱 c.空白肝二阶导数光谱 d.2.5 mg/l敌鼠溶液的二阶导数光谱,34,8.1 了解分子对光的吸收与溶液颜色的关系. 吸收曲线定性分析的基础。 定量分析的基础朗伯-比尔定律：a=bc=-lgt 式中各参数的物理意义，定量计算。 8.2 了解目视比色法、分光光度法的特点，分光光度计的基本部件。 8.3 灵敏度的表示