基因工程及其应用2.ppt

第第1 1节节 基因工程及其应用基因工程及其应用 一、基因工程一、基因工程分子水平改变生命分子水平改变生命 通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种 生物的个别基因复制出来，加以修饰改造，然 后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物 的遗传性状（目的）。 1、概念:是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并 通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物新的 遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物 类型和生物产品。 2、 与杂交育种、诱变育种相比较，基因工程育 种的优点有哪些？ 目的性强(定向改造生物的遗传性状) 克服远源杂交不亲和性,实现动物、植物 和微生物之间的基因交流。 育种周期短 2、基因工程原理 不同生物间的基因重组 3、基因工程育种的特点 （一）基因的剪刀（一）基因的剪刀限制性内切酶（简称限制酶）限制性内切酶（简称限制酶） 二、基因操作的工具二、基因操作的工具 1 1、概念、概念: : 限制酶是在生物体限制酶是在生物体( (主要是主要是微生物微生物) )内的一内的一 种酶，能将外来的种酶，能将外来的DNADNA切断切断，由于这种切割作用是在，由于这种切割作用是在 DNADNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。分子内部进行的，故名限制性内切酶。 2 2、 特点：特点：特异性特异性。 即即一种一种限制酶限制酶只能识别双链只能识别双链DNADNA分子的某种分子的某种特定的特定的 核苷酸序列核苷酸序列，并且能使每一条链中，并且能使每一条链中特定部位的两个核苷特定部位的两个核苷 酸之间的磷酸二酯键酸之间的磷酸二酯键断开。断开。 （一）基因的剪刀（一）基因的剪刀限制性内切酶（简称限制酶）限制性内切酶（简称限制酶） 如如: : 大肠杆菌大肠杆菌( (E.coliE.coli) )的一种限制酶的一种限制酶能识别能识别 GAATTCGAATTC序列序列，并在，并在GG和和A A之间切开。之间切开。 限制酶限制酶 切开的是切开的是GG和和A A所在两个脱氧核苷酸所在两个脱氧核苷酸之间之间 的的磷酸二酯键。磷酸二酯键。 （一）基因的剪刀（一）基因的剪刀限制性内切酶（简称限制酶）限制性内切酶（简称限制酶） 限制限制 酶酶 3 3、结果、结果 产生两个产生两个互补的黏性末端互补的黏性末端 什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？ 被限制酶切开的被限制酶切开的DNADNA两条单链的切口两条单链的切口 ，带有几个，带有几个伸出的核苷酸伸出的核苷酸，他们之间正好，他们之间正好 互补配对互补配对，这样的切口叫，这样的切口叫黏性末端黏性末端。 （二）基因的针线（二）基因的针线DNADNA连接酶连接酶 二、基因操作的工具二、基因操作的工具 DNADNA连接酶连接酶可把黏性末端可把黏性末端之间的缝隙之间的缝隙“ “缝缝 合合” ”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来 ，这样一个重组的，这样一个重组的DNADNA分子就形成了。分子就形成了。 磷酸二酯键磷酸二酯键 l1.将双链DNA片段的末端连接，形成磷酸二酯键。 l2.种类： 外源基因外源基因( (如抗虫基因如抗虫基因) )怎样才能导入受体细怎样才能导入受体细 胞胞( (如棉花细胞如棉花细胞) )？ 二、基因操作的工具二、基因操作的工具 （三）（三） 导入过程需要运输工具导入过程需要运输工具运载体运载体。 1 1、运载体的作用有哪些？、运载体的作用有哪些？ 作用一作用一：作为运载工具，将外源基因：作为运载工具，将外源基因( (抗虫基因抗虫基因) )转转 移移到受体细胞到受体细胞( (棉花细胞棉花细胞) )中去。中去。 作用二作用二：利用运载体在受体细胞：利用运载体在受体细胞( (棉花细胞棉花细胞) )内，内，对对 外源基因外源基因( (抗虫基因抗虫基因) )进行进行大量复制大量复制。 （二）基因的运载工具（二）基因的运载工具运载体：运载体： 2 2、常用的运载体主要有三类：、常用的运载体主要有三类： 1 1）细菌细胞质的）细菌细胞质的质粒质粒 2 2）噬菌体噬菌体或某些或某些动植物病毒动植物病毒 3 3、质粒：、质粒： 质粒是染色体外能够进行质粒是染色体外能够进行自主复制自主复制的遗传单位，包括的遗传单位，包括 真核生物的细胞器和细菌细胞中核区外的真核生物的细胞器和细菌细胞中核区外的DNADNA分子。现在分子。现在 习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中核以外的核以外的 DNADNA分子分子。 质粒质粒是基因工程是基因工程最常用最常用的的运载体运载体。 绝大多数细菌质粒都是绝大多数细菌质粒都是闭合环状闭合环状DNADNA分子分子。有的一个。有的一个 细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。 最常用的运载体最常用的运载体 大肠杆菌的质粒：大肠杆菌的质粒： 最常用的质粒最常用的质粒是是大肠杆大肠杆 菌的质粒菌的质粒，其中常含有，其中常含有抗药抗药 基因基因，如四环素的标记基因，如四环素的标记基因 。 质粒的质粒的存在与否对宿主细存在与否对宿主细 胞生存没有决定性作用胞生存没有决定性作用，但，但 复制只能在宿主细胞内成复制只能在宿主细胞内成。 .运载体必需满足的条件 l能够在宿主细胞中自我复制, 或整合到受体细胞的染色 体DNA上随染色体DNA的复制而复制,并稳定地保存。 l有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插 入载体上去。这些供目的基因插入的限制酶切点所处的位 置还必须是运载体本身需要的基因片段之外，这样，才不 致于因目的基因的插入而失活；而每种酶的切点最好只有 一个，以便与外源基因连接。 l有标记基因，便于重组后进行重组子的筛选，或检测基 因表达载体导入受体细胞是否成功。（鉴定和选择） l必须是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入受体 细胞以外的其他生物细胞中去 l运载体大小应适合，以便于提取和体外操作 四个基本步骤：四个基本步骤： 三、基因操作的基本步骤三、基因操作的基本步骤 1 1）提取提取目的基因目的基因 2 2）目的基因）目的基因与运载体结合与运载体结合 3 3）将目的基因）将目的基因导入导入受体细胞受体细胞 4 4）目的基因的）目的基因的检测检测和和表达表达 1 1、目的基因、目的基因 目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因。目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因。 如苏云金芽孢杆菌的如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因抗虫基因，还有植物的，还有植物的 抗病（抗病毒、抗细菌）基因抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子、种子贮藏蛋白的贮藏蛋白的 基因基因，以及人的，以及人的胰岛素基因胰岛素基因、干扰素基因干扰素基因等。等。 从已有的物种直从已有的物种直 接分离基因接分离基因 人工合成基因人工合成基因 2 2、目的基因的提取方法、目的基因的提取方法 （一）提取目的基因（一）提取目的基因 一、目的基因的获取 l（一）目的基因概念: l（二）获取目的基因的方法 1.从基因文库中获得目的基因 供体细胞的DNA中直接分离基因 “鸟枪法”“散弹法” 2.人工合成基因: 基因很小,核苷酸序列已知 反转录法 化学合成法：根据已知的氨基酸序列合成DNA 3.利用PCR技术扩增目的基因 一、目的基因的获取 l（二）获取目的基因的方法 1.从基因文库中获得目的基因 基因文库的概念 种类：基因组文库 cDNA文库 从基因文库中获得目的基因的方法 已知：基因的核苷酸序列；基因功能；基因在染 色体上的位置； 基因转录的产物；基因翻译的产物蛋白质等 鸟枪法 选用适当的限制酶处理某一生物的DNA 切成若干个一定范围大小DNA片段 这些DNA片段分别与载体结合 导入受体菌的群体中储存 把带有目的基因的DNA片段分离出来 在各个受体细胞中大量复制 找出含有目的基因的细胞 n优点 n操作简便 n缺点 n工作量大，有 一定的盲目性 cDNA文库的建立方法：反转录法 l在某种生物发育的某个时期，即细胞中的核糖 体合成多肽的旺盛时期 l分离出mRNA 反转录酶 DNA单链 双链DNA片段 n优点 n专一性强 n缺点 n操作麻烦 nmRNA不稳定、 生存时间短 与载体连接后储存在一个受体菌群中 一、目的基因的获取 l（二）获取目的基因的方法 1.从基因文库中获得目的基因 2.人工合成基因: 已知核苷酸序列，且基因很小 反转录法 根据已知的氨基酸序列合成DNA l3.利用PCR技术扩增目的基因 根据已知氨基酸序列合成DNA 分析基因的核苷酸序列 合成含少量核苷酸的片段 利用碱基互补形成双链片段 连接酶将双链片段连接起来 得到完整基因 nDNA合成仪 n优点 n专一性强 n人工合成自然界 不存在的新基因 n局限性 n合成核苷酸相对 少的简单基因 一、目的基因的获取 l（二）获取目的基因的方法 1.从基因文库中获得目的基因 2.人工合成基因: 3.利用PCR技术扩增目的基因 PCR技术:一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技 术。 条件:已知核苷酸序列,合成引物;热稳定DNA聚合酶 过程: 目的基因DNA受热变性，解链为单链； 引物与单链相应互补序列结合； 在DNA聚合酶的作用下进行延伸，进行复制； 如此重复循环多次 方式：以指数形式扩增，在PCR扩增仪中自动完成 二、基因表达载体的构建 DNA连接酶 碱基互补配对 重组DNA分子 如：重组质粒 质粒基因的黏性末端 与目的基因DNA片 段的黏性末端 n（一）基因表达载体的要求： n1.使目的基因在受体细胞稳定存在,并且可 以遗传给后代；(在受体细胞内对目的基 因进行大量的复制,即克隆） n2.使目的基因能够表达和发挥作用 n（二）基因表达载体的组成： n（三）构建基因表达载体的过程： （三）目的基因与运载体重组（三）目的基因与运载体重组 1 1）用一定的）用一定的限制酶切割质粒限制酶切割质粒，使其出，使其出 现现一个切口一个切口，露出，露出互补的互补的黏性末端黏性末端。 2 2）用）用同一种同一种限制酶限制酶切断目的基因切断目的基因，使，使 其产生其产生相同的相同的黏性末端黏性末端。 3 3）将切下的目的基因片段）将切下的目的基因片段插入质粒插入质粒的的 切口处，再加入适量切口处，再加入适量DNADNA连接酶连接酶，形成了，形成了 一个一个重组重组DNADNA分子分子（重组质粒）（重组质粒） 目的基因与运载体的结合过程，实目的基因与运载体的结合过程，实 际上是际上是不同来源不同来源的的基因重组的过程基因重组的过程。 基因工程 A A G T T C C T TA A G A G T T C C T T A A A G EcoR限制性内切酶 质粒 基因工程 G A A T T CG A A T T C C T T A A GC T T A A G A A T T CG GC T T A A EcoR限制性内切酶 目的基因 基因工程 A G T T C C T T A A G A T A A T G C G C A A T T 重组 DNA 分子 1 1、常用的受体细胞：、常用的受体细胞： 有有微生物微生物（大肠杆菌、枯草杆菌、土（大肠杆菌、枯草杆菌、土 壤农杆菌、酵母菌）和壤农杆菌、酵母菌）和动植物动植物细胞等。细胞等。 2 2、将目的基因导入受体细胞的原理、将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴借鉴细菌或病毒侵染细胞细菌或病毒侵染细胞的途径。的途径。 （三）目的基因导入受体细胞（三）目的基因导入受体细胞 三、将目的基因导入受体细胞 l受体细胞 大肠杆菌 枯草杆菌 土壤农杆菌 酵母菌 动植物细胞 细菌用冰冷CaCl2处理 高温 重组质粒进入受体细胞 随受体细胞的繁殖而复制 获得大量目的基因 增大细胞壁的通透性 (四) 目的基因的检测和表达 大量的受体细胞接受不多的目的基因。处理的受体细 胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来 。 将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有 目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表 达产物的进一步培养、研究。 无表达产物无表达产物 有表达产物无表达产物 大肠杆菌质粒含青霉素抗性基因 受体细胞必须表现出特定的性状 不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能 说明目的基因完成了说明目的基因完成了表达表达。 受体细胞摄入受体细胞摄入DNADNA分子后就说明目的基因完成了分子后就说明目的基因完成了 表达吗？表达吗？ 若若不能表达，要不能表达，要 对抗虫基因再进对抗虫基因再进 行行修饰修饰。 1、基因工程与农牧业、食品工业 生长快、肉质好的转基 因鱼(中国) 乳汁中含有人生长激素 的转基因牛(阿根廷) 转黄瓜抗青枯病基因的甜椒 转鱼抗寒基 因的番茄 转黄瓜抗青枯病基因的甜椒 转鱼抗寒基 因的番茄 转黄瓜抗青枯病基因的马铃薯不会引起过敏的转基因大豆 导入贮藏蛋白基因的超级羊和超级小鼠 导入人基因具特殊用途的猪和小鼠 超级 动物 特殊 动物 2、基因工程与医药卫生 我国生产的部分基因 工程疫苗和药物 基因工程药品的生产 许多药品的生产 是从生物组织中提取 的。受材料来源限制 产量有限，其价格往 往十分昂贵。 微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化 生产。若将生物合成相应药物成分的基因导入微生物 细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问 题，还能大大降低生产成本。 胰岛素从猪、牛等动物的胰 腺中提取，100Kg胰腺只能提取4 -5g的胰岛素，其产量之低和价 格之高可想而知。 将合成的胰岛素 基因导入大肠杆菌， 每2000L培养液就能 产生100g胰岛素！使 其价格降低了30%- 50%! 从人血中提取干扰素 ，300L血才提取1mg！ 通过基因工程 的方式创造了能合 成人干扰素的大肠 杆菌，每1Kg的培养 液可提取2040mg 干扰素 人造血液及其生产 基因诊断与基因治疗 运用基因工程设计制造的“DNA探 针”检测肝炎病毒等病毒感染及遗传缺 陷，不但准确而且迅速。 通过基因工程给患有遗传病的人 体内导入正常基因可“一次性”解除 病人的疾苦。 基因工程的成果与发展前景 1、基因工程与医药卫生 （1）生产基因工程药品 （2）用于基因诊断与基因治疗 基因治疗: 把正常基因导入病人体内,使该基因的表达产物发挥 功能,从而达到治疗疾病的目的,这是治疗遗传病的最 有效的手段. 基因诊断 标记的“DNA探针”单链和被诊断的DNA 单链混合在一起，观察是否出现杂交带。 1、基因诊断的工具标记的DNA探针 2、基因诊断的原理DNA分子杂交原理 3、基因诊断的过程 基因治疗 治疗遗传病的最有效手段 1990年9月，美国对一名患有严重腺苷酸脱氨 酶基因的女童进行了基因治疗。研究人员将腺苷 酸脱氨酶基因转入到取自患者的淋巴细胞中，使 淋巴细胞能够产生腺苷酸脱氨酶，然后，再将这 种淋巴细胞转入到患者体内。半年后，在血液中 检测出了被改造的淋巴细胞，女童体内产生的腺 苷酸脱氨酶也越来越多，免疫能力显著改善。 基因治疗目前都处于初期的临床试验阶段。 3、基因工程与环境保护 环境监测： 基因工程做成的DNA探针能够十分灵敏地 检测环境中的病毒、细菌等污染。 1t水中只有10个病毒也能被DNA探针检测出来 利用基因工程培育的“指示生物”能十分 灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污 染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物 。 环境污染治理： 基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分 解多种污染环境的物质。 通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因 工程培育成功的“超级细菌”却能分解石油中的多种烃 类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解 DDT等毒害物质。 转基因生物和转基因食品的优、缺点 一、优点 （1）解决粮食短缺问题 （2）减少农药使用，从而减少环境污染 （3）节省生产成本，降低粮食售价； （4）增加食物营养，提高附加价值 （5）增加食物种类，提升食物品质 （6）促进生产效率，带动相关产业的发展 转基因生物和转基因食品的优、缺点 二、缺点 （1）可能产生新毒素和新的过敏原 （2）可能产生抗除草剂的杂草 （3）可能使疾病的散播跨越物种障碍 （4）可能会损害生物的多样性 （5）可能干扰生态系统的稳定性 基因工程的成果与发展前景 1、基因工程与医药卫生 （1）生产基因工程药品 （2）用于基因诊断与基因治疗 2、基因工程与农牧业、食品工业 3、基因工程与环境保护 基因工程与环境保护 环境监测： 基因工程做成的DNA探针能够十分灵敏地检 测环境中的病毒、细菌等污染。 环境污染治理： 基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分 解多种污染环境的物质。 通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因 工程培育成功的“超级细菌”却能分解石油中的多种烃 类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解 DDT等毒害物质。 例：有关基因工程的叙述中，错误的是例：有关基因工程的叙述中，错误的是 A A、DNADNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B B、 限制性内切酶用于目的基因的获得限制性内切酶用于目的基因的获得 C C、目的基因须由运载体导入受体细胞目的基因须由运载体导入受体细胞 D D、 人工合成目的基因不需要限制性内切酶人工合成目的基因不需要限制性内切酶 A A 例：有关基因工程的叙述正确的是例：有关基因工程的叙述正确的是 A A、限制酶只在获得目的基因时才用限制酶只在获得目的基因时才用 B B、重组质粒的形成在细胞内完成重组质粒的形成在细胞内完成 C C、质粒都可作为运载体质粒都可作为运载体 D D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供蛋白质的结构可为合成目的基因提供 资料资料 D D 例：基因工程是在例：基因工程是在DNADNA分子水平上进行分子水平上进行 设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不 进行碱基互补配对的步骤是进行碱基互补配对的步骤是 A A、人工合成目的基因人工合成目的基因 B B、目的基因与运载体结合目的基因与运载体结合 C C、将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞 D D、目的基因的检测和表达目的基因的检测和表达 C C 例（2003天津高考卷）采用基因工程的方法培育抗 虫棉，下列导入目的基因的作法正确的是 将毒素蛋白注射到棉花的受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉花受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导入细 菌，用该细菌感染棉花的体细胞，再进行组织培养 将编码毒素蛋白的DNA序列，与细菌质粒重组，注射 到棉的子房并进入受精卵 A B C D C 例：基因工程技术中，获取的真核生物的目的 基因主要来源于 A自然界现存生物体内的基因 B自然突变产生的新基因 C人工诱变产生的新基因 D科学家在实验室中人工合成的基因 D 1下列关于基因工程应用的叙述，正确的是 A.基因治疗就是把缺陷基因诱变成正常基因 B.基因诊断的基本原理是DNA分子杂交 C.一种基因探针能检测水体中的各种病毒 D.原核基因不能用来进行真核生物的遗传改良 2在已知某小片段基因碱基序列的情况下，获得 该基因的最佳方法是 A. 用mRNA为模板逆转录合成DNA B以4种脱氧核苷酸为原料人工合成 C将供体DNA片段转入受体细胞中，再进一步筛选 D由蛋白质的氨基酸序列推测mRNA 高考再现（06 ） B B 3我国科学家运用基因工程技术，将苏云金芽孢杆 菌的抗虫基因导入棉花细胞并成功表达，培育出了抗 虫棉。下列叙述不正确的是 A. 基因非编码区对于抗虫基因在棉花细胞中的表达 不可缺少 B. 重组DNA分子中增加一个碱基对，不一定导致毒蛋 白的毒性丧失 C. 抗虫棉的抗虫基因可通过花粉传递至近缘作物， 从而造成基因污染 D. 转基因棉花是否具有抗虫特性是通过检测棉花对 抗生素抗性来确定的 高考再现（06） D 4用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质。 下列叙述不正确的是 A 常用相同的限制性内切酶处理的基因和质粒 B DNA连接