DNA提取原理和方法.ppt

DNA提取方法简介 DNADNA提取的几种方法提取的几种方法 q 基因组DNA的提取 CTAB法 SDS法 其它 DNADNA提取的几种方法提取的几种方法 q 非基因组DNA的提取 质粒DNA的提取 碱裂解法 煮沸法 线粒体、叶绿体DNA的提取 差速离心结合SDS裂解法 基因组基因组DNADNA CTABCTAB法法 q CTAB法原理（植物DNA提取经典方法） CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基 溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合 物。 具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条 件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里 该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂 抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离 出来。 注：CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。 q CTAB提取缓冲液的经典配方 组份 Tris-HCl （pH8.0 ） EDTA （pH8.0 ） NaCl CTAB-巯基乙醇 终浓度 100 mM 20 mM 1.4M 2%(W/V ) 0.1%（V/V ）使用前加 入 Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP（脱氧核糖核蛋白 ）。CTAB溶解细胞膜， 并结合核酸，使核酸便于分离； -巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除 基因组基因组DNADNA CTABCTAB法法 q CTAB提取缓冲液的改进配方 组份 Tris-HCl （pH8.0） EDTA （pH8.0 ） NaCl CTAB PVP40-巯基乙醇 终浓度 100 mM 20 mM1.4M 3%(W/V ) 5%(W/V ) 2%（V/V） 使用前加入 vPVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶 的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能 和多糖结合，有效去除多糖。 基因组基因组DNADNA CTABCTAB法法 PVP（聚乙烯吡咯烷酮） lPVP 按其平均分子量大小分为四级，习惯上常以 K值表示，不同的K值分别代表相应的PVP平均分 子量范围。K值实际上是与PVP水溶液的相对粘度 有关的特征值，而粘度又是与高聚物分子量有关的 物理量，因此可以用K值来表征PVP的平均分子量 。通常K值越大，其粘度越大，粘接性越强。 l l在研磨过程中加入PVP，其中的CO-N=基有很强的 结合多酚的能力，从源头上减少了酚类被氧化的机 会。 l同时向抽提液中加入还原剂-巯基乙醇，后者能打 断多酚氧化酶中的二硫键，使多酚不易被氧化，随 后经抽提而去除。 q CTAB法流程图 植物材料裂解液 上层溶液 液氮研磨抽提 细胞裂解干燥溶解 离心洗涤 酒精沉淀 DNA溶液 基因组基因组DNADNA CTABCTAB法法 q SDS法原理 基因组基因组DNADNASDSSDS法法 SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（5565）条件下能裂解细 胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖 杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。 组份 Tris-HCl （pH8.0 ） EDTA （pH 8.0 ） NaCl SDS 终浓度 10 mM 20 mM 0.4M 2% q SDS法DNA提取缓冲液 2.65 水浴 60min, 其间缓慢摇动几次。 3.加入150ul 的5mol/ LKac, 混匀, 冰浴15min 左右 q SDS法流程图 （以动物组织为例） 动物组织 细胞裂解 上层溶液组织匀浆 抽提 干燥溶解 离心洗涤 酒精沉淀 DNA溶液 基因组基因组DNADNASDSSDS法法 基因组基因组DNADNA其它方法其它方法 物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 生物方式：酶法 q 根据细胞裂解方式的不同有： 基因组基因组DNADNA其它方法其它方法 吸附材料结合法： q 根据核酸分离纯化方式的不同有： 硅质材料 阴离子交换树脂 磁珠 高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。 低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。 适用于纯度要求高的实验。 磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的 物，从而达到分离目的。 基因组基因组DNADNA其它方法其它方法 浓盐法： 有机溶剂抽提法： 密度梯度离心法： 利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离 有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用 利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物 质粒质粒DNADNA碱裂解法碱裂解法 q 碱裂解法原理 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。 质粒质粒DNADNA碱裂解法碱裂解法 q 碱裂解法流程图 对数期菌体 溶液III中和 溶液I充分重悬 溶液II裂解 上清液 抽提 离心洗涤 酒精沉淀 干燥溶解 沉淀 质粒DNA溶液 SDS碱裂解法提取质粒DNA中溶液1的成分 及作用 l溶液 50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl ，pH=8.0 葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速 沉积到管子的底部；EDTA 抑制DNase的活性。这一步 溶液中还可以加入RNase，不受EDTA影响，并且可以 在后续步骤中被除去 l溶液 0.2M NaOH / 1% SDS 破细胞的主要是碱，而 不是SDS，所以才叫碱法抽提。 l溶液III 3M 醋酸钾 / 2M 醋酸 l这一步的K置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na，得 到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合 ，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换 所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了， 同时基因组DNA也被PDS共沉淀 质粒质粒DNADNA煮沸法煮沸法 q 煮沸法原理 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。 细胞器细胞器DNADNA差速离心法差速离心法 q 差速离心法原理 是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。 将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进 行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层， 从而得以分离。 线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋 白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度 也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各 种组分分级分离出来。 DNADNA提取的基本步骤提取的基本步骤 I.材料准备 II.破碎细胞或包膜内容物释放 III.核酸分离、纯化 IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 V.核酸溶解在适量缓冲液或水中 材料准备材料准备 最好使用新鲜材料，低温保 存的样品材料不要反复冻融 提取血液基因组DNA时，要 选择有核细胞（白细胞） 组培细胞培养时间不能过长 ，否则会造成DNA降解 含病毒的液体材料DNA含量较 少，提取前先富集 基因组DNA的提取质粒DNA的提取 使用处于对数期的新鲜菌体（ 老化菌体导致开环质粒增加） 培养时应加入筛选压力，否则 菌体易污染，质粒易丢失 尽量选择高拷贝的质粒，如为 低拷贝或大质粒，则应加大菌 体用量 菌株不要频繁转接（质粒丢失 ） 严谨性质粒和松弛性质粒 l按照复制性质，可以把质粒分为两类： l一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时， 质粒也复制一次，每个细胞内只有12个质粒 ； l另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然 能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质 粒。一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较 小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿 主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严 紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。 细胞裂解细胞裂解 材料应适量，过多会影响裂解 ，导致DNA量少，纯度低 针对不同材料，选择适当的裂 解预处理方式： 植物材料液氮研磨 动物组织匀浆或液氮研磨 组培细胞蛋白酶K 细菌溶菌酶破壁 酵母破壁酶或玻璃珠 高温温浴时，定时轻柔振荡 基因组DNA的提取质粒DNA的提取 菌体量适当 培养基去除干净，同时保证菌 体在悬浮液中充分悬浮 变性的时间不要过长（5分钟） ，否则质粒易被打断 复性时间也不宜过长，否则会 有基因组DNA的污染 G菌、酵母质粒的提取，应先 用酶法或机械法处理，以破壁 核酸分离、纯化核酸分离、纯化 采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相 应的缓冲体系 采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作 要轻柔 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间（猕 猴桃大提，10000转20min） 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的 去杂质的方法 基因组DNA的提取 质粒DNA的提取 核酸分离、纯化核酸分离、纯化 q 蛋白质的去除： 酚/氯仿抽提 使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等） 高盐洗涤 蛋白酶处理 q 多糖的去除： 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体 积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。 用多糖水解酶将多糖降解。 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可 以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500L DNA液中加入 200l 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。 核酸分离、纯化核酸分离、纯化 q 多酚的去除： 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、 抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它 们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合 核酸分离、纯化核酸分离、纯化 q 盐离子的去除： 70的乙醇洗涤 核酸沉淀、溶解核酸沉淀、溶解 当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉 淀会更充分 沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于 充分沉淀 沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等 晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥） 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase pH值为8.0，可防止DNA发生酸解 基因组DNA的提取质粒DNA的提取 1.DNA中含有蛋白、多 糖、多酚类杂质 2.DNA在溶解前，有酒 精残留，酒精抑制 后续酶解反应 3.DNA中残留有金属离 子 1.重新纯化DNA，去除蛋 白、多糖、多酚等杂 质（具体方法见前） 2.重新沉淀DNA，让酒精 充分挥发 3.增加70乙醇洗涤的 次数（2-3次） DNADNA提取常见问题提取常见问题 q问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。 原 因 对 策 1.材料不新鲜或反复冻 融 2.未很好抑制内源核酸 酶的活性 3.提取过程操作过于剧 烈，DNA被机械打断 4.外源核酸酶污染 5.反复冻融 1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避 免反复冻融 2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻 前加入裂解缓冲液 3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料 的DNA时，可增加裂解液中螯合剂 的含量 4.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 5.所有试剂用无菌水配制，耗材经高 温灭菌 6.将DNA分装保存于缓冲液中，避免 反复冻融 DNADNA提取常见问题提取常见问题 q问题二：DNA降解。 对 策 原 因 1.实验材料不佳或量少 2.破壁或裂解不充分 3.沉淀不完全 4.洗涤时DNA丢失 1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材 料 2.动植物要匀浆研磨充分；G 菌、酵母裂解前先用生物酶 或机械方式破壁 3.高温裂解时，时间适当延长 （对于动物细胞、细菌可增 加PK的用量） 4.低温沉淀，延长沉淀时间 5.加辅助物，促进沉淀 6.洗涤时，最好用枪头将洗涤 液吸出，勿倾倒 DNADNA提取