色谱联用分析法(第七版.ppt

仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 第二十一章 色谱联用分析法 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 色谱联 用分析法 两种色谱联 用（色谱-色 谱）分析法 色谱与质谱 、波谱联用 的分析方法 提高 分离能力 提高 定性能力 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 色谱-质谱、波谱联用分析法 将分离能力很强的色谱仪与定性、定结构能力 很强的质谱或光谱仪器通过适当的接口 (interface)相结合成完整的分析仪器，借助计算 机技术进行物质分析的方法。 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 第一节 色谱质谱联用分析法 主要包括 气相色谱质谱联用 GC-MS 高效液相色谱质谱联用 HPLC-MS 毛细管电泳质谱联用 CE-MS 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 一、气相色谱质谱联用 （一）原理 由于GC的试样呈气态，流动相也是气体， 与质谱仪的进样要求相匹配，故最容易将这两 种仪器联用。 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 分离试样中各组分，起着样品 制备的作用 气相色谱仪 接口 起着气相色谱和质谱之间适配 器的作用 质谱仪 气相色谱仪的检测器 计算机系统 获得色谱和质谱数据，进行数 据采集和处理 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 （二）气相色谱质谱联用仪器 主要由色谱单元、质谱单元和接口三大部分组成 接口装置的作用 将色谱与质谱联接起来，以除去载气 、 降低气相色谱仪柱后流出物 的气压，同时对试样起富集的作用，并把 组分送到质谱仪的离子源。 1接口(interface) 实现联用的关键 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 GC-MS对接口的一般要求是： 能使色谱分离后的各组分尽可能多地进入 质谱仪，并使载气尽可能少地进入质谱系统 。维持离子源的高真空。 组分在通过接口时应不发生化学变化。 接口对试样的有效传递应具有良好的重现 性。 接口的控制操作应简单、方便、可靠。 接口应尽可能的短,以使试样尽可能快速通 过接口。 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 GC-MS的接口有直接导入型和浓缩型 直接导入型 装置结构简单，容易维护 ，但它无浓缩作用 喷射式浓缩型 接口 具备去除载气、浓缩样 品的功能，即具有分子 分离的能力 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 2质谱单元 GC-MS中的质谱应满足下列要求： u真空系统不受载气流量的影响 u灵敏度和分辨率与色谱系统匹配 u扫描速度与色谱流出速度相适应 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 （1）离子源 电子轰击源（EI）是GC-MS中最常用的离子源 优点： 谱图重现性好 有较多的碎片离子，提供丰富的结构信息 灵敏度高 化学电离源（CI）也是GC-MS配置的离子源之一 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 （2）质量分析器 四极质量分析器 扫描速度快，并可从正离子到负离子检测自 动切换，而且灵巧轻便，价格便宜，是GC-MS 中最流行的质量分析器。 离子阱质量分析器 飞行时间质量分析器 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 3色谱单元 用于GC-MS色谱系统应该符合质谱仪的一些 特殊要求。 主要是： 固定相应选择耐高温，不易流失的固定液 ，最好用键合相。 载气应不干扰质谱检测，一般常用氦气。 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 （三）气相色谱质谱分析的应用 GC-MS联用分析的灵敏度高，适合于低分子化 合物(相对分子质量1000）的分析，尤其适 合于挥发性成分的分析。 在药物的生产、质量控制和研究中 在中药挥发性成分的鉴定 食品和中药中农药残留量的测定 体育竞赛中兴奋剂等违禁药品的检测 环境监测 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 二、高效液相色谱质谱联用 （一）原理 以高效液相色谱为分离手段，以质谱为 鉴定和测定手段，通过适当接口 (interface)将二者联接成完整仪器。 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 （二）高效液相色谱质谱联用仪器 1高效液相色谱质谱接口和离子化 接口装置必须既能满足液、质两谱在线 联用的真空匹配要求，又能实现被分析 组分的离子化。 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 离子化方式有两种： 试样在离子源中以气体形式被离子化 是从固体表面或溶液中溅射出带电离子 大气压离子化-最常用 电喷雾离子化（ESI） 大气压化学离子化 (APCI) 大气压光离子化 (APPI) 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 （1）电喷雾离子化接口 电喷雾离子化是将溶液中试样离子转化为气 态离子的一种接口 带电液滴 的形成 溶剂蒸发和 液滴碎裂 离子蒸发形 成气态离子 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 电喷雾接口示意图 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 电喷雾离子化过程示意图 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 uHPLC-ESI-MS谱图主要给出准分子离子的相 关信息，例如在单电荷情况下的M+H+、 M+Na+、MH等，对于生物大分子如蛋白 质、肽等，还能产生大量的多电荷离子。 uESI常用于强极性、热不稳定化合物及高分 子化合物的测定。 uESI的主要缺点是只能允许非常小的流动相 流量。 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 （2）大气压化学离子化接口 大气压化学离子化接口将溶液中组分的分子 转化为气态离子的一种接口 uAPCI适用分析有一定挥发性的中等极性与弱极 性，相对分子质量在2000以下的小分子化合物 。 u最大优点是使HPLC与MS有很高的匹配度,允许 使用流速高及含水量高的流动相，极易与RP- HPLC条件匹配。 u与ESI相比，APCI对流动相种类、流速及添加 物的依赖性较小。 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 （2）质量分析器 四极质量分析器 离子阱质量分析器 飞行时间质量分析器 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 串联四极质量分析器-使用较广泛 将三个四极质量分析器串联起来使用 u第一个四极质量分析器进行质量分离 u第二个四极质量分析器-碰撞池，产生产物离子 u产物离子由第三个四极质量分析器分离分析 串联四极质量分析器能够进行选择反应监测 ，选择性更高，使用串联四极质量分析器的质谱 称为串联质谱。 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 3色谱单元 uHPLC-MS中的色谱柱一般短柱，以缩短分析 时间，最常用的固定相为ODS。 uHPLC-MS对流动相的基本要求是不含非挥发 性盐类，以防其析出堵塞毛细管等。 u所用溶剂的纯度最好都是色谱纯。 u流动相中挥发性电解质如甲酸、乙酸、氨水 、乙酸铵等的浓度也不能太高。 u流动相的pH、流速均对检测灵敏度有很大影 响。 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 （三）高效液相色谱质谱分析的特点 和应用 1高效液相色谱-质谱联用的特点 适用的范围宽。 提供各种信息。可产生准分子离子和多级 质谱可提供丰富的结构信息。 有很高的灵敏度和样品通量。 可在色谱分离不完全的情况下对复杂基质中 的痕量组分进行快速定性和定量分析。 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 2高效液相色谱-质谱联用的应用和 分析条件 液相色谱质谱联用技术在药学、临床医 学、生物学、食品化工等许多领域的应用越来 越广泛。 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 uHPLC-MS分析实验条件的选择： （1）流动相和流量：常用流动相为水、甲醇、乙腈 及它们的混合物，可用醋酸、甲酸或它们的铵盐溶 液调节pH ，应避免磷酸盐或离子对试剂等。流量对 LC-MS分析有较大影响。 （2）离子检测模式：碱性物质选择正离子检测模式 ，可用醋酸或甲酸使试样酸化至pKa2。酸性物质 及含有较多强电负性基团的物质，选择负离子检测 模式。 （3）温度：接口的干燥气体温度应高于待分析物沸 点20左右，同时要考虑物质的热稳定性和流动相 中有机溶剂的比例。 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 三、毛细管电泳质谱联用 CE的高效分离能力与MS鉴定结构 能力的有机结合 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 若实现毛细管电泳-ESI-质谱联用，须解决的 问题： 电压匹配问题。 CE是依赖电渗作为流体的动力，若与质谱联接时， 质谱的高真空与CE造成的真空差，将会引起CE的电渗 流的扰动，破坏分离。 CE的进样量小，要求MS要有很高的灵敏度。 CE分离工作大都是使用磷酸盐缓冲溶液来完成，与 MS联用时，只能用易挥发盐的缓冲盐溶液。 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 四、色谱质谱的扫描模式及 其提供的信息 色谱-质谱联用分析扫描模式 u全扫描（full scanning） u选择离子监测(SIM) u选择反应监测(SRM) 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 （一）全扫描 全扫描是质量分析器在给定的时间范 围内对给定质荷比范围进行无间断地扫描 ，获得样品中每一个组分（或在某一特定 时刻）的全部质谱。在这种扫描模式下， 可以获得各种定性和定量信息。 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 1色谱质谱三维谱 X坐标表示质荷比m/z，Y坐标表示时间或 连续扫描的次数，Z坐标表示离子流的强 度(离子丰度)。 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 2.质谱质谱 将全扫扫描得到的分子离子 或准分子 离子（M+H+、MH、M+Na+等）及所有碎片 离子的质质荷比与其对应对应 的离子流的相对对强度作图图 给出总离子流色谱图上每一个色谱峰的质谱 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 3.总离子流色谱图（TIC）是总离子流强度 随时间（扫描次数）变化的色谱图 其中对应某一时间点的峰高是该时间点流进 的组分的所有质荷比的离子强度的加和。 给出保留 值、峰高 和峰面积 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 4.质量色谱图 是从计算机存储的总离子流色谱 图的数据中，按质荷比调出的色谱图。 质量色谱可以鉴别某化合物或具有某基团的一 组化合物的存在。 即使没有实现色谱完全分离的峰也可进行定量 。 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 （二）选择离子监测 u选择离子监测是对一个或一组特定离子进行 检测的技术。 u只检测一个质量的离子称为单离子监测(SIM) u检测多离子的称为多离子检测(MID) u选择离子监测可以把全扫描模式所得的复杂 的总离子色谱图变得非常简单，即获得的质 量色谱图。提高了灵敏度，同时有更快的扫 描速度。选择离子监测主要用于定量分析。 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 （三）选择反应监测 选择反应监测是串联质谱的一种检测模式，即 监测一个或几个特定的离子反应，监测几个离 子反应又称为多反应监测(MRM)。 选择反应监测能对复杂混合物中的痕量组分进行 快速鉴别和定量分析，选择性高，灵敏度高。 此外，产物离子扫描、前体离子扫描和中性丢 失扫描三种模式也是串联质谱的检测模式。 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 第二节 其他联用分析法 一、气相色谱傅立叶变换红外光谱联用 （一）气相色谱傅立叶变换红外光 谱联用仪器 由气相色谱仪、接口、傅立叶变换 红外光谱仪及计算机系统四部分组成。 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 在相应软件控制下，仪器进行实时傅立叶变换，在显示 器上实时显示GC馏分的气态IR谱图 其x轴为波数，y轴为吸光度，z轴为时间 （二）气相色谱傅立叶变换红外光 谱联用获得的谱图 1.实时三维谱图 2.重建色谱图 在相应软件控制下，仪器进行实时傅立叶变换，在 显示器上实时显示GC馏分的气态IR谱图，其x轴为波数 ，y轴为吸光度，z轴为时间 由红外检测器记录的干涉图经计算机处理后得 到的色谱图 3红外光谱图 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 （1）化学图 （2）Gram-Schmidt 重建色谱图 （3）红外总吸收 度重建色谱图 重建色谱图包括： 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 二、高效液相色谱核磁共振波谱联用 核磁共振波谱是测定有机化合物结构的最强有力 的技术之一 但是实现这种联用又是最具有挑战性的一门技术 HPLC流动相中的质子严重干扰组分的1H-NMR谱 梯度洗脱时，溶剂的浓度不断变化，值也不 断变化 核磁共振波谱的灵敏度较低 NMR难于与HPLC在线联用 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 HPLC-NMR能够获得复杂试样中微量组 分的定性信息及二级结构信息，能测定这 些组分的氢谱、碳谱及各种相关谱，必将 成为复杂试样如中药的活性成分、生物样 品中的药物及其代谢物等微量组分的定性 分析和结构鉴定的最重要手段，目前已经 出现了LC-NMR-MS联用技术用于代谢组学研 究。 仪器分析仪器分析 第二十一章 色谱联用分析法 u色谱色谱联用是由多种不同类型的色谱组合 而成的联用系统，又称为多维色谱，其主要作用 是提高色谱分辨能力和增加峰容量。 由同类流动相、相同分离机制但不同选择性色谱 柱串联组成，例如GC-GC、HPLC-HPLC及SFC-SFC等 。 由 不同类流动相、不同分离机制及不同选择性色谱 柱组成，例如HPLC-GC、HPLC-SFC、SFC-GC、HPLC -CE及GC-TLC、SFC-