外文翻译---在酪干乳杆菌BL23的LDH基因分析：乳酸生产上的作用.doc

英语外文翻译作业外文资料翻译译文：在酪干乳杆菌BL23的LDH基因分析：乳酸生产上的作用Juan Rico Mara Jess Yebra Gaspar Prez-Martnez Josef Deutscher Vicente Monedero收稿日期：2007年12月21日/接受日期：2008年1月13日/发表时间：2008年1月30日 学会工业微生物2008摘要：干酪乳杆菌是一种通过通过L-乳酸脱氢酶（LDH1）的作用促使糖发酵主要生产L-乳酸的乳酸菌。此外，D-乳酸的异构体的少量产生一个D-hydroxycaproate脱氢酶（HicD）的活动。LDH1是主要的L-乳酸生产酶，但突变它的基因并没有消除L-乳酸的合成。一项称作 “干酪乳杆菌基本法第二十三条草案的基因组序列”的调查揭示了相关的另外三个基因编码乳酸脱氢酶旁系。为了研究这些基因对全球的这种微生物的贡献，个体乳酸以及双突变体（LDH1 LDH2，LDH1 LDH3，LDH1，LDH4和LDH1hicD）的生产，构建了乳酸生产的上清培养评估。 LDH2，LDH3和LDH4基因乳酸生产中发挥的作用不大，因为他们的单一突变或在组合与LDH1缺失突变对L-乳酸合成的影响很小。LDH1突变体显示D-乳酸产量增加，这是可能通过活动HicD合成，因为它是在取消LDH1 hicD的双突变。相反，可能是HicD，在没有LDH1，LDH2，LDH3或LDH4活动的情况下通过酶谱分析检测。此外，这些检测发现存在额外的频段表现出D-/L-lactate脱氢酶活性，这不能归咎于任何所描述的基因。这些结果表明，L-BL23具有一个复杂的酶系统，能够减少乳酸丙酮酸。关键词：干酪乳杆菌、乳酸菌、Hydroxycaproate脱氢酶、乳酸脱氢酶、代谢工程简介：糖代谢乳酸菌（LAB）的特点是通过乳酸脱氢酶的作用主要发酵生产乳酸产品，从而降低丙酮酸，乳酸。从生物技术的观点来看乳酸的生产是非常重要的，因为它可以产生许多自然发酵的实验室资源，它可以用在食品，制药和生物聚合物产业7。在乳酸菌干酪BL23，一些菌株已被广泛用于遗传，生理和生化研究，这两个基因编码的蛋白质乳酸脱氢酶活性已被描述8，12，19。 LDH1基因编码合成的L-LDH，而hicD编码一个D-hydroxyisocaproate提供了D-乳酸脱氢酶。在这种细菌19上与突变株相关的L-乳酸和D-乳酸的形成表明突变株已在这两个基因上建成。然而，干酪乳杆菌BL23显示LDH1突变体仍然产生大量的L-乳酸D-乳酸。一个与其他实验室删除LDH基因相似的行为也有报道。在这个意义上说，基因突变从植物乳杆菌的L型和D型上开始编码，使该生物体产生50的D型跟50L型的混合物，从来没有导致乳酸生产3的完全缺失。 1乳酸乳杆菌sakei的突变，在缺乏D-乳酸脱氢酶活性酸菌的条件下，将导致具有强烈降低L型和D型的乳酸的菌株生产（D异构体在消旋活动的作用下能够转换成L Dlactate）但仍然产生少量的乳酸15。最后乳酸菌的发酵在ldhL 、ldhD双基因剔除的情况下仍然能够合成乳酸1。 EVorts已作出建设在一个aVected或乳酸菌菌株上的几个的identiWed LDH基因，因为它们可以用在通过非消旋，光发酵等途径生产活性乳酸1。此外，代谢工程战略应用于NADH氧化再加上一个替代的丙酮酸的代谢，导致附加代谢产物的产生4，6，13，17。然而，已知的缺失乳酸脱氢酶基因的结合酶活性的表达并不总是能够降低丙酮酸suYcient改道对其他分子比如signiWcant丙酮酸XOW乳酸diVerent的影响。由于这些原因，一个更好的涉及乳酸合成酶的研究将成为必要。在尝试探索的基因负责残留在干酪乳杆菌乳酸生产BL23的LDH1突变体，我们探索其是否存在额外的LDH基因突变以及在eVects乳酸生产上新发现的LDHs的基因组。材料和方法：菌株和生长条件：在这项研究中干酪乳杆菌菌株的使用在表1中列出。他们生长在MRS培养基（Oxoid公司）或MRS基本培养基中，每公升含：蛋白胨10克，肉类提取物8克，酵母提取物4克，吐温80，1毫升，K2HPO42克;柠檬酸铵2克; MgSO4.7H2O，0.2克;MnSO4.4H2O，0.05克，并辅以0.2（W / V）葡萄糖，在37下静置。大肠杆菌DH5是作为一个克隆宿主，在LB培养基中37条件下搅拌生长，对于选择干酪乳杆菌的转化体，将5克/毫升的红霉素加入培养基中。氨苄青霉素则用在100克/毫升大肠杆菌中。质粒和突变株的构建：pRV300质粒11用于兴建综合载体内部碎片的L.casei，LDH2，LDH3，LDH4。一个519 bp的片段从LDH2 ampliWed PCR结合寡核苷酸5-GATTCCCTACCTTACACG和5-TCTCAATGATGCCATAAGC与EcoRV分为pRV300消化的克隆，给予pRVldh2。一505 bp的LDH3内部片段是与5-GTG ampliWed TTATTTCCGCGGTC和5-GCTTAGCCTGATAAA与SMAI消化TCTTC和克隆到pRV300给pRVldh3。 LDH4的437 bp的片段，ampliWed 5-TCTCAATTCAGCGATGGC和5-CTACATCATCAGATGCG和克隆到EcoRV消化pRV300来给pRVldh4。要构建的PRV LDH1质粒携带融合5和 3的LDH1区域，500 bp的片段相应LDH13下游地区与寡核苷酸5-CGACACCGAGA ampliWed ATTTCTGTG和5-ACATGGATGGTCAATATGGC并克隆到pRV300用EcoRI消化（作出钝的Klenow DNApolI的片段）。另外有500 bp的5LDH1在上游区域与寡核苷酸 ampliWed 5-CGGGGTACCGTCGTTTGGCCAAGCCATC和 5-TTCAAGCAAGCTTCCAATAAC并克隆到上述质粒PSTI（消化钝与Klenow酶）。克隆含有质粒与导致在正确的方向碎片被identiWed限制分析，并命名为PRVLDH1。 PCR的进行与展开高精度聚合酶（Roche）从杆菌属BL23染色体DNA。 PCR产物凝胶puriWed的gfx-PCR puriWcation试剂盒（GE医疗机构）。限制性内切酶，DNA的modiWcation酶和T4连接酶为New England Biolabs公司和Roche公司生产。干酪乳杆菌菌株的转化pRVldh2，pRVldh3，pRVldh4和pVBhic19通过GenePulser仪（BioRad公司）和MRS平板转化红霉素。通过与相应的寡核苷酸和DNA聚合酶链反应转化在正确的位点整合测试。构建LDH1缺陷菌株，干酪乳杆菌BL23通过克隆选择转化为PRVLDH1和耐红霉素。一些克隆体在含有红霉素的MRS培养基上生长约200代没有产生抗生素，稀释过后培养的菌种亦是如此。 BL249（LDH1）被选定为第二应变基因重组导致质粒切除留下缺失性的LDH1，经PCR conWrmed执行从敏感红霉素克隆的DNA的分离。有机酸和葡萄糖的测定干酪乳杆菌细胞培养初期在辅以0.2葡萄糖的MRS培养基上培养。有机酸上清液用JASCO PU-2080Plus HPLC系统，耦合紫外检测器（210 nm），以及使用Rezex ROAOrganic色谱柱进行测定。色谱法在50C与5 mM的硫酸作为溶剂，XOW速率 0.6毫升/分钟的条件下进行。 D-乳酸和L-乳酸的同分异构体的比例来自R-Biopharm公司的D-/L-lactic酸性试剂盒上（德国达姆施塔特公司）。目前在生长培养基中的糖的测定方法来自R-Biopharm公司的D-葡萄糖试剂盒。表1菌株和质粒乳酸脱氢酶酶谱分析细胞成倍生长在10毫升的MRS培养基中的干酪乳杆菌野生型和突变株通过离心回收，用100毫摩尔的Tris-HCl 在pH值7.4条件下在同一buVer中加入 1毫摩尔 硫代-1 ,4-threitol 0.5毫摩尔phenylmethylsulphonyl的xuoride洗涤。晃动玻璃珠使细胞被打破：用迷你Beadbeater（直径0.1毫米）（Biospec）在12000转4C条件下离心10分钟去除细胞碎片。细胞的提取物被加到了6的非变性PAG和稀释的90V中，在加入100mM pH值6.8的三乙醇胺buVer，0.75 mM的NAD+，0.1毫克/毫升硝基四氮唑，0.02毫克/毫升的phenazyne methosulfate，或者200mM的L-乳酸或200mM的有50的D-乳酸50的L-乳酸的混合物的凝胶电泳培养后检测乳酸脱氢酶活性。在第二个用含有10的PAG电泳进行检测0.05SDS。凝胶浸泡60分钟，在2的Triton X-100中消除SDS并转移到一个含有100mM三乙醇胺buVer pH值6.8，10mM果糖-4,6 - 二磷酸，1mMNADH和25mM丙酮酸钠的途径，培养60分钟后，凝胶用清水冲洗30分钟置于含有0.25毫克/毫升硝基四唑和0.02毫克/毫升phenazyne methosulfate中培养。蛋白质的频段为在一个黑暗背景下的清晰条带证明了NADH的氧化酶活性。核苷酸加入编号本文报道的核苷酸序列已在EMBL数据库存依次加入数字序号AM886174，AM886175，AM886176和AM886177。结论LDH的同源基因存在于干酪乳杆菌BL23的基因组干酪乳杆菌，除了先前描述的乳酸脱氢酶BL23 8，19，在研究LDH同源性BLAST搜索干酪BL23基因组草图（96的序列覆盖率）呈现三个额外的推测LDHs的基因编码。 “三个额外的LDHs（LDH2，LDH3和LDH4）百分比49%，31%和24，当与干酪乳杆菌BL23LDH1酶相比。 LDH2具有乳酸/苹果酸脱氢酶的同源性，而LDH3是相似的L-hydroxyisocaproate细菌脱氢酶。在LDH4中，序列在80左右开始的氨基酸的同源性为L型LDHs，而WRST N-末端氨基酸只共享1 signiWcant，N-末端的二级乳酸脱氢酶的同源性从乳酸乳球菌（LDH-2）。对LDHs序列的推断发现，类似于LDH1，LDH2和LDH3蛋白质进行守恒的NADH结合域中含有典型的G-X - G - X - X G纹路（X为任意氨基酸图1示意图4-diVerent LDH基因检测干酪乳杆菌基本法第二十三条连同他们的基因组范围内。灰盒对应序列潜水员从L-干酪ATCC334。茎环代表假定的转录终结酸）。此外，催化的M-G-E-H型的G- D/E - S/T位点的研究，其中H是催化组氨酸，同时也表现在LDH2和LDH3中，从而支持了潜在的乳酸脱氢酶的假设编码。 LDH4的酶是展示以LDH1的最低相似性和保持上述最差的序列。为了分配假定的设想，对新的蛋白质的遗传背景其相应的基因进行了研究（图1）。正如前面描述，LDH1是monocistronic基因并没有位于它旁边的基因碳代谢。 LDH2是通过divergently转录GDH基因编码在Xanked五肽尾的NADP依赖谷氨酸脱氢酶在三肽尾由基因编码假定的氨基酸酸和羧酸转运。虽然LDH2似乎也是monocistronic的基因，但LDH2拥有在一些二元酸反应步骤的脱氢作用证明它是合理的。 LDH3是Xanked编码基因假定的脱乙酰基酶，膜蛋白和ADPribose焦。 LDH4是位于在3肽尾一个丙酮酸diVerent亚基编码基因簇脱氢酶复合体，似乎形成一个操纵子一个保护假设蛋白和编码假定基因古型果糖-1，6-二磷酸酶的inositolmonophosphatase种群。虽然丙酮酸脱氢酶是复杂的，因为它涉及在好氧条件下将丙酮酸的代谢产物转换成乙酰辅酶A的化合物，果糖-1,6-二磷酸酶在糖质新生途径，因此没有与LDH有明确的联系。总之，基因组内新的LDH基因没有允许建立可能的假设细胞的作用。进行了类似的搜索使用研究干酪ATCC334的完整的基因组序列14，新提出的干酪乳杆菌型应变，揭示了相同的额外LDH基因的发生。遗传结构是相同的DNA携带的LDHs菌株除外：（1）在ATCC334中，GDH基因（LSEI_0635）相邻LDH2和公认的脯氨酸iminopeptidase基因（LSEI_2604）接近LDH3的是假；（2）IS3相关插入元素，是目前在ATCC与334， LPDA与LDH4之间;（3）基因编码推测PADR在BL23的缺失似乎是从ATCC 334开始;（4）基因编码的一种应激反应膜在ATCC334（LSEI_1313）GTP酶是一个BL23的假基因（图1）。构建不同LDH突变及其乳酸生产效果在以前的工作，LDH1构建插入突变一个非复制的质粒携带一个内部片段基因19。为了产生一个稳定的突变并避免抗生素抗性标记的存在，L.干酪基本法第二十三条转化质粒PRV LDH1，其中进行的5和3 LDH1 Xanking地区。后WRST单交叉融合，是一个稳定的突变选择进行了第二次重组事件，从而导致了LDH1完整的染色体缺失。时相比，野生型，新的删除突变（株BL249）表现出类似的行为以前插入突变BL176：培养上清总是达到了较高的Wnal pH值，它产生的CO2粗提取物中葡萄糖和L-LDH活性降低95（数据未显示）。随后，LDH2，LDH3，LDH4和hicD基因灭活LDH1背景提供四个双突变（表1）。在以类似的方式，在LDH2，LDH3和LDH4在干酪乳杆菌的野生型基因被灭活，发出三个diVerent单突变体（表1）。为了研究上eVect的diVerent突变乳酸生产，所有菌株生长在含0.2葡萄糖和乳酸的MRS培养基上测得完成后对葡萄糖的利用。表2中可以看到，LDH1突变对主要乳酸生产的影响，以减少乳酸总额的37的增幅，对D-乳酸进行了观察。 LDH2，LDH3和LDH4单突变体的表现像野生型（数据未显示）。此外，结合LDH2，LDH3或LDH4突变及LDH1缺失没有产生明确一个总的eVect乳酸生产，虽然，D-/L-lactate比例上升超过双重LDH1 LDH2和LDH1 LDH4相比单LDH1的突变。这些结果表明，在没有LDH1的条件下，要么LDH2或LDH4，HicD或其它的D-乳酸产酶可能减少丙酮酸率较高（见表2）。有趣的是，增加的D-乳酸生产LDH1应变在LDH1 hicD双突变中完全消失。这种conWrmed，在LDH1缺失的条件下，HicD酶是负责输送丙酮酸以实现D-乳酸的生产。正如前面观察，LDH1突变导致增加生产丙酮酸和葡萄糖发酵过程中的醋酸19。然而，在hicD突变过程中，小野生型的D-乳酸的生产仍在观察。乳酸脱氢酶的酶谱检测活动的乳酸LDH2，LDH3和LDH4突变的低eVect，合成促使我们寻找额外的存在LDH活性存在于干酪乳杆菌BL23，我们试图将粗提取物进行酶谱分析检测。在1 WRST一系列的实验，细胞提取物的几株被装上非变性凝胶和氧化的能力乳酸，加上减少的色基板四氮唑蓝（图2）。 A频段展现出D-乳酸脱氢酶活性，并为缺失在hicD突变体被明确检测（图2a），这表明它是产物的hicD基因。相反，其余的突变并没有产生1 diVerent的则带proWle，因此，没有蛋白带可以分配到产物或LDH1，LDH2，LDH3或LDH4。单体LDH2，LDH3或LDH4突变株携带像野生型（数据未显示）的表现。允许使用1 D-/L-lactate混合物简单检测图2 diVerent干酪乳杆菌株对本地凝胶LDH酶谱分析。50:50混合的D-和L-乳酸开发出一种凝胶，B胶开发L-乳酸。箭头指向参展乳酸脱氢酶的蛋白条带活动。乐队相应的HicD酶被标记面板A.菌株是“基本法”第二十三条（野生型）; BL249（LDH1）; BL274（LDH1hicD）; BL189（hicD）; BL252（LDH1 LDH2）; BL271（LDH1 LDH3）BL273（LDH1 LDH4）带凝胶与Llactate培养时缺失而且被分配到一个额外的酶展现的D-乳酸脱氢酶（箭头1图2A）。此外，带L-乳酸脱氢酶活动检测所有凝胶轨道。这个在任何的LDH突变过程中没有消失的频段是增加携带LDH1缺失株的信号，提示它对应酶的活性，这是诱导后LDH1突变（箭头2图2a，b）的。类似结果也存在于含有或缺乏果糖1,6-二磷酸的过程中，这是LDH1激活（数据未显示）。在第二组实验中，细胞提取物在SDS-PAGE和SDS被去除之后被解析出来，由于NADH的氧化能力蛋白质在凝胶中是可见的。图3显示，再次表现出NADH的蛋白条带只能是存在的具有氧化酶的活性的丙酮酸分派给产物hicD所致。一个没有丙酮酸控制凝胶除外，HicD带了相同的结果缺失（数据未显示）。此外，两个频段在丙酮酸缺失的情况下展现出NADH氧化酶的活性表2从葡萄糖生产几种干酪乳杆菌菌株的有机酸图3 NADH的氧化酶中存在丙酮酸酶谱分析的diVerent干酪乳杆菌菌株的无细胞提取物上SDSPAG解决处理鈥淢动脉插管和方法鈥箭头参展的NADH氧化活性增加蛋白质点中LDH1背景。的HicD酶的立场是标有一个箭头。株是“基本法”第二十三条（野生型）; BL249（LDH1）; BL274（LDH1 hicD）; BL189（hicD）; BL252（LDH1 LDH2）;BL271（LDH1 LDH3）和BL273（LDH1 LDH4）检测和强度增加了LDH1背景（图3）。讨论：LAB的遗传菌株modiWcation已被用于对工业生产或食品相关的分子代谢的途径的改变。LDH-编码基因的突变是实现这一目标的一个重要工具，因为它会产生氧化还原失衡，这可以弥补同源NADH氧化的新化合物的合成外源酶的表达4，9，17，20它提供了丙酮酸代谢替代途径6，13，18。然而，这些方法有时导致所需产物的产量降低。在其他因素方面，这可能会产生氧化增加NADH的其他途径（即乙醇生产）和替代LDH基因13的表达。在这种情况下，基因组重要的工业可用性微生物是在发展至关重要新战略旨在改善应变。在这工作中，我们试图确定是否四个基因的研究BL23基因组假设干酪乳酸脱氢酶编码将有助于乳酸合成。LDH1突变有一个显著的来自干酪乳杆菌的eVect代谢反应，尽管在突变株测得LDH的活性偏低，但它仍然产生了相当大数量的L-乳酸。两种可能性可以解释：（1）检测乳酸最佳实验条件额外的LDH酶（S）或脱氢酶的活性在起作用（2）一个非常低的LDH活性，就足以让乳酸在低浓度下大幅度堆积增长。在的johnsonii乳酸菌中，基因编码的D-乳酸脱氢酶的失活，导致LDH活性10降低超过85，而总乳酸产量只有降低了16，表明乳酸脱氢酶的酶是目前过剩丙酮酸转化的原因。不管怎样，负责在L型干酪L乳酸的生产酶是未知的。新的identiWed的贡献是证明了LDH2，LDH3和LDH4的乳酸产量低，而且只有reXected小在D-/L-lactate比例变化双突变体。存在这样的可能性，它们在一个基因deWciency上的编码可以弥补另外两个基因多余的LDH。这一假说可以证明，如果三联或四联的突变体在LDH将产生新的基因。此外，存在表现出LDH活性酶谱分析的额外波段指向存在其他unidentiWed酶能降低丙酮酸，乳酸。我们的研究结果conWrm证明了先前的假设，HicD负责在D-乳酸水平LDH1的情况下19增加。这种eVect菌在LDH1 hicD双突变的情况下完全恢复。因此，它的出现，说明HicD酶只有在对乳酸丙酮酸Xux对主要的乳酸脱氢酶活动的终止作用可能占了相当大的一部分。这可能是reXects较低的aYnity与HicD丙酮酸相比，得到LDH1。相反，aYnities为丙酮酸HicD和额外的L型LDH酶可能是类似的。一个附加的HicD探索在BL23基因编码的酶的基因编码为33HicD的蛋白，这是100的同源性到LSEI_2156，存在的ATCC334基因组14。此外，酶谱分析表明，微弱的波段与HicD活动相关。尽管这种推测HicD酶发挥了D-乳酸合成的作用仍有待证明。但在先前的一份报告中，hicD的突变导致几乎测不到D-乳酸水平19。然而，目前的实验结果表明，少量生产的Dlactate在hicD株野生型中更加持久。这些diVerences可能是的diVerent培养的因果条件。相似的，一些学者报道，一个研究杆菌ldhL ldhD双基因剔除的条件下产生12-14mM乳酸3，而其他作者的报道60mM乳酸可产生类似的葡萄糖量13。虽然LDH1在BL23的干酪乳杆菌负责主要的LDH活性，但这种蛋白质不能被检测酶谱分析。因此，这种酶不迁移，在非变性凝胶是不可逆转的，经SDS或灭活其活性丢失后凝胶电泳是可能的。然而，酶谱分析conWrmed在干酪乳杆菌BL23两个NADH的氧化酶诱导LDH1突变，这说明了细胞如何响应试图以弥补缺乏通过乳酸脱氢酶NADH再生。NADH / NAD LDH1缺失造成的不平衡可部分弥补NADH的表达，这可能是对O2的依赖，并在一些实验室的氧化酶占相当比例的NADH的循环利用5。事实上，干酪乳杆菌LDH1突变株在通气条件下增长较快19，BL23的基因组检测表明，至少有三个公认的NADH的氧化酶（数据编码未显示）。存在一个额外的频段表现出L型LDH在酶谱的活动表明，酶法机械干酪乳杆菌BL23的丙酮酸减少是比预期更复杂的。有趣的是，作为显示引起NADH的氧化酶，这种活动较高时LDH1缺失。在一些实验室，在好氧生长诱导氧依赖于NADH的氧化酶5和研究上的变化在LDH糖代谢的基因剔除株3，16，19揭示了一个深刻的代谢调整对NAD+再生替代途径。LDH干酪乳杆菌BL23 deWciency是复杂的，它涉及丙酮酸Xux不仅变化，但也丙酮酸和NADH代谢相关蛋白的诱导。这强调需要一个更深层次干酪乳杆菌代谢的知识为基础，这些化合物进一步的代谢工程的方法。致谢J. Rico的是关于Corporacion AlimentariaPeasanta部分资金中船重工研究生奖学金获得者，在大学的L. casei BL23的基因组进行测序，卡昂，Laboratoire德Microbiologie DE LENVIRONNEMENT，在非洲自然资源Thiverval-Grignon，Microbiologie等GntiqueMolculaire研究所AgroqumicaTECNOLOGIA的Alimentos，中船重工，从事诺曼底地区和非洲自然资源组织成员Wnancial的助手。参考文献：1.Aarnikunnas J, von Weymarn N, Ronnholm K, Leisola M, Palva A乳酸菌发酵的代谢工程（2003）甘露醇和纯L-乳酸或丙酮酸生产.生物工程Bioeng82:653-6632. Bongers RS, Hoefnagel MH, Starrenburg MJ, Siemerink MA, ArendsJG, Hugenholtz J, Kleerebezem M（2003）J,IS981-介导的建国，适应性进化ldhB转录恢复生产乳酸激活中的乳酸乳酸脱氢酶deWcient的应变乳. J Bacteriol185:4499-45073. Ferain T, Schanck AN, Delcour J（1996）C-13核磁共振葡萄糖和柠檬酸的终端产品在ldhLldhD共振分析双淘汰赛株植物乳杆菌.J Bacteriol 178:7311-73154. 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Society for Industrial Microbiology 2008Abstract Lactobacillus casei is a lactic acid bacterium that produces L-lactate as the main product of sugar fermentation via L-lactate dehydrogenase (Ldh1) activity. In addition,small amounts of the D-lactate isomer are produced by the activity of a D-hydroxycaproate dehydrogenase (HicD).Ldh1 is the main L-lactate producing enzyme, but mutation of its gene does not eliminate L-lactate synthesis. A survey of the L. casei BL23 draft genome sequence revealed the presence of three additional genes encoding Ldh paralogs. In order to study the contribution of these genes to the global lactate production in this organism, individual, as well as double mutants (ldh1 ldh2, ldh1 ldh3, ldh1 ldh4 and ldh1 hicD) were constructed and lactic acid production was assessed in culture supernatants. ldh2, ldh3 and ldh4 genes play a minor role in lactate production, as their single mutation or a mutation in combination with an ldh1 deletion had a low impact on L-lactate synthesis. A _ldh1 mutant displayed an increased production of D-lactate, which was probably synthesized via the activity of HicD, as it was abolished in a _ldh1 hicD double mutant. Contrarily to HicD, no Ldh1, Ldh2, Ldh3 or Ldh4 activities could be detected by zymogram assays. In addition, these assays revealed the presence of extra bands exhibiting D-/L-lactate dehydrogenase activity, which could not be attributed to any of the described genes. These results suggest that L.casei BL23 possesses a complex enzymatic system able to reduce pyruvic to lactic acid.Keywords Lactobacillus casei Lactic acid Lactate dehydrogenase Hydroxycaproate dehydrogenase Metabolic engineeringIntroductionThe metabolism of sugars by lactic acid bacteria (LAB) is characterized by the production of lactate as the main fermentation product via the action of lactate dehydrogenase,which reduces pyruvic acid to lactic acid. Lactic acid production is important from a biotechnological point of view,as it can be produced by LAB fermentation of many natural sources and it can be used in the food, pharmaceutical and biopolymers industries 7. In Lactobacillus casei BL23, a strain that has been widely used for genetic, physiological and biochemical studies, two genes encoding proteins with lactate dehydrogenase activity have been described 8, 12,19. Gene ldh1 codes for an L-Ldh responsible for the synthesis of L-lactate, whilst hicD encodes a D-hydroxyisocaproate dehydrogenase that provides D-lactate. Mutant strains have been constructed in both genes demonstrating that they were responsible for the main L- and D-lactate formation in this bacterium 19. However, an L. casei BL23 ldh1 mutant still produced substantial amounts of L-lactate and the production of D-lactate was increased. A comparable behaviour has also been reported for other LAB with deleted ldh genes. In this sense, mutation of the genes encoding L- and D-Ldhs from Lactobacillus plantarum, an organism which produces a mixture of 50% D- and 50% Llactate, never resulted in a complete lack of lactate production3. An ldhL mutation in Lactobacillus sakei, a lactic acid bacterium which lacks D-lactate dehydrogenase activity,resulted in a strain with strongly reduced L- and D- lactate production (the D isomer was a consequence of the presence of a racemase activity able to transform L- into Dlactate)but small amounts of lactate were still produced15. Finally, a Lactobacillus fermentum ldhL-ldhD double knockout was still able to synthesize lactate 1. EVorts have been made to construct LAB strains aVected in one or several of the identiWed ldh genes, as they can be used in the production through fermentation of non-racemic, optically active lactic acid 1. In addition, metabolic engineering strategies were applied where oxidation of NADH was coupled to an alternative metabolism of pyruvate, leading to the production of value-added metabolites 4, 6, 13, 17.However, deletion of known lactate dehydrogenase genes in combination with the expression of enzymatic activities able to reduce pyruvate is not always suYcient to divert a signiWcant pyruvate Xow towards other molecules of interest diVerent from lactic acid. For those reasons, a better study of the enzymes implicated in lactate synthesis becomes necessary. In an attempt to discover the genes responsible for residual lactic acid production in an L. casei BL23 ldh1 mutant, we searched its genome for the presence of additional ldh genes and studied the eVects of mutations in the newly found ldhs on lactate production.Material and methodsStrains and growth conditionsThe L. casei strains used in this study are listed in Table 1.They were grown in MRS medium (Oxoid) or MRS basal medium, containing per litre: peptone, 10 g; meat extract,8 g; yeast extract, 4 g; Tween 80, 1 mL; K2HPO4, 2 g;ammonium citrate, 2 g; MgSO4.7H2O, 0.2 g;MnSO4.4H2O, 0.05 g and supplemented with 0.2% (w/v)glucose, at 37 C under static conditions. E. coli DH5_ was used as a cloning host and it was grown in LB medium at 37 C under agitation. For selecting L. casei transformants,erythromycin was added to the growth medium at 5 _g/mL.Ampicil