高效液相色谱仪的应用.ppt

现代分析仪器应用技术现代分析仪器应用技术 l l 高效液相色谱仪高效液相色谱仪 l主讲：李春萍李春萍 西北农林科技大学生命科学学院西北农林科技大学生命科学学院 1599138604515991386045 029-87092379029-87092379 内容 l色谱法基本知识 l高效液相色谱相关内容 l影响分离的因素 l实验前准备工作 l主要分析步骤 一、色谱分析法 起源 基本概念 分类 起源:1906年俄国植物学家米哈伊尔茨维特 色谱分离法 又称层析法，层 离法等，是一种现代的物理化 学分离、分析方法，广泛应用 于化学、医药、生化、环保等 领域，它既可用于混合物的分 离和样品纯度的检查，又可用 于对化合物的定性和定量分析 。 分离 植物 色素 基本概念 l基线：色谱柱中只有流动相通过时，检测器响应信号的记录值。它反映 检测器本底的高低。 l噪声：由未知的偶然因素引起的基线起伏现象。 l峰宽：通过色谱峰两侧的拐点切线，在基线上所截的距离。 l保留时间：从进样点到色谱峰的顶峰的时间。 l死时间：流动相通过色谱系统的时间。在HPLC中为溶剂峰前沿出现的时 间。 l死体积：进样器到检测器出口未被固定相所占有的空间。 l色谱峰：流出曲线上的突起部分。 l分配系数（K）：分配平衡后，组分在固定相与流动相中的浓度之比。K 与组分、固定相、流动相及温度有关。 l容量因子（k）：也叫分配容量、容量比及质量分配系数等，是达到分 配平衡后，组分在固定相的量与流动相中的量之比。 基本概念 l基线漂移： 是基线的一种向上或向下的缓慢移动，可在较长时间 （0.5-1.0h）内观测到。可掩蔽噪声和小峰，它与整个液相色谱系 统有关。 l线性范围：当注入最小至最大进样量时，检测器响应处于与进样量 成正比的范围。 l检测器的池体积：它应小于最早流出的死时间色谱峰的洗脱体积的 1/10，否则会产生严重的柱外谱带扩展。 l灵敏度：也叫响应值，指一定量的物质通过检测器时所给出的信号 大小。灵敏度越高，检测限越小。它是没有考虑噪声，其高低变化 并不能严格表示检测器的检测能力。 l检测限：又称为敏感度，指在噪声背景上恰能产生可辨别的信号时 （一般信噪比2）， 在单位体积或单位时间内需向检测器送入的样 品量。它考虑了噪声，是全面衡量检测器性能的重要指标。检测限 越小，仪器性能越好。 色谱法分类 按分离的机理可分为： l吸附色谱：是利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的 差别而使混合物得以分离。 l分配色谱：是利用不同组分在固定相与流动相间的分 配系数（或溶解度）不同而使混合物得以分离。 l离子交换色谱：是利用不同组分对离子交换剂亲和力 不同而使混合物得以分离。 l凝胶色谱(排阻色谱)：是利用凝胶对不同组分因分子 大小不同而阻滞作用不同使混合物得以分离。 l亲和色谱、毛细管电泳和毛细管电色谱。 色谱法分类 按操作形式可分为： l薄层色谱：吸附、分配、离子交换、凝胶薄层。 l纸色谱：分配色谱。 l柱色谱：吸附、分配、离子交换、凝胶柱色谱。 按流动相状态的不同，可分为： l气相色谱法 (GC) l液相色谱法 (LC) l超临界流体色谱 (SFC) 二、高效液相色谱相关内容 l特点 l研究对象 l高效液相色谱仪展示 l高效液相色谱仪工作流程 l高效液相色谱仪结构 l高效液相色谱法分类 1 HPLC特点 高效液相色谱法是20世纪60年代后期发展起来的一种 新颖、快速的分离分析技术。 l高 压：压力可达（1.52-3.04) 104 kPa。 l高 速：所需的分析时间一般少于1h。 l高 效：一根柱子可以分离100 种以上的组分。 l高灵敏度：用微升数量级的试样可进行分析。 l流动相选择范围广：大部分的有机溶剂以及水 和有机溶剂的混合物均可用。 经典色谱法 2 研究对象 l高沸点化合物； l难挥发及热不稳定的化合物； l离子型化合物及高聚物等。 色谱仪分类 液相色谱仪 气相色谱仪 分析用色谱仪 制备用色谱仪 流程色谱仪 液液色谱仪 液固色谱仪 气液色谱仪 气固色谱仪 排阻色谱 吸附色谱 离子色谱 超临界液体色谱 分配色谱 3 高效液相色谱仪展示 Waters LC-600Waters LC-600 3 高效液相色谱仪展示 3 高效液相色谱仪展示 3 高效液相色谱仪展示 3 高效液相色谱仪展示 l贮液器中的流动相被高压泵打入 系统，样品溶液经进样器进入流 动相，被流动相载入色谱柱（固 定相）内，由于样品溶液中的各 组分在两相中具有不同的分配系 数。在两相中作相对运动时，经 过反复多次的吸附-解吸的分配 过程，各组分在移动速度上产生 较大的差别，被分离成单个组分 依次从柱内流出。通过检测器时 ，样品浓度被转换成电信号传送 到记录仪，数据以图谱形式打印 出来。 4 高效液相色谱仪工作流程 5 高效液相色谱仪的结构 l高压输液系统 l进样系统 l分离系统 l检测系统 l色谱数据处理系统 高压输液系统 包括： l流动相贮存器 l高压输液泵（核心部件）: 能提供150-450kg/cm2的压强；流速 稳定，流量可以调节；应符合：密封性好、输出流量恒定、压力 平稳、可调范围宽、便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。 l过滤器 l梯度洗脱装置 : 可将两种或两种以上的不同极性溶剂，按一定 程序连续改变组成，以提高分离效果，缩短分离时间。 高压输液系统 泵的保养 l 使用流动相尽量要清洁； l 进液处的砂芯过滤头要经常清洗； l 流动相交换时要防止沉淀； l 避免泵内堵塞或有气泡。 进样系统 l注射器进样 l高压定量进样阀 泵 排放 进样 柱 泵 柱 进样 排放 5 高效液相色谱仪部件 进样方式与用量 l六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两种 。使用部分装液法进样时，进样量最多为定量环体积的75 ，并且要求每次进样体积准确、相同； l使用完全装液法进样时，进样量最少为定量环体积的3至5 倍，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所 要求的精密度及重现性。 六通阀使用和维护注意事项： l样品溶液进样前必须用0.45m滤膜过滤，以 减少微粒对进样阀的磨损。 l转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位 置，否则流动相受阻，使泵内压力剧增，甚 至超过泵的最大压力；再转到进样位时，过 高的压力将使柱头损坏。 l为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次 分析结束后应冲洗进样阀。 分离系统 l色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分 。 l柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的 其他金属。金属管用得较多。 l一般备有一个前置柱（预柱）。 l柱子装填得好坏对柱效影响很大。 l发展趋势是: 减小填料粒度和柱径以提高柱效。 柱子形状 l色谱柱一般长530cm，内径45mm，凝胶色谱柱内径 312mm，制备柱内径较大，可达25mm以上。 5cm 10cm 15cm 40cm 色谱柱的保养 对硅胶基键合相填料，水溶液流动相的pH值不得超出2-8.5范围 (eg：C18柱pH范围是2-8)，温度不宜过高。 不能强烈震动，否则柱内填料床层产生裂缝和空隙。 阀件或管路一定要清洗干净；流动相要脱气；防止逆向流动，使 固定相层位移，柱效下降。 进样样品要提纯并严格控制进样量； 在酸或碱性条件下使用后，应依次用水和甲醇清洗。 每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品和适当的 溶剂来清洗色谱柱； 若长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭。 检测系统 l l 紫外检测器紫外检测器 l l 光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器 l l 示差折光检测器示差折光检测器 l l 荧光检测器荧光检测器 l l 蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器 紫外检测器（紫外检测器（UVDUVD） 特点：应用最广，对大部分的有机化合物 有响应；灵敏度高；线性范围广；波长可 选；对流动相的流速和温度变化不敏感， 可用于梯度洗脱。 分析前，色谱柱平衡差 不多时，打开检测器； 分析完成后，马上关闭 检测器。 光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器(PDA)(PDA) l l 由由10241024个二极管阵列组成，可检测特定波长，计算个二极管阵列组成，可检测特定波长，计算 机快速处理，三维立体谱图。机快速处理，三维立体谱图。 时间时间 波长波长 吸光度 示差折光检测器示差折光检测器（RIDRID） l是通用型检测器（因为每种物质具有不同的折光指数 ）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱。 类型 ： 偏转式 反射式 干涉型 荧光检测器荧光检测器（FDFD） l高灵敏度、高选择性：对多环芳烃，维生素B、 黄曲 霉素、卟啉类、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等 有响应。 蒸发光散射检测器（蒸发光散射检测器（ELSDELSD） l又称蒸发型质量检测器，属于通用 型质量检测器。其工作原理：样品 组分从色谱柱后流出，进入检测器 后，经历雾化、流动相蒸发和（光 源光路）检测三个步骤。 流动相 雾化气体 雾化 蒸发 检测 蒸发器 雾化器 光源光路 Step 1: Nebulization Column effluent passes through nebulizer needle Mixes with nitrogen gas Forms dispersion of droplets Step 2: Mobile Phase Evaporation Droplets pass through a heated zone Mobile phase evaporates from the sample particle Dried sample particles remain Step 3: Detection Sample particles pass through an optical cell Sample particles interrupt laser beam and scatter light Photodiode detects the scattered light ELSD优缺点 l与示差折光检测器相比： l 灵敏度高； l 对流动相系统温度变化不敏感； l 可进行梯度洗脱。 l与紫外-可见光检测器相比： l 能解决最困难的HPLC检测问题。可对磷脂、皂苷 、糖类、聚合物、树脂等无紫外吸收或紫外吸收系 数很小的化合物进行检测； l 无需测定定量校正因子。 蒸发光散射检测器（蒸发光散射检测器（ELSDELSD） 优 点：可以梯度洗脱；流动池死体积不影响 检测灵敏度、喷雾气体消耗量少；雾化器和漂 移管易于清洗。 缺 点：受样品组分和流动相挥发性的影响。 用 途：监测碳水化合物、脂肪酸、油脂、聚 合物、药物等多种样品。 6 HPLC分类及分离原理 l吸附色谱 l分配色谱 l离子交换色谱 l凝胶色谱 l亲和色谱 吸附色谱 l固 定 相：固体吸附剂，如 硅胶、氧化铝等，较常使用的 是5-10m的硅胶吸附剂。 l流 动 相：不同极性的一元 或多元溶剂。 l原 理：根据填充剂吸 附活性点对样品的吸收系数 不同而分离。 l适用范围：分离相对分子质 量中等的脂溶性试样，对具 有官能团的化合物和异构体 有较高选择性。 Flow 流动相 活性吸附点 固定相 液固吸附色谱 分配色谱 l固定相与流动相均为液体； l基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； l流 动 相：对于亲水性固定液，采用疏水性流 动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定 液的极性（反相 reverse phase）. 正向色谱法与反相色谱法比较 从下表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色 谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。 正向色谱法反相色谱法 固定相极性高中中低 流动相极性低中中高 组分洗脱顺 序 极性小的先洗 出 极性大的先洗 出 分配色谱 l固 定 相：早期涂渍固定液，固定液流失， 较少采用； l化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反 应键合到硅胶表面的游离羟基上; lC-18柱（反相柱）。 l l 化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相。 l a. 硅氧碳键型： Si O C l b. 硅氧硅碳键型：Si O Si C l （稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广） l c. 硅碳键型： Si C l d. 硅氮键型： Si N 离子交换色谱 l 基本原理：组分在固定相上发生离子交换反应。 阳离子交换：R-SO3H+M+=R-SO3M+H+ 阴离子交换：R-NR4OH+X-=R-NR4X+OH- l 应 用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。 凝胶色谱 固定相： 凝胶(具有一定大小孔隙分 布)； 原 理：按分子大小分离，又称为排 阻色谱（反筛子）。小分子可以扩 散到凝胶空隙，由其中通过，出峰 最慢；中等分子只能通过部分凝胶 空隙，中速通过；而大分子被排斥 在外，出峰最快；溶剂分子小，故 在最后出峰。按试样中分子大小的 不同来进行分离。充填剂多采用： 一定孔径的多孔性聚合物。 亲和色谱 原理： 利用生物大分子和固定相表面 存在的某种特异性亲和力，进行选 择性分离。 先在载体表面键合上一种具有 一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、 联胺等)，再连接上配基(酶、抗原 等)，这种固载化的配基只能和具有 亲和力特性吸附的生物大分子作用 而被保留。 三、影响分离的因素 l流动相黏度：降低传质阻力是提高柱效主要途 径。 l固定相粒度：降低固定相粒度可提高柱效。 l柱温：降低流动相的粘度可在一定程度上提高 分离效果。 l改变洗脱液组成和极性是改善分离的最直接的 因素。 l流速、洗脱方式。 流动相分类 l 按流动相组成分：单组分和多组分； l 按极性分：极性、弱极性、非极性； l 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗； l 常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙 酯、甲醇、乙醇、乙腈、水； l采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活 调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离 或调整出峰时间。 流动相的选择 在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 l采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组 分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。 l也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留 时间缩短。 常用溶剂的极性顺序： l 水(最大) 甲酰胺 甲醇 乙腈 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷 氯仿 溴乙烷 苯 四氯化碳二硫化 碳 环己烷 己烷 煤油(最小) 流动相选择的注意基本要求 l尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长 期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 l避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损 坏柱子。如使固定液溶解流失、酸性溶剂破坏氧 化铝固定相等。 l试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉 淀并在柱中沉积。 l流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外 检测器时，流动相不应有紫外吸收。 四、实验前准备工作 l水 l有机溶剂 l样品预处理 l1 水 l理想的HPLC用水应为18.2M的超纯水，并通 过0.22um的滤膜，除去热源、有机物、无机离 子及空气等。水质越高放置时间越短越好。 l重蒸馏水也可。 2 有机溶剂的提纯 l用蒸馏法可除掉大部分有紫外吸收的杂质。 l氧化铝或硅胶柱可除去溶剂中的极性化合物 。 l氯仿中（少量甲醇）先水洗，再蒸馏。 l四氢呋喃（抗氧剂丁基甲苯酚）强烈吸收紫 外线，可蒸馏。 为了防止爆炸，蒸馏终止时蒸馏瓶中剩余一 定量的液体。 溶剂的过滤和脱气 流动相溶剂在使用前必须先用0.45m孔径的滤膜过滤 ，以除去微小颗粒，防止色谱柱堵塞； 同时要进行脱气处理，因为溶解在溶剂中的气体会 在管道、输液泵或检测池中以气泡形式逸出，影响 正常操作的进行。 3 样品处理技术 l在某些试样中，常含有多量的蛋白质、脂肪及 糖类等物质。它们的存在，将影响组分的分离 测定，同时容易堵塞和污染色谱柱，使柱效降 低，所以常需对试样预处理。 l样品的预处理方法：溶剂萃取、吸附、超速离 心及超过滤等。 3 样品处理技术 l溶剂萃取 溶剂萃取适用于待测组分为非极性物质。在试样中加入缓冲溶液 调节pH，然后用乙醚或氯仿萃取待测组分。但如果待测组分和蛋 白质结合，大多数情况下难以用萃取操作来进行分离。 l吸附 将吸附剂直接加到试样中，或将吸附剂填充于柱内进行吸附。亲 水性物质用硅胶吸附，而疏水性物质可用聚苯乙烯二乙烯基苯 等树脂吸附。 3 样品处理技术 l除蛋白质 向试样中加入三氯醋酸或丙酮、乙腈、甲醇，蛋白质 被沉淀下来，然后经超速离心，吸取上层清液供分离 测定用。 l超过滤 用孔径为l010-10-500l0-10m的多孔膜过滤，可除 去蛋白质等高分子物质。 五、主要分析步骤 l 检测条件的确定 Investigation of measuring conditions l 系统适应性检验 Investigation of Adaptability l 方 法 学 考 察 Methodological detection l 标准曲线的绘制 Calculation curve l 方 法 的 应 用 Application l1.1 最佳波长的确定 利用紫外全波长 扫描仪扫描标准品溶液，确定最佳吸收波长 。若为混合样品，则兼顾每个样品的吸收波 长。 1 检测条件的确定 Investigation of measuring conditions l1.2 流动相的确定 l流动相是分离成败的关键因素。 l流动相一般由甲醇-水、甲醇-水-酸、乙睛-水 等组成，根据化合物的性质和色谱柱的材料而 定。 Investigation of measuring conditions 1.3 流速的确定 流速对于分离效果非常重要。 流速范围：0.5-1.2 ml/min 常用范围：0.7-1.0 ml/min Investigation of measuring conditions 1.4 色谱图检验 标准品的色谱图： 样品的色谱图： 2 系统适应性检验 2.1 理论塔板数 用于定量表示色谱柱的分离效率（柱效），用 N 表示 取决于色谱柱固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等 ）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速等。 lN = 5.54（tR / Wh/2）2 h/2 保留时间 tR 半峰宽Wh/2 峰高 h Investigation of Adaptability 2.2 分离度 l相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。 也叫分辨率，表示相邻两峰分离的程度。 lR1.5称为完全分离。中国药典规定R应 大于1.5。 W1 W2 tR 1 tR 2 Investigation of Adaptability 2.3 拖尾因子（T） 为保证分离效果和测量精度，应检查色谱峰的 拖尾因子是