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实验六 细胞器的分离与观察 一、细胞核的分离与观察 二、线粒体的分离与观察 一、实验目的 o了解细胞器的分离原理 o掌握差速离心和密度梯度离心技术 二、实验原理 o细胞器是细胞中维持细胞复杂生命活动的功能性器官 ，为了研究各种细胞器的功能，首先就要将这些细胞 器从细胞中分离出来。利用各种物理方法（研磨、超 声波振荡、低渗等将组织制成匀浆，细胞中的个中亚 组分即从细胞中释放出来。 o细胞内不同结构的细胞器大小密度存在差异，因此不 同细胞器在介质中的沉降系数各不相同。根据这一原 理，常用不同转速的离心法来分离不同的细胞器。分 级分离的方法有差速离心和密度梯度离心两种。 o分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆， 在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离， 其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三 步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组 成、理化特性及其功能的主要手段。 (1)细胞匀浆(Homogenization)：低温条件下， 将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即 0.25molL蔗糖)进行破碎细胞使之成为各种细 胞器及其包含物的匀浆。 (2)分级分离(Fractionation)：由低速到高速离心 逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高 的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使 各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。由 于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时 均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第 一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮 和离心加以纯化. (3)分析：分级分离得到的组分，可用细胞化学和 生化方法进行形态和功能鉴定。 Unna染色法（甲基绿-派洛宁染色） 细胞核分析：甲基绿-派洛宁对DNA和RNA有选择性 的染色效果。核酸是酸性的，它们对于碱性染料甲 基绿和派洛宁的亲和力不同，而使这两种染料对两 类核酸具有了选择性。DNA被甲基绿染成绿色，RNA 被派洛宁染成红色，这样就能使细胞中两种核酸分 布显示出来。 活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊 的部分，主要是染料的“电化学”特性起重要作用 。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒 表现带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离 子或阳离子，这样它们彼此之间就发生了吸引作用 。 中性红-詹纳斯绿染色 线粒体分析：詹纳斯绿（Janus green B）是 对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于 碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在 线粒体膜上。由于线粒体内具有细胞色素氧化 酶系，能使詹纳斯绿保持在氧化状态（淡蓝绿 色）。中性红为弱碱性染料，对液泡系(即高尔 基体)的染色有专一性，将活细胞中的液泡系染 红色。 洋葱内表皮细胞的线粒体分布 植物根尖液泡的中性红染色 三、材料和试剂 o材料：小鼠的肝脏 o器材：高速冷冻离心机、天平、显微镜、Eppendorf 管、冰块、冰盒、载玻片、盖玻片、玻璃匀浆器 o试剂：生理盐水、0.25mol/L蔗糖溶液、 0.34mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液、 0.88mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液、 95%乙醇溶液、丙酮、PBS液、 甲基绿-派洛宁染液、中性红-詹纳斯绿染液。 四、实验方法与步骤 o1.细胞核的分离 （1）组织匀浆:将饥饿24h的大白鼠处死,立即剪开腹部 ,迅速取出肝组织浸入预冷的生理盐水,洗去血污,用滤 纸吸干。称取0.5g肝组织,在小烧杯中剪碎,用预冷的 0.25mol/L蔗糖溶液洗涤数次。将烧杯中的悬浮肝组织 倒入匀浆管中进行匀浆,匀浆过程要在冰浴中进行。匀 浆完毕,移入1.5ml离心管中。 （2）离心：低温离心机（4）中进行。 每次 离心前一定要在天平（托盘天平）上将两离心 管配平。第一次以600g(3005rpm)离心10min。 将其上清夜移入Eppendorf管中，盖好盖子置于 冰浴中，留待后面使用（分离线粒体）。沉淀 使用1ml预冷的0.25mol/L蔗糖溶液离心洗涤2次 ，每次1000g(3880rpm)离心10min。 （3）纯化：将沉淀用5倍体积0.34mol/L蔗糖溶 液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液混悬，用长针头注射 器再混悬液下轻轻加入4倍体积0.88mol/L蔗糖溶 液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液。尽量使两种溶液明 显分层。以1500g(4752rpm)离心1520min。弃 上清液，沉淀即为经过纯化的细胞核，用PBS溶 液悬浮，4C保存。 o细胞经甲基绿-派洛宁混合液处理后，其中的 DNA和RNA出现不同的呈色反应，一般认为这是 由于带有负电荷的核酸对碱性染料派洛宁和甲 基绿具有亲和力，且这两种染料的作用有选择 性，甲基绿染高聚分子的DNA呈蓝绿色，派洛宁 染低聚分子的RNA呈红色。 下次实验内容： （4）鉴定：将分离纯化的细胞核制成涂片，空气干 燥。将干燥的涂片浸入95乙醇溶液固定5min，晾 干，滴加甲基绿-派洛宁染液染色2030min，丙酮 分色30s，蒸馏水漂洗，滤纸吸干水，镜检。 核DNA呈蓝绿色，核仁和混杂的细胞质RNA呈红色。 六、实验报告 o1. 线粒体提取分离过程中，为什么要在04进 行？ o2. 要获得高活性的线粒体，在线粒体提取、分离 和活性鉴定的过程中需注意哪些问题？根据你的实 际体会，写出操作注意事项及改进方法。 o3. 分离介质 0.34mol/L及 0.88mol/L缓冲蔗糖溶 液哪一种在下层? 有什么作用? 2.线粒体的分离 o(1)分离:将分离细胞核时收集的上清液以 10000g(12270rpm)离心10min。沉淀用预冷0.25mol/L蔗 糖溶液悬浮,10000g离心10min,反复2次。 o(2)鉴定:在干净的载玻片中央滴加12滴中性红-詹纳斯 绿染液,用牙签挑取沉淀物均匀涂片。盖上盖片,染色 5min,镜检。 线粒体蓝绿色，呈小棒状或圆形。 五、实验结果 o核DNA呈蓝绿色，核仁和混杂的细胞质RNA呈 红色。 o线粒体蓝绿色，呈小棒状或圆形。 o观察每个视野中所见完整细胞核和线粒体的 数量及纯度。 差速离心 （differential centrifugation） o主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的 细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到 管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改 用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降， 以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。 沉淀 转转速x时间时间 内 容 物 A150g x 20min完整细细胞 B1000g x 20min 细细胞核，细细胞碎片 C3000g x 6min 叶绿绿体 D10000g x20min 线线粒体、溶酶体、微体 E105000g x120min微粒体 F105000g x 20min 0.26%脱氧胆酸纳纳 核糖体 密度梯度离心 （density gradient centrifugation） o用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密 度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通 过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。 o如果分离的颗粒在具有密度梯度的介质中离心 时，质量和密度大的颗粒比质