基因编辑方法CRISPR-Cas9.pptx

CRISPR-Cas9一种新型基因编辑 方法 又称基因组定点修饰技术，通过在某些物种基因组中进行靶向特异 性的突变，从而解答并提出更多精确的生物学问题。 方法包括： 锌指核酸酶（Zinc-finger nuclease，ZFN）技术 转录激活因子样效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALEN）技术 Cas9/gRNA 系统(CRISPR-cas9技术) 基因组编辑技术 Cell 2014 157,1262-1278 Figure2B 不论是TALEN技术还是ZFN技术，其定向打靶都依赖于 DNA序列特异性结合蛋白模块的合成,将蛋白模块与限制性内切 酶 (Fok) 的DNA切割域融合而得到。由蛋白特异结合域定位 ，DNA切割域剪切。 锌指核酸酶（ZFN）转录激活因子 样效应物核酸酶（TALEN）技术 Cell 2014 157,1262-1278 Figure2A CRISPR-Cas9 技术 原理：规律性重复短回文序列簇（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs） CRISPR-Cas系统是细菌和古细菌在不断进化的过程中获得一 种适应性免疫防御机制，研究者根据 CRISPR-Cas 系统的特 性对此系统进行改造产生了第 3 代人工核酸内切酶技术 CRISPR-Cas9技术。该技术通过小片段的 RNA 介导对入侵的 核酸进行靶向定位并通过Cas酶对核酸进行酶切、 降解。 CRISPR-Cas9 技术是一种多物种适应性的，位点特异性的有 效基因组编码工具。 Cell 2014 157,1262-1278 Figure4 CRISPR-Cas9 技术 从已知的序列中通过过 PAM 进进行定位寻寻找合适的靶 位点并合成 gRNA 构建gRNA 与/Cas9 重组质组质粒。 对对重组质组质 粒进进行活性检测检测 ，敲除活性的计计算 挑选选活性较较高的敲除质质粒导导入培养的细细胞或者生 物体内进进行基因组组定点编辑编辑 操作 利用测测序、RFLP 等方法检测检测 基因组组定点修饰结饰结 果 sgRNA 的设计 选择 PAM（NGG）5端的一段碱基序列20nt作为原间隔序列，即 敲除的靶位点。(PAM，Protospacer adjacent motifs 原间隔序列 临近基序。一般形式为 NGG，其作用是将间隔序列定位于入侵 的噬菌体或质粒的 DNA 序列中) 原则： 选择的序列必须在全基因组中进行比对，原间隔序列必须唯一， 否则会对其他基因进行敲除而出现错误的实验结果。 优先选择 DSB 位点的侧翼存在重复序列（如果 DSB 的侧翼存在重 复序列，在进行非同源末端重组时能够精确的介导断裂位点碱基 的缺失）。 PAM 的5端尽量存在酶切位点。（有利于后期的活性检测） 构建重组质粒 构建方案 ： 1.一是将gRNA 与 Cas9 连入同一个质粒载体中并以双启动子启动，载 体中携带荧光报告基因（用于流式细胞仪筛选）或抗性基因（用于 药物筛选） 。 2.二是将 gRNA与 Cas9 分别连载不同的载体上，两个载体携带有不同 的荧光报告基因或抗性基因 载体选择： 慢病毒载体 以HIV-1的主要功能元件为基础构建起来的转基因和基 因治疗载体。区别于腺病毒载体，可实现外源基因在目标细胞内稳定的 传代表达。 gRNA的活性检测 限制性内切酶法 当 Cas9/sgRNA靶点位置中间序列存在限制性内切酶切位点时，如果 通过 Cas9/sgRNA 发生突变，这个位点将可能被破坏，而不能被 内切酶 酶切。可采用电泳的方法估计突变效率， 以突变效率的高低来衡量 sgRNA 的活性。 非配对内切酶法 T7 核 酸 内 切 酶 I（T7 endonuclease I，T7E1） 能够识别不完全配 对 DNA 并对其进行切割，如果通过 Cas9/sgRNA 发生突变，将基因组 DNA 做 PCR，将相对应的 PCR 产物与野生型 DNA的 PCR 产物等量混合 ，并退火杂交，将产生非配对DNA 片段，将能被非配对内切酶 T7E1 剪 切。用电泳的方法估计突变效率，以突变效率的高低来衡量 sgRNA 的 活性。 SSA 活性检测 一个终止子插入 luciferase（GFP）的编码区中央，luciferase（GFP ）就会失去活性。为检测 Cas9/sgRNA 剪切活性，将一个 Cas9/sgRNA的 靶点位置序列插在终止子后。在Cas9/ sgRNA 的作用下，靶点位置产生 DSB，细胞通过同源重组方式修复 DNA，形成一个有活性的luciferase。 通过与对照组的比值变化就可反应 Cas9/sgRNA 剪切的活性水平。 降低sgRNA/Cas9脱靶率的方法 Cas9的两个内切酶活性域为RuvC和HNH,两个亚基分别负责对一条 DNA单链的切割。任一亚基的失活都将形成DNA单链断裂（nicked DNA ）。 当结合于两条互补的 DNA 链上相邻位置的一对 sgRNA 同 时引 导 Cas9 D10A 识别并切割靶位点时才能造成 DSB，从而加大了识别的长度 ，有效的提高了 Cas9-sgRNA 技术的特异性。 Cell 2014 157,1262-1278 Figure6A,B 重组质粒导入细胞/生物体 C、将编码Cas9和sgRNA的表达质粒直接转染至细胞系中。 D、将纯化的Cas9和体外表达的sgRNA显微注射至受精卵，快速得到转 基因动物模型。 E、将编码CRISPR组分的高效价的病毒载体转导至组织或细胞，完成特 定时间，组织的基因编辑。 Cell 2014 157,1262-1278 Figure6C,D,E CRISPR-Cas9技术的应用进展 1. CRISPR/Cas 系统可以作为一种位点特异性基因编辑平台 Cas9-sgRNA 在靶位点切割产生DSB后， 细胞可以通过两种方式对 DNA 进行修复， 非同源末端连接 （non-homologous endjoining，NHEJ） 修复方式和同源重组方式（homology-directed repair，HDR）。 NHEJ 往 往使得核酸链被剪切的区域发生基因突变，导致编码的基因Knockdown。 而HDR往往通过供体 DNA 与基因组 DNA 之间的同源重组造成靶位点的纠 正或者靶向插入外源基因Knockin。 Cell 2014 157,1262-1278 Figure2A CRISPR-Cas9技术的应用进展 2. 利用 Cas9 系统在转录水平对基因表达的调节 通过点突变使 Cas9 蛋白的两个核酸内切酶结构域活性全部丧失获得 dCas9，将 dCas9-sgRNA 作为与 DNA 特异性识别的平台，令转录因子或 表观调控酶与dCas9-sgRNA 融合表达，即可实现转录水平对基因表达的调 节。 Cell 2014 157,1262-1278 Figure6G CRISPR-Cas9技术的应用进展 3. 利用 Cas9 系统对目标 RNA 序列进行操纵 CRISPR/Cas 蛋白亚型（型）被证明可以靶向消化 RNA 底物。预 示着该技术的发展将会代替shRNA/siRNA 等传统 RNAi技术成为一种新型 的 RNA 干扰物而对不同种类的细胞及动物模型中特定的基因的下游产物进 行RNA 干扰。 Cell 2014 157,1262-1278 Figure4截图 CRISPR-Cas9技术的应用进展 4. 利用 Cas9 系统对基因组功能进行筛查 Cell 2014 157,1262-1278 Figure6F CRISPR-Cas9技术的应用进展 5. Cas9 系统作为DNA特定位点标签 Cell 2014 157,1262-1278 Figure6H Cas9和GFP融合表达， 可动态记录胞内DNA特定位 点的染色体结构状态 。 CRISPR-Cas9技术的应用进展 6.利用 Cas9 系统可实现对基因的诱导调控 Cell 2014 157,1262-1278 Figure6I 通过化学或可控因素诱导Cas9肽片段的重建，实现对基 因的诱导调控。 展望 到目前为止对 CRISPR/Cas9 技术的开发尚属初步。虽然 Cas9 系 统会被 sgRNA 引导从而识别出靶序列，但脱靶效应依然存在，特异 性仍待提高。 与成熟的 ZFN 和 TALEN 等遗传物质靶向编辑系统相比， CRISPR/Cas9 核酸内切酶系统具有构建简单方便快捷、安全性高、 毒性小等得天独厚的优越性，势必将在临床治疗、基础理论研究和 农牧渔业等领域发挥巨大的作用，并且将会对分子生物学研究和基 因治疗领域产生深远的影响。 参考文献 1 Patrick D. Hsu, Eric S. Lander,and Feng Zhang.Development and Applications ofCRISPR-Cas9 for Genome Engineering. Cell .2014 (157):1262-1278. 2 左其生等. CRISPR-Cas 介导的基因编辑工具.生物技术通 报