细胞生物技术论文-免疫荧光技术的原理及应用.doc

免疫荧光技术的原理及应用 摘要：免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。本文综述了免疫荧光技术的主要实验原理及应用。关键词：免疫荧光技术；荧光色素；原理；应用 以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（fluorescentantibodytechnique）。Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法，用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术。因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。以荧光抗体方法较常用。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术【1】。该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。荧光免疫法按反应体系及定量方法不同，还可进一步分做若干种。与放射免疫法相比，荧光免疫法无放射性污染，并且大多操作简便，便于推广。国外生产的TDM用试剂盒，有相当一部分即属于此类，并且还有专供TDM荧光偏振免疫分析用的自动分析仪生产【2】。由于一般荧光测定中的本底较高等问题，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。近年来发展了几种特殊的荧光免疫测定，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，在临床检验中应用。1原理免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。直接法：将标记的特异性荧光抗体，直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。间接法：如检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗原抗体抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。如果检查未知抗体，则表明抗原标本是已知的，待检血清为第一抗体，其它步骤的抗原检查相同【3】。标记的抗抗体是抗球蛋白抗体，同于血清球蛋白有种的特异性，如免疫抗鸡血清球蛋白只对鸡的球蛋白发生反应，因此，制备标记抗体适用于鸡任何抗原的诊断。2技术分类：2.1 荧光抗体技术(荧光显微镜技术)抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判定结果的检测方法。将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查【4】。2.2免疫荧光测定技术：抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法。染色程序分为两步，第一步，用未知未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原标本上，在湿盒中37保温30min，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体。第二步，加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体。如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定未知抗体【4】。 3 常用荧光色素选择3.1常用的荧光色素 许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料【3】。常用的荧光色素有：(1)异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490495nm，最大发射光波长520530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，结构式如下：有两种同分异结构，其中异构体型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。其主要优点是：人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。(2)四乙基罗丹明（rhodamine，RIB200）为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性质稳定，可长期保存。结构式如下：最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595600nm，呈橘红色荧光。(3)四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）结构式如下：最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。（2）其他荧光物质1）酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如4-甲基伞酮-D半乳糖苷受-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。其他如碱性酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。2）镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3 ）、铽（Tb3 ）、铈（Ce3 ）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3 应用最广。Eu3 螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。3.2合适荧光素的选择 1）具有与蛋白质形成共价键的化学基团。2）荧光效率高，标记后下降不明显。3）荧光色泽与背景色泽对比鲜明。4）标记后能保持生物学活性和免疫活性5）标记方法简单、快速。6）安全无毒4免疫荧光技术的应用 由于免疫荧光技术具有将免疫学的特异性和敏感性与显微形态学的精确性相结合的特点,它已在医学、兽医学、生物学研究的各个方面广泛应用【5】。4.1在免疫组织化学及免疫细胞化学中的应用4.1.1 激素和酶的定位免疫荧光组织化学方法建立以后,对各种激素和酶的定位研究迅速发展。如促肾上腺皮质激素、黄体生成素、生长激素、催乳素、胰岛素、酸与碱性核糖核酸酶、过氧化氢酶、三磷酸目油醛脱氢酶、胰蛋白酶、透明质酸酶等。4.1.2 组织和细胞内抗原性物质的示踪具有杭原性的组织和细胞组分儿乎均可用免疫荧光技术进行定位示踪。如肾组织抗原、肌动蛋白和肌球蛋臼等。4.1.3 细胞膜杭原和膜受体的观察用免疫荧光技术已证明动物细胞的膜抗原和膜受体,特别是淋巴细胞的膜受体。如小白鼠组织相容性抗原、器官抗原、同种白细胞抗原、血型抗原等。4.1.4 在免疫细胞学上的应用，免疫荧光方法已能观察细胞的分化过程,探讨细胞来源及机能。4.2在细菌学和病毒学研究中的应用 在细菌学中主要用于菌种的鉴定及抗原定位研究,在病毒学中主要用于病毒抗原的定位及病毒在细胞内的繁殖、扩散以及病毒感染的快速诊断。4.3在自身免疫病及病理学研究中的应用 作为一种研究手段和诊断方法,荧光杭体技术对探讨某些疾病的发病机制及实验诊断十分重要,如动脉粥样硬