蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究硕士论.doc

分类号: 密级: U D C : 编号: 硕士学位论文蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究Effect of propolis on the prevention and control of Tobacco bacterial wilt硕士研究生：孔聪聪指 导 教 师：兰建强 副教授 申请学位类别：农学硕士专 业： 农药学培养学 院： 植物保护学院二O一三年四月Effect of propolis on the prevention and control of Tobacco bacterial wiltKong CongcongA Thesis submitted to Yunnan Agricultural University In special Fulfillment of the Requirements for Master Degree of Pesticide Directed by Associate Professor Lan Jian-qiang Department of Pesticide Science of Plant Protection CollegeYunnan Agricultural University ,Yunnan, Kunming 650201 , ChinaApril 2013独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得云南农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名: 时间: 年 月 日关于学位论文使用授权的声明本人完全了解云南农业大学有关保存、使用学位论文的管理办法及规定，即:云南农业大学有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意云南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名: 时间: 年 月 日导师签名: 时间: 年 月 日目录摘要1ABSTRACT21.引言31.1我国烟草病害的研究进展31.2烟草青枯病31.2.1病原41.2.2症状41.2.3致病性变异41.2.4生化型研究51.2.5发病机制61.2.6田间发病动态71.2.7病害流行规律71.3烟草青枯病的防治研究81.3.1抗病品种的利用81.3.2农业防治81.3.3生物防治91.3.4化学防治101.3.5施用抗性诱导剂101.3.6转基因植物的利用101.4蜂胶111.4.1蜂胶特性111.4.2蜂胶的主要化学成分及差异性121.4.3蜂胶中的主要活性物质121.4.4蜂胶中主要活性物质的功能121.4.5蜂胶的应用131.5绿色有机烟草151.5.1国内外有机烟叶发展现状151.5.2有机烟叶种植技术体系研究171.5.3我国有机烟叶的发展优势与对策181.6本实验的目的及意义192.材料与方法202.1 材料202.1.1菌种202.1.2培养基202.1.3供试烟苗212.1.4供试药剂212.1.5实验仪器212.2试验方法212.2.1五种烤烟品种对烟草青枯病的抗病性试验212.2.2青枯假单胞杆菌的药剂筛选试验222.2.3室内盆栽试验232.2.4田间药效试验243.结果分析243.1五种烤烟品种对烟草青枯病的抗病性试验243.2青枯假单胞杆菌的药剂筛选试验273.2.1农用链霉素的抑菌活性283.2.2多菌灵的抑菌活性283.2.3蜂胶的抑菌活性283.2.4复配I（农用链霉素+蜂胶）的抑菌活性283.2.5复配II（多菌灵+蜂胶）的抑菌活性293.2.6几种药剂处理对烟草青枯病防治的综合评价293.3室内盆栽药效试验293.4田间药效试验304.讨论304.1烟草青枯病的接种方法304.2五种烤烟品种对青枯假单胞杆菌的抗性304.3蜂胶对青枯假单胞杆菌的抑制效果314.4蜂胶对烟草青枯病的防治效果314.5盆栽试验与田间药效试验中防效的比较324.6烟草青枯病的防治325.结论32参考文献34致 谢39蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究摘要在有机烟叶生产过程中，不能使用任何化学合成的农药，所以对蜂胶的防治效果进行了测试。分别通过药剂筛选实验、抗病性实验、盆栽实验及田间药效实验，为蜂胶防治烟草青枯病提供了初步依据：1抗病性实验中，通过针刺接种方法与注射接种方法的比较，表明注射接种能使植株更易更快发病，易于本实验研究；通过红花大金元、NC297、MSK326、云87、云97五个烤烟品种对青枯假单胞杆菌的抗病性试验，结果表明红花大金元与云87为高感品种，MSK326与云97为中感品种，NC297为中抗品种，生产种植中应选种NC297。2药剂筛选实验中，通过对比72%农用链霉素、90%多菌灵与蜂胶对青枯假单胞杆菌的抑制效果，结果显示蜂胶对青枯假单胞杆菌的抑制效果不佳，与72%农用链霉素差别明显。3盆栽实验与田间药效实验中，通过蜂胶与72%农用链霉素防治烟草青枯病的比较，结果显示蜂胶的防治效果都不超过30%，而72%农用链霉素的防治效果均在65%以上，可见蜂胶对烟草青枯病的防治效果没有农用链霉素好，但还是有一定的防治效果的，尤其作为一种天然产物，对有机、绿色烟叶的生产种植还是有一定的价值跟意义的。关键字：烟草青枯病；青枯假单胞杆菌；蜂胶；防治；效果 ABSTRACTEffect of propolis on the prevention and control of Tobacco bacterial wiltKong CongcongDirected by Associate Professor LAN Jian-qiangIn the organic tobacco production process, any chemical synthesis of pesticides can not be used.So propolis were tested. Through the resistance experiment, the drug sensitivity test, the Pathogenicity test and the field experiment, it provided a preliminary basis for the control of tobacco bacterial wilt of propolis:1.The resistance experiment, through the comparison of acupuncture inoculation method and injection inoculation method, showed that the injection could make plants more easy and fast onset.So the injection inoculation method applied to this experimental study. By pathogenicity to Pseudomonas solanacearum of Honghuadajinyuan, NC297, MSK326, yun 87 and yun 97, the results showed that Honghuadajinyuan and yun 87 were highly susceptible varieties, MSK326 and yun 97 were moderate susceptible cultivars, NC297 was moderate resistant variety.So NC297 should be chose to plant.2.The drug sensitivity test, by inhibiting effect of 72% streptomycin, 90% carbendazol and propolis on Pseudomonas solanacearum, indicated that the inhibitory effect of propolis on Pseudomonas solanacearum is poor, with 72% streptomycin was significantly different.3.The pot experiment and field efficacy experiment, by propolis and 72% streptomycin control tobacco bacterial wilt, the results showed that the control effect of propolis was more than 30%, and the control effect of 72% streptomycin was more than 65%.It showed that the control effect of streptomycin on tobacco bacterial was better than the propolis. But propolis still have certain effect. Especially the propolis as a biological source of drugs，have a certain value and significance to the production of the organic tobacco.Keyword : Tobacco bacterial wilt; Pseudomonas solanacearum ; propolis; control; effect1.引言烟草是重要的经济作物，在云南省一些经济落后的贫困地区，许多农民靠种植烟草维系生活，是山区农民脱贫致富，提高生活水平的有效途径。在烟草种植过程中，烟草病害是影响烟草产量、品质的重要因素，因此世界各烟草栽培国均高度重视病害防治。1.1我国烟草病害的研究进展根据1997年我国16个产烟省(区)的调查，目前有烟草侵染性病害68种，其中主要病害15种。已鉴定的62种病害中，真菌性病害30种、细菌性病害8种、病毒病害17种、类菌原体病害2种、线虫病害3种及寄生性种子植物2种。其中有15种主要烟草病害，他们是(按为害严重程度及分布范围为序)普通花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病、赤星病、黑胫病、炭疽病、青枯病、野火病、马铃薯Y病毒病、蛙眼病、根结线虫病、空茎病、猝倒病、角斑病、根黑腐病、蚀纹病毒病。真菌病害中，烟草黑胫病、根黑腐病和赤星病为害最为严重。细菌病害中，为害最为严重的是烟草青枯病和烟草野火病。病毒病害中，烟草普通花叶病和烟草黄瓜花叶病最为严重，其次是烟草马铃薯Y病毒病1。近年来烤烟苗期病害越来越严重，对烟苗造成了严重影响。做好烟草苗期病害的综合防治，是培育足够壮苗、提高烟叶产、质量，获得较好经济效益的基础性工作。目前烤烟苗期病害最普遍、严重的病害主要有烟草炭疽病，猝倒病，立枯病和病毒病。1.2烟草青枯病烟草青枯病是热带、亚热带地区烟草的重要病害，1880年该病首先在美国的北卡罗来纳州格兰维尔（Granville）被发现，故当时被广泛称为格兰维尔凋蔫病，在中国则俗称为“烟瘟”、“半边疯”2。 1940年前后，该病在美国和印度尼西亚的为害最为严重，此后，在许多产烟国家逐渐演变为烟草上的重要病害，如日本、澳大利亚、韩国等2。 目前在中国，长江流域及其以南烟区普遍发生，个别年份常常暴发流行，造成毁灭性损失。近几年来，该病的发病和为害范围有向北方烟区扩展的趋势，在山东、河南、陕西及辽宁等省都有发生，局部地区为害较重。云南省烟草青枯病早在1987年就有报道，但危害一直较轻3,4。自2002年以来，云南省南部旱地烟区，烟草青枯病危害上升速度很快，局部地块发病率达到80以上，且常与烟草黑胫病混合发生，严重时可使全田烟草枯死5。目前，该病造成的损失已居各类病害的第4位，必须重视该病的防治工作。1.2.1病原烟草青枯病病原曾用名Pseudomonas solanacearum Smith2 或Burkholderia solanacearum3。1996 年由IJSB 正式更名为青枯雷尔氏菌（Ralstonia soanacearum E F Smith）3,4。此后，在国际重大刊物上发表的文章均使用该名。菌体杆状，革兰氏染色阴性，菌体大小为0.50.81.32.2 m，极生鞭毛14 根，不形成荚膜和芽孢，为好气性细菌，在兼气下培养，其毒力迅速丧失。不同寄主上的菌落形态无明显差异。病菌生长的温度范围为1837 ，最适温度3035 ，致死温度为52 ，持续10 min；pH 值48，最适为6.6。烟草青枯病菌在病残体中可以存活7 个月，在土壤或堆肥中可存活23 年以上，有的竟达825年，但在干燥的条件下很快就死亡，在种子表面的病菌2 d后即可全部死亡。在TTC培养基上，菌落中央呈粉红色，周围乳白色流动性较强（郑继法等，1998）6。1.2.2症状烟草青枯病属典型的维管束病害，根、茎、叶各部位均可受害，但以为害根、茎为主。最典型的症状是：叶片枯萎后仍呈绿色，故称“青枯病”。在病株发病的一侧，叶片枯萎，无病的一侧叶片生长正常，呈现“半边疯”症状。茎部发病后，外表出现黑色条斑，发病严重时黑色条斑一直延伸到烟株顶部，将病株茎部横切，可见维管束变成褐色，用力挤压切口，会从导管中渗出黄白色乳状粘液，即细菌“菌脓”7。受烟草青枯病菌感染的烟株一般仍然保持直立，不折倒，未摘除的病叶紧贴茎秆上。烤后症状：病叶烤后，单叶重减少，光滑，等级下降，化学成份失调。发病烟叶半片变黄或全片叶变黄时采收，烤后叶色为半叶或全叶杂色；整株烟全部枯萎变黄采收烘烤，烤后叶片为糟片，多为级外烟8。1.2.3致病性变异青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)寄主范围虽然广泛，但菌株间的致病性具有明显寄主专化性9,10。Budenhagen 1964 年依据不同寄主的致病性，将供试青枯菌株分为3 个小种11。近年来的研究发现，桑树青枯菌株的致病性与3个小种都具有明显差异，称为小种49,12。烟草青枯菌属于小种1，只能侵染茄科植物。而且进一步的研究表明，不同地区来源的烟草青枯病菌株，对其他不同寄主植物的致病性以及对烟草不同品种的致病性都有显著差异13。王国平等根据烟草青枯病菌株对烤烟品种MSK326的平均致病病级不同，分为强、中和弱致病类群，大多数调查地点强、弱致病类群并存，这表明烟草青枯病菌株间有很大的致病性差异。青枯菌的致病性在人工培养基上还很容易减弱或丧失，从TTC 培养基上菌落的形态可以鉴别致病性不同的菌落。致病性强的野生型菌株，菌落一般较大，稍凸起，不规则圆形，中央粉红色，边缘乳白色，对光观察可见有轮纹，流动性较强；弱毒或无毒菌株的菌落一般较小，圆形，中央深红色，白边较窄或无白边，菌落表面粗糙或光滑有光泽。来源不同的菌株之间致病性丧失的速率有很大差异。研究表明，青枯菌致病性丧失与诸多因素有关，如菌株来源，培养基中碳、氮来源、种类、培养条件等14。青枯菌在培养基上培养时间过长，易产生无毒突变体，而在无菌水中失毒则相对较慢。分子遗传学研究指出，青枯菌的致病性基因主要携带在一个特大质粒上，而且分布在7 个限制性内切酶片段上15。这可能是该菌易变异的主要原因之一。1.2.4生化型研究Ralstonia solanacearum 可利用多种有机碳源、无机碳源、氮源，不同来源的菌株对不同碳、氮化合物的利用能力有很大差异。自20世纪60年代以来，国际上对不同寄主上的青枯病菌株的生化型进行了研究，澳大利亚的A C Hayword16依据对3种双糖(麦芽糖、纤维二糖、蔗糖)和3种己醇(甘露醇、甜醇、山梨醇)的利用能力，将149个青枯病菌株分为4个生化型。1986年，华静月等9,12又将桑树青枯菌株分为新生化型，即生化型V。烟草青枯菌的生化型变异很大，不同来源的菌株其生化型有很大差异11,17，而且菌株经长时间保存后，其所属生化型也会发生变化17。美国北卡的烟草青枯菌菌株主要为生化型18，中国台湾省以生化型和为主19，朝鲜则主要为生化型和20。据报道，中国大陆上烟草青枯菌为生化型和9,12,21，张建华等21研究了30个烟草青枯病菌株对3种双糖和3种已醇的利用能力，结果表明，供试青枯菌可分为2个生化型(、)，生化型在测试地区和品种上均有发生。王敏等22测定了81个烟草青枯菌菌株的生化型，结果表明，云南省以生化型为主。在自然或人工培养条件下，青枯菌易产生无毒突变体，其生化型也发生变化，在同一个地区和同一寄主上可以分离到生化型不同的菌株。张建华等21的研究从同一地区的同一品种上也分离到两个或两个以上的生化型。此外，随着对烟草青枯菌菌株研究数量的增多，还出现了越来越多的不能归入现有任何生化型的中间型菌株12,21-23。故有的学者又提出了生物亚型的概念，但对生化型与生化型之间的关系及其划分标准尚缺乏统一的认识。1.2.5发病机制在自然条件下，病原菌通常是从烟株的根部侵入，而且在根系又伤口的条件下更容易侵入。Lucas等(1975)的研究结果是烟株根系形成伤口后立即进行接种，要比在24h后再接种的感染率要高得多，在伤根48h后再接种，烟株受害率更明显减少，这说明伤口在形成48h后已经基本愈合，可阻止病原菌入侵。移栽时造成的伤口也比移栽后造成的伤口更易侵入。病原菌在烟株其他部位侵入也是通过伤口进行的。但是，在接种细菌数量很大的情况下，即使没有伤口也能侵入。青枯病菌对烟株的致病作用大致可以分为三个过程，即诱导局部枯萎、破坏组织和整株枯萎。病原菌侵入皮层后于细胞间隙生长，破坏细胞间的中胶层，使细胞质壁分离，变形，并形成空腔，继而侵染木质部薄壁组织，使导管附近的小细胞受刺激形成侵填体，并移入侵填体。侵填体破裂后既被释放进入导管，青枯菌在导管内大量繁殖菌体及其代谢产生的大分子物质(主要是胞外多糖，EPS)，其影响和阻碍植物体内的水分运输，EPS堵塞导管，并在导管内大量增殖和快速传播扩张，影响和阻碍植物体内水分运输，同时青枯菌还向胞外分泌多种细胞壁降解酶，破坏导管组织，从而引起植株萎蔫和死亡24。青枯病菌引起多种植物的致死性枯萎，主要通过根和茎的伤口，或次生根的根冠进入植物体，侵染寄主的木质部，然后在整个维管束中蔓延，引起严重的萎蔫，最终导致植物死亡。青枯菌虽然寄主范围广泛，但某些菌系在自然条件下，只能侵染少数几种或某一种植物，因此青枯菌的致病机理十分复杂。目前，国内外对青枯菌致病机理的研究大量集中在对胞外多糖(EPS，由eps基因编码)、果胶酶(主要为内聚半乳糖醛酸酶，PG，由pgIA基因编码)和纤维素酶(主要为内切葡聚糖酶EG，由egl基因编码)在致病过程中的作用24。青枯病菌在导管中生长时可产生大量胞外多糖，影响和阻塞植物内的水分运输，特别是易于对叶柄结和小叶处较小孔径的导管穿孔板造成堵塞，因而引起植株萎蔫25。20世纪80年代中期以来，已从分子水平上来研究这些因素的作用。美国威斯康星大学Sequeira实验室在多年研究胞外多糖的基础上，于1991年报道克隆出了控制胞外多糖和脂多糖的基因簇，佐治亚大学Denny实验室克隆出了控制胞外多糖等表型转变的基因，美国的Schell等和Allen等已在分子水平上进行了研究，对聚半乳糖醛酸酶的结构基因及内葡聚糖酶的结构基因均已进行了克隆、测序和功能分析。结论是这两种酶在青枯菌致病中有一定作用26。此外，在该菌中被鉴定出hrp基因在寄主和病原菌互作中起到重要作用，引起寄主发病26。1.2.6田间发病动态由于各地地理环境和气候条件不同，青枯病在各地区的发生消长态势存在很大差异。了解病区烟草青枯病的侵染与发病动态，对病害早期监测，以及药剂防治适宜时期的确定具有重要的指导意义。有关根部侵染的早期监测研究很少，陈顺辉等提出通过20cm土温和高感品种红花大金元的萎蔫症状监测烟草青枯病的流行动态27。青枯病在我国呈由北向南、由西向东始病期逐渐提早，为害程度逐渐加重的趋势28。烟草青枯病发生危害与品种、耕作类型、栽培管理、地形地势等有密切关系29。据广东省的调查结果表明，在春季5月份日均气温达到23以上开始出现烟草青枯病病株；当旬降水50cm以下，相对湿度80%以下，日照率高于15%，青枯病轻度发生；当日均气温为2530，多雨、高温、少日照条件下病害则严重流行。病原菌从根部侵入后1周或稍长时间，烟株地上部出现青枯症状。发病后25d内病情发展快，以后病情逐渐减弱28。同一省区平原与山区发病时期也不同，山区比平原发病稍晚一些30。1.2.7病害流行规律烟草青枯病是高温高湿型病害。低温高湿或高温干旱都不能使病害发生和流行。发病最适宜的温度为3035。湿度是影响该病发病流行的另一重要因素。雨量多、湿度大，病害发展快，为害重，相反雨量少、湿度低，病害发展受抑制，为害相对较轻。暴风雨或久旱后遇暴风雨或时雨时晴的闷热天气，更有利于病害的发生和流行，往往易于造成该病的大发生1。不同土壤类型，青枯病的发病程度差异较大。土质粘重易板结或土壤含沙量过高都易诱发病害。一般情况下，水田烟发病较轻，旱地烟发病较重，砂壤土发病较轻。通常地势高的烟地发病较轻，地势低的烟地发病较重，低洼积水处更重，田块的入水口或流水经过处也较重。青枯病菌主要在土壤中及遗落在土壤中的病残体上越冬，也能在各种生长着的寄主体内及根际越冬。种子一般是不带菌的。因此，青枯病菌的主要初侵染源是土壤、病残体和肥料。病菌靠流水、肥料、病苗、人、畜及生产工具带菌传播。人工操作和昆虫为害常使该病传播和入侵同时完成。在诸多因素中，带菌土壤是最重要的初侵染源。桥本光司(1986)对不同的土层生物鉴定研究表明，在225cm的土壤表层，青枯菌分布密度大，幼苗发病率高，累计发病株率为45%一66%， 25cm以下的土层病菌少，发病率低于18%。病田流水是病害再侵染和传播的重要方式。病组织腐烂后，病菌遗留在土壤中或粪肥中越冬，成为下年的初侵染源。1.3烟草青枯病的防治研究青枯病的防治长期以来都是许多学者探索的问题。1976年，在美国举行了第一届国际细菌性青枯病学术研讨会；1985年，在菲律宾又举行了亚太地区细菌性青枯病学术研讨会；1992年在中国台湾举行了亚洲细菌性青枯病学术研讨会；1997年，在法国举行了第二届国际细菌性青枯病学术研讨会31。各国植病工作者极为关注青枯病的研究，虽然在各领域中的研究结果对青枯病的防治均取得一定效果，但仍有不足之处。目前烟草青枯病仍然是生产上尚待解决的一大难题，人们仍难以单用一种方法从根本上解决烟草青枯病的问题。1.3.1抗病品种的利用从理论上讲，青枯病最根本的防治方法是培育和推广抗病品种32，国外已有这方面报道。20世纪70年代以来从事作物青枯病研究的专家和学者对作物品种抗性鉴定筛选工作十分重视，利用不同作物大量的品种资源，选取不同致病力的菌株，采用多种方法进行大量的抗性测定工作。郑继法等33研究了24个烟草品种对青枯菌的相对抗性水平，方差分析表明，只有少数品种间抗性水平有显著差异。根据不同接菌浓度下品种的抗性水平分析，相对抗性较强的品种有Nc95、Nc82和Oxfod26等；较感病的品种有青梗和Ky9两个品种，其余品种介于两者之间。周清明、匡传富、林海、潘建菁、巫升鑫等34-38对青枯病抗病品种筛选进行了大量的研究，结果发现没有免疫品种，只有少数几个品种表现抗病，多数为中感和高感品种。其中林海36的研究中，有4份抗病材料，且都是国外品种，即RG17、0X2028、RG8和SPGll7。在巫升鑫38的研究中发现迄今为止抗病谱广且能抗强菌系的种质资源，即G3、反帝3号和G6等3份，它们对青枯病I、II、III型菌系表现抗病至高抗(RLR)。但是，抗病育种依赖于品种资源的抗病性鉴定来提供抗源，而且青枯病菌为土藏病害，其腐生性较强，存在许多不同的生理小种，相比较之下青枯病的抗病育种工作就显得更为复杂和艰巨39。1.3.2农业防治（1）轮作 对于细菌性青枯病的防治，前人已做了大量的工作，提出的农业防治措施主要是轮作。轮作，曾是防治青枯病的有效措施，但是由于中国人多地少，耕地有限，此措施运用受到极大的限制，所以轮作措施也只是在局部地区起到部分的防治作用40。轮作是一种用地养地相结合的生物学措施。根据青枯病的特点可实行“稻稻烟”的轮作制度，旱地烟的轮作间隔年限至少3年，轮作作物最好选用禾本科作物及甘薯、大豆、豇豆、绿豆等，不与马铃薯、番茄、辣椒、茄子、花生、芝麻及姜类等作物轮作； 宜大面积连片种植烟叶。（2）培育和使用无病壮苗 选择地势平坦、背风向阳、交通方便、有清洁水源的地方作苗床地，前作不能为茄科作物。加强育苗场地与育苗物资消毒，育苗用水必须是清洁水，日常管理注重消毒措施和操作卫生，在苗棚入口处和育苗棚四周要覆盖防虫网以防烟蚜； 老病烟区尽量早播早栽，移栽时避免伤害根系。（3）均衡营养 营养是烟株生长发育的基础，生产上提倡平衡施肥，适当增施磷钾肥，氮肥应尽量使用硝态氮肥，在缺硼的烟田适当追施硼肥，多施有机肥。对于发病重的烟田，可施偏心肥，大田普遍发病时，对发病烟株施速效氮肥，以促其开片，也可用1的尿素喷施。（4）农事操作 多雨的地区，提倡高起垄、高培土技术；雨季做到烟田无积水，健全排灌系统，防止串灌和雨水串流，以减少病原在田间扩散传播。烟田残留物必须带出田间，田间发现病株及时拔除后用生石灰消毒病穴。（5）微生态调节 微生态调节将生态学原理应用于病害的防治，是一种病害防治的新思维、新途径。合理施用有机肥或将有机肥与生物防治、拮抗菌应用相结合，可改善和修复土壤生态环境，提高土壤和烟株自身抗御病害的能力，减少肥料和化学农药使用，改善烟叶品质和实现烟叶生产的可持续发展。张永春等41的研究表明，使用堆沤圈肥的土壤对青枯病的发生具有一定的抑制作用，可推迟其始发病期，降低发病程度。陈态42利用小区试验验证烟草专用多抗生物有机肥对烟草黑胫病、青枯病等病害的防治效果、产值和产量的影响，结果表明，植株抗性得到增强，病害发生率降低，尤其是2D多抗生物有机肥配方效果较为显著。生产上常用的微生态调节方法是在酸性土壤中施石灰，根据pH值，每667 m2用量50 kg左右。1.3.3生物防治近年来青枯病的生物防治越来越引起国内外的重视43。用于青枯病生物防治的因子主要集中于弱毒力的青枯假单孢杆菌44、链霉菌45、假单胞杆菌46、菌根真菌和芽孢杆菌47。目前，对青枯菌有拮抗作用的微生物主要有芽孢多粘菌(Bacillus polymyxa)、荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)和芽孢杆菌方面的拮抗菌，国内外有不少用这些拮抗菌防治细菌青枯病取得不同程度的成功的例子，如弱毒力青枯假单孢杆菌的利用(任欣正等，1987)、荧光假单孢杆菌46以及芽孢杆菌的利用48,49。尽管如此，青枯菌的生物防治还不能适应生产需要，青枯病生防菌仍处于研究阶段，防治效果不稳定50。1.3.4化学防治在化学防治上，许多研究者筛选出不少对青枯病菌有较好抑制作用的药剂51。陈永惠52经室内毒力测定，田间小区试验和大面积示范试验，参试的12种药剂中，90%乙霜青可湿性粉剂防治青枯病的效果较好，小区试验防治效果，1 000倍液为53.65%77.51%，1 500倍为50.63%59.49%，大田在1 500倍两次用药条件下，各地的平均防效达64.78%89.19%；卢洪兴等53,54的研究也表明，90%乙霜青可溶性粉剂防治烟草青枯病效果显著，好于1 000万单位硫酸链霉素，其防治效果可达80%以上；孔凡玉55等在19992000年进行了20%青枯灵可湿性粉剂400倍、60倍、800倍3个处理防治烟草青枯病药效试验，结果表明，400倍、600倍两个处理平均防效在62.1%81.5%，每公顷可挽回经济损失1 740元以上。近年来有的试验表明，用50%DT杀菌剂200400倍液和叶枯净300倍液灌根也有较好的防治效果。国外广泛采用杀线虫剂或多用途熏蒸剂处理土壤，可杀死线虫和多种病原菌，以减少根的伤口和病菌的侵染机会。1.3.5施用抗性诱导剂抗性诱导是一种利用植物自身抗性资源的措施，具有多抗、高抗和安全等优点，是现代植物病害防治的一条重要途径。Harrison等56在烟草根部接种青枯病菌的死菌来诱发植物体的抗性，诱导后的植株显示出了对青枯病菌的强烈抑菌作用。陈泽鹏等57利用50g/mL的苯并噻二唑诱导烟株抗性，离体和活体诱导抗病效率分别为60.96%和52.76%，且其自身对病原菌无抑制作用。1.3.6转基因植物的利用近年来，国内外分子生物学技术的迅速发展为青枯病的防治开拓了新的途径，将与抗病有关的其他一些基因转入寄主植物中而产生防病效果已有成功的例子 (郭坚华等，1997；朱圣杰等，2003)。荷兰Floraek等(1995)将可抑制R.solanaeearum的抗菌肽cecropin B转入烟草植株，并成功地得到了mRNA水平上的表达。但是植株体内可检测的cecropin B蛋白水平和对青枯病的抗性并未提高，很可能是由于cecropin B被植物内生蛋白酶降解的原因。美国路易斯安那州立大学Jaynes等(1993)将cecropinB的类似物shival的基因转入烟草植株，发现此植株的子代在接种了强毒性R.solanacearum后能够比对照推迟显症，降低发病程度和死亡率。中国农科院生物技术中心贾士荣等(Jiaeral，1993)将cecropin B和shival基因成功地转入马铃薯叶碟和薯块，转基因植物对中国R.solanaceaom优势小种3的野生型或强毒株表现出抗性。傅荣昭等(1998)研究发现兔防御素NP-1基因在转基因烟草植株中同样增强了烟草对青枯病的抗性并推迟了烟草青枯病的发病期。李乃坚等(1998)应用花粉管通道技术将天蚕抗菌肽B基因转入烟草子房，经多世代接种青枯菌鉴定及各项检测表明，抗菌肽B基因已整合到烟草基因组并传递到后代中，田间发病率和病情指数分析显示T3、T4代转基因株系抗青枯病能力有明显提高。陈艳等(2003)通过PcR从芡属植物千穗谷的总DNA中扩增出觅菜抗菌肤(Ah-AMP)的核基因片段，通过根癌土壤杆菌介导方法转入了烟草，提高了烟草的抗病性。张景宁等(1995)研究报道柞蚕杀菌肤D能迅速将青枯菌菌体包围，作用于细胞膜，造成许多小孔并进入胞内，而后损坏的小孔形成喇叭口，细胞内含物由此泄出胞外，导致菌体变成空囊而死亡。在此基础上，他们将产生柞蚕杀菌肤D的基因导入按树，并获得了转基因植株提高了按树对青枯病的抗病力。田长恩等(2000)用花粉管通道法将柞蚕抗菌肤D基因导入番茄，得到了具有较强青枯病抗性的转基因后代。利用转基因植物进行防病增产应用，尽管在安全性方面还有许多争议，而且要想通过这种方法最终达到目的还需经过很长一段时间的努力，但它仍不失为一条极有希望的防病途径，值得探索。综合目前各国防治研究的结果，要成功地控制烟草青枯病对烟草的为害，无论采用哪一种单一的防治方法都很难奏效，只有通过包括选用抗病品种、各项农业防治和化学防治的综合应用，一环扣一环，才能获得最佳的防治效果。1.4蜂胶蜂胶是蜜蜂从植物芽孢或树干上采集的树脂（树胶），混入其上腭腺、蜡腺的分泌物加工而成的一种具有芳香气味的胶状固体物。1.4.1蜂胶特性蜂胶是蜜蜂用于维持整个群体健康的有效物质，一个56万只的蜂群一年只能生产蜂胶70110克，被誉为“紫色黄金”。蜂胶生产期多为夏、秋季，我国的胶源植物大致有桦木科、杨柳科、松科、柏科和漆树科中的多数树种，以及桃、李、杏、栗、橡胶、桉树和向日葵等。蜂胶为不透明固体，表面光滑或粗糙，折断面呈砂粒状，切面与大理石外形相似。呈黄褐色、棕褐色、灰褐色、灰绿色、暗绿色，极少数深似黑色。具有令人喜爱的特殊的芳香味。味微苦，略带辛辣味，嚼之粘牙，用手搓捏能软化。温度低于15时变硬、变脆、易粉碎；36时质软、有粘性和可塑性；温度达6070时熔化成为粘稠流体，并分离出蜂蜡。比重随不同植物种类而异，一般在1.1121.136之间。不溶于水，微溶于松节油，部分溶于乙醇，极易溶于乙醚和氯仿。溶于95%乙醇中呈透明的栗色，并有颗粒状沉淀。纯蜂胶不应有其它杂质。1.4.2蜂胶的主要化学成分及差异性58,59天然蜂胶的基本成分一般是：树脂树香复合物3953、多酚类1217、多糖类23，蜂蜡1935、杂质（含花粉等）812。各类蜂胶中已知的化学成分达300余种。主要包括高良姜素、乔松素等71种黄酮类化合物，肉桂酸、咖啡酸、阿魏酸等59种芳香酸与芳香酸酯类化合物，肉桂醇等24种酚类、醇类和17种醛与酮类化合物，25种氨基酸，50种脂肪酸与脂肪酸酯，19种萜类化合物，6种甾体化合物，9种糖类化合物，25种烃类化合物等。同时，蜂胶中含有微量的维生素B族以及丰富的矿物质与微量元素。由于蜂胶的产生受所处产地的地理环境因素影响很大，因此，来自于不同产地的蜂胶品种，在化学成分组成上也存在着细微的差异。例如：根据董捷59等的研究报道，在智利蜂胶、巴西蜂胶、埃及蜂胶、新西兰蜂胶和索拉纳沙漠地区蜂胶中，都检出了各不相同的新化学成分。陈嘉南、黄中洋等人研究了台湾蜂胶的化学成分组成，发现台湾绿蜂胶的化学组成与其它地区产蜂胶的化学组成不同，目前已分离出10种具活性的蜂胶素（propolins），它们属于prenylflavanones类的化合物，其中有6种是新的化合物。1.4.3蜂胶中的主要活性物质蜂胶是自然界中总酚含量最多的天然产物之一，其含量高出蔬菜、水果、植物药材的几万倍至几百万倍。它们作为蜂胶的主要活性成分发挥着重要的生理功效。蜂胶中的酚类化合物，主要包括黄酮类化合物、酚酸类化合物以及它们的缩合体。随着色谱、光谱等高效的分离分析技术的不断发展，不同地域蜂胶中新的酚类化合物组成和结构逐渐被分析鉴定出来。1.4.4蜂胶中主要活性物质的功能近年来，对于蜂胶的活性物质的功能研究较多，相关研究成果也很丰富。特别是对于蜂胶中黄酮类化合物的功能研究成果较为集中。根据陈国有60等人的研究总结，蜂胶中的黄酮类化合物的生物活性主要有以下几方面。（1）对心血管系统的作用；（2）抗肝脏毒性作用；（3）抗炎作用及提高机体免疫力；（4）雌激素样作用；（5）抗菌及抗病毒作用；（6）清除自由基、抗氧化作用；（7）其他，包括止咳、祛痰、平喘以及中枢神经调节等作用。桑慧61、徐颖62等人着重研究了黄酮类化合物在抗氧化和清除自由基方面的作用机理与效果，研究表明，蜂胶中黄酮类化合物在抗氧化和清除自由基方面的作用效果明显，优于银杏黄酮，更加优于VC，是一种良好的抗氧化剂和自由基清除剂，故蜂胶对于自由基和脂质过氧化引起的多种疾病都有较好的治疗作用。卢兆芸63、孟日增64、许合金65、赵强66、Lucrecia L. Chaillou67等人分别研究了蜂胶黄酮类化合物在食品保鲜、抗菌，畜牧业中的应用，以及蜂胶中挥发油的抗氧化活性，并阐述了相关机理。这些研究开拓了蜂胶活性物质的应用领域，也大大提升了蜂胶应用的前景，而其中的一些理论基础也为后续研究提供了参考与借鉴。1.4.5蜂胶的应用在食品工业上，为了使产品有一定的贮藏期，需要添加防腐剂，常使用的化学防腐剂有苯甲酸钠、尼泊金等，它们往往对食品的口味和人体健康产生不利的影响，而以蜂胶为原料制作的保鲜防腐剂，具有独特的优点：一是纯天然物质，对人体无毒无任何毒副作用，可以放心的应用于食品、饮料上；二是蜂胶中含有人体所必需的维生素、氨基酸、微量元素，有补充营养，促进健康的作用；三是蜂胶具有很强的杀菌能力，能抑制多种霉菌和微生物毒素。宋心仿、邵有全研究发现，以蜂胶为主料制成保鲜剂用作果蔬和鸡蛋保鲜，可先将药液与清水配兑成一定浓度的乳浊液，采用喷洒或浸渍方法处理被保鲜物，使其表面形成一层被膜，可有效的灭杀或抑制霉菌等微生物的侵袭，调节果蔬和鸡蛋的新陈代谢，防止水份散失，延长了保鲜期。试验组与对照组相比较，苹果减少烂果率7.94%和6.06%，失重率降低13.88%和11.00%；西红柿减少烂果率62.09%和59.68%，失重率降低51.55%和50.33%；菜椒减少烂果率12.07%和6.27%，失重率降低25.95%和12.22%。鸡蛋试验组在60天时大部分还比较完好，而对照组则全部散黄，有的变臭，不能食用。汤凤霞、高飞云68等用蜂胶乙醇提取液处理的鲜肉保藏期明显延长，且高浓度组比低浓度组效果显著。此外，由于蜂胶含有多种活性成分，具有增强人体免疫、抗菌、抗肿瘤等特性，可作为保健品开发。蜂胶可作为畜禽的饲料添加剂。云南农业大学的研究者将蜂胶制剂按0.1%的比例作为添加剂加人到饲料中去，结果试验组的平均体重比对照组提高12.4%，每增重1公斤，比对照组饲料消耗降低巧76%。利用蜂胶作为饲料添加剂，不但能使畜禽增重，提高畜禽的肉质，还对畜禽健康生长有所保证。因为蜂胶中具有抗多种病原微生物的作用，能有效地预防畜禽可能发生的许多疾病，减少饲料管理中的麻烦。蜂胶很早作为木本植物嫁接时用的翁合剂。云南动物研究所等单位用95%的乙醇提取液(含蜂胶0.2%一2%)施用于稻瘟病菌、白叶粘病菌、棉花枯萎病菌、玉米茎病菌等病菌，表现了强烈的抑制作用。捷克斯洛伐克在温室内用10%蜂胶乙醇防治黄瓜花叶病、烟草斑点病和烟草坏死病都取得一定效果，使烟草坏死等有害病毒损害降低20%一50%。利用蜂胶能保护皮肤湿润、防治皮肤教裂、控制冻伤的功能，用羊毛脂乳化成软膏，可制成“蜂胶护肤灵”；利用蜂胶抗菌抗病毒的作用和有软化骨质组织，并能自然脱落之功能，可用高脂肪醇等为基础原料，乳化制成“营养雪花膏”，其作用在于保护皮肤柔润、光泽、除疵去斑、防粉刺和皮肤炎症；利用蜂胶能杀菌止痒、且无刺激、无异味的特点，可配制于花露水中，成为“蜂胶花露水”，其效用可以提高花露水的清洁功能，达到消炎去痒、杀菌除癣和防治蚊虫叮咬，消除疮疖肿痛；利用蜂胶有很强的杀菌功能，可有效地控制皮肤表面微生物的生长繁殖，并能清除皮肤表面污垢，使皮肤失去生成扉子的条件，可以制作成“蜂胶痒子水”。蜂胶在紫外线UVB和UVC范围内均有良好的吸收性能，能吸收和降低致红斑紫外光的辐射，则其可做成天然防晒剂。此外，由于皮肤上的分泌物，即不饱和脂肪酸的双键易氧化，引起体臭，而蜂胶中的类黄酮能够吸收氧自由基，有良好的抗氧化性，可应用于皮肤保健卫生方面，如皮肤净洗剂，以保护皮肤；还可利用蜂胶对牙周致病菌的抑菌作用，做成蜂胶牙膏。蜂胶具有广谱抗菌作用，能治疗内外科的多种疾病，且久服无副作用。临床证实，对A型流感病毒、牛痘病毒、疹疙病毒等有灭活作用；对多种病原虫及白喉杆菌、破伤风杆菌、恶性水肿杆菌外毒素有理想的中和作用。我国一些大中医院把蜂胶药品用于临床，均显示出良好效果。解放军广州医学高校、上海第一医院等把蜂胶制剂用于细菌性炎症、真菌性皮肤病、白色念珠菌、抱子菌等引起的疾病，均表现出良好的效果。尤其令人可喜的是蜂胶制剂用于治疗癌症，已显示出很好的疗效。日本国防医学研究所松野哲也先生用蜂胶提纯液作肝癌细胞培养，7h后显示出病变作用，72h后癌细胞死亡。蜂胶作为一种具有广泛应用前景的天然保健物质，其生物活性正越来越被人所重视。特别是近几年来，关于蜂胶的成分、提取工艺以及分析检测方法等方面的研究成果很多，这为我们进一步认识蜂胶、利用蜂胶打下了良好的科学理论基础。1.5绿色有机烟草1972年，国际上一个致力于拯救农业生态环境、促进健康安全食品的组织国际有机农业运动联合会( 简称IFOAM) 应运而生。IFOAM所倡导的有机农业是一种农业发展的高级阶段，它将农业经济系统纳入到了自然生态系统的物质循环过程中。有机农业是遵照一定的有机农业生产标准，在生产中不采用基因工程获得的生物及其产物，不使用化学合成的农药、化肥、生长调节剂等物质，遵循自然规律和生态学原理，采取一系列可持续发展的农业技术，协调种植业和畜牧业的关系，促进生态平衡，保护生物多样性和资源可持续利用的农业生产体系。有机农业生产三要素中社会、经济和环境三者并不排斥，而是战略性和理性的整合69,70。发展有机农业的好处有很多，可减少对环境的压力，有利于生态环境的恢复：可以减少化肥、农药的使用，减轻环境的污染，从而提高农产品的质量，保障农产品的安全性；发展有机农业生产模式可以增加就业岗位，解决农村劳动力就业问题；有机农产品符合国际市场需求：增加出口可以给农民带来良好的经济效益，并且在缓解气候变化、发展低碳农业经济方面具有极大的潜力71,72。我国加入WTO后，烟叶市场日趋国际化，国外烟叶已直接参与国内烟叶市场的竞争。国外烟叶质量好、安全性好，但其与国内烟叶价格相近，导致了我国烟叶进口数量逐年增加，由此在很大程度上影响了国内烟叶的生产。而且随着2