表观遗传、基因与基因组学.doc

第十三章 表观遗传学第一节 概 述一表观遗传学(epigenetic)：DNA的序列不发生变化、基因表达改变、并且这种改变可稳定遗传。二表观遗传学研究的内容： 1. 基因选择性转录、表达的调控。2. 基因转录后调控。(表观遗传通常被定义为DNA的序列不发生变化但是基因表达却发生了可遗传的改变，也就是说基因型未变化而表型却发生了改变，这种变化是细胞内除了遗传信息以外的其他可遗传物质的改变，并且这种改变在发育和细胞增殖的过程中能稳定的传递下去。表观遗传学研究内容具体来说主要包括DNA甲基化表观遗传、染色质表观遗传、表观遗传基因表达调控、表观遗传基因沉默、细菌的限制性基因修饰等。从更加广泛的意义上来说，DNA甲基化、组蛋白甲基化和乙酰化、基因沉默、基因组印记、染色质重塑、RNA剪接、RNA编辑、RNA干扰、x染色体失活等等都可以归入表观遗传学的范畴，而其中任何一个过程的异常都将影响基因结构以及基因表达，导致某些复杂综合症、多因素疾病或癌症。)三表观遗传修饰从多个水平上调控基因表达： 1.RNA水平：非编码RNA可通过某些机制实现对基因转录以及转录后的调控，例如microRNA、RNA干扰等2.蛋白质水平：通过对蛋白质的修饰或改变其构象实现对基因表达的调控，例如组蛋白修饰3.染色质水平：通过染色质位置、结构的变化实现对基因表达的调控，例如染色质重塑以上几个水平之间相互关联，任何一方面的异常都将影响染色质结构和基因表达。四表观遗传学的研究意义：1. 表观遗传学补充了“中心法则”所忽略的两个问题，即哪些因素决定了基因的正常转录和翻译以及核酸并不是存储遗传信息的唯一载体。2. 表观遗传信息可以通过控制基因的表达时间、空间和方式来调控各种生理反应。所以许多用DNA序列不能解释的现象都能够找到答案。3. 与DNA序列的改变不同，许多表观遗传的改变是可逆的，这使表观遗传疾病的治愈成为可能。第二节 表观遗传修饰一.DNA甲基化(DNA methylation)DNA甲基化是目前研究得最清楚、也是最重要的表观遗传修饰形式。通过甲基供体S-腺苷甲硫氨酸，并在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的催化下，CpG二核苷酸中的胞嘧啶环上5位置的氢被活性甲基所取代，从而转变成5-甲基胞嘧啶(5-mC) 。DNA复制后甲基化型的维持 胞嘧啶甲基化反应真核生物中存在两种甲基转移酶：一种起维持甲基化的作用，主要是甲基转移酶1（DNMT 1），在模板链的指导下，它能使半甲基化的DNA双链分子上与甲基胞嘧啶相对应的胞嘧啶甲基化；另一种起形成甲基化的作用，主要是甲基转移酶3a和3b（DNMT 3a、DNMT 3b），它们能在未发生甲基化的DNA双链上进行甲基化，并且该过程不需要模板链的指导。图：CpG岛（CpG island）在某些区域CpG序列的密度比平均密度高出许多，其长度大于200个碱基，这些区域命名为CpG岛。CpG岛位于基因上游调控区的启动子，这些基因为管家基因或组织特异表达基因。 图：甲基化抑制基因的表达(一般而言，DNA甲基化会抑制基因的表达。发生在基因启动子或其附近区域的甲基化将直接阻碍转录因子与启动子结合，使基因不能转录或降低基因的转录水平。同时，基因5端的调控元件发生甲基化后能结合特定甲基化CpG序列结合蛋白（methyl CpG binding protein，MBP），从而间接阻止转录因子与启动子形成转录复合体。甲基化还能改变染色质的构象，使染色质凝缩成非活性的高级结构。) DNA甲基化基因沉默(gene silence) 非甲基化(non-methylation)基因活化(gene activation) 去甲基化(demethylation)沉默基因的重新激活（reactivation）DNA高甲基化：基因启动子区的CpG岛在正常状态下一般是非甲基化的，当发生甲基化时，基因转录沉寂，使一些重要基因如抑癌基因、DNA修复基因等丧失功能，从而导致正常细胞的生长分化调控失常以及DNA损伤不能被及时修复，这与多种肿瘤形成密切相关。DNA低甲基化：整个基因组普遍低甲基化，这种广泛的低甲基化会造成基因的不稳定，这与多种肿瘤的发生有关。DNA的低甲基化也可能在异常组蛋白修饰的协同下引起某些T细胞基因的异常活化、导致自身免疫性疾病的发生。整个基因组中普遍存在着低甲基化，主要发生在DNA重复序列中，如微卫星DNA、长散步元件(LINES)、中度重复顺序Alu顺序等。二 组蛋白修饰DNA以染色质的形式存在，染色质通常由DNA、组蛋白、非组蛋白以及少量RNA包装而成，其中组蛋白是染色质的基本结构蛋白。 组蛋白的N-末端可通过共价作用从而发生乙酰化、甲基化、泛素化以及磷酸化等翻译后的修饰，这些修饰的信息构成了丰富的组蛋白密码，其中乙酰化和甲基化是最为重要的修饰方式。组蛋白乙酰化：是由组蛋白乙酰基转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰基酶(HDAC)协调催化完成，修饰的部位一般位于N-末端保守的赖氨酸残基上。组蛋白乙酰化是一个可逆的动力学过程，可以调节基因的转录。组蛋白甲基化：组蛋白甲基化多发生于组蛋白H3、H4的赖氨酸和精氨酸残基上，由特异的组蛋白赖氨酸甲基转移酶(histone methyltransferase, HMT)催化完成，也是一个可调控的动态修饰过程。而组蛋白的去甲基化是由赖氨酸去甲基酶(lysine-specific demethylase 1, LSD1)催化完成。组蛋白的其他修饰：组蛋白泛素化由E1、E2、E3级联酶催化修饰，也是一个可逆的动力学过程。 所有组蛋白的组分均能磷酸化。 组蛋白的各种修饰不是相互独立的，而是互相联系的，例如H3-Serl0的磷酸化可以促进H3-K14乙酰化，而H3-K9的甲基化则会阻止H3-Serl0的磷酸化。三染色质重塑(remodeling) 染色质重塑是指染色质位置、结构的变化，主要包括紧缩的染色质在核小体连接处发生松动造成染色质的解压缩，从而暴露了基因转录启动子区中的顺式作用元件，为反式作用因子的结合提供了可能。染色质重塑与基因转录染色体重塑的过程由两类结构所介导：ATP依赖型的核小体重塑复合体和组蛋白共价修饰复合体。前者通过水解的作用改变核小体构型；后者则对核心组蛋白N-末端尾部的共价修饰进行催化。这种修饰直接影响核小体的结构，并为其他蛋白提供了和DNA作用的结合位点四非编码RNA调控(ncRNA) 功能性非编码RNA在表观遗传修饰中发挥极其重要的作用。ncRNA按照大小可分为两类：长链非编码RNA和短链非编码RNA。 长链非编码RNA在基因簇乃至于整个染色体水平上发挥顺式调节作用，短链RNA在基因组水平对基因的表达进行调控。1)长链非编码RNA X染色体的失活就是长链ncRNA所介导的甲基化和组蛋白修饰共同参与的一个复杂的过程。x染色体上的失活基因编码出相应RNA，这些RNA包裹在x染色体上，达到某一水平后，在甲基化和组蛋白修饰的参与下共同导致并维持x染色体的失活。 此外长链ncRNA常在基因组中建立单等位基因表达模式，在核糖核蛋白复合物中充当催化中心，对染色质结构的改变发挥着重要的作用。2)短链非编码RNA短链非编码RNA(又称小RNA)能够介导mRNA的降解，诱导染色质结构的改变，决定着细胞的分化命运，还对外源的核酸序列有降解作用以保护本身的基因组。五不同表观遗传学修饰之间的相互调控:表观遗传修饰从多个水平上调控基因表达，而不同水平的调控之间也是相互关联的，任何一方面的异常都可能影响到其他水平的表观遗传修饰。事实上不同水平的表观遗传修饰在真核细胞中构成了一个完整的表观遗传调控网络。第三节 表观遗传疾病一.DNA甲基化与疾病 DNA甲基化与肿瘤肿瘤细胞中的DNA甲基化一般表现为总体的低甲基化水平和特定区域的高甲基化，这些变化可以同时发生在同一肿瘤组织内。基因总体甲基化水平降低导致染色体不稳定、DNA修复基因、细胞周期调控基因、细胞凋亡基因相应的CpG岛的甲基化沉默，进而促进了肿瘤细胞的形成。原癌基因(oncogene)：较低水平的原癌基因对于细胞的生长、发育、分化和信号传导都是必需的，当发生突变或基因异常表达时癌症就产生了。研究发现原癌基因通常在肿瘤新生物中呈现低甲基化状态。肿瘤抑制基因(tumor suppression gene)：肿瘤抑制基因的产物能够抑制细胞的生长，失去其功能将促进细胞的转化；与原癌基因在激活方式上的不同在于肿瘤抑制基因的激活必须有等位基因的两次突变或缺失。药物：叶酸和维生素B12都是甲基的供体，能影响甲基化的状态，主要是对全基因组甲基化上调的影响。环境因素：环境因素亦可影响肿瘤中基因的甲基化，从而间接的促进或影响肿瘤的发生。 DNA甲基化与自身免疫性疾病DNA甲基化的改变可以影响一些与黏附分子和细胞因子表达相关的基因，导致T细胞的自身反应性改变，因此对维持T细胞的功能至关重要。研究证实，没有维持DNA甲基化水平和模式的成熟T细胞，在体内、外均能发生自身反应性，因此表观遗传的失控可以引起自身免疫性疾病。系统性红斑狼疮(, SLE)、类风湿性关节炎(RA)、强直性脊柱炎(, AS)、系统性硬化症(SSc) DNA甲基化与衰老DNA:甲基化作为哺乳动物细胞基因组修饰和表达调控的后遗传方式，在细胞的衰老过程中总体水平下降，同时又伴随着某些基因的高甲基化。永生化细胞基因组的甲基化水平较高，因此甲基化水平过高又是肿瘤细胞的表现。目前年龄相关的甲基化已作为细胞生命历史的标签。 DNA甲基化与心血管疾病:心血管疾病被认为是受甲基化控制的人类重要疾病，对心血管疾病的DNA甲基化调控机制深入研究，有利于制定心血管疾病的有效防御策略，同时DNA甲基化的可逆性，为采用控制饮食及其他环境手段干预心血管疾病的进程提供了新的方法 DNA甲基化与精神疾病1972年Gottesman就将外遗传这一概念引入精神病遗传学研究。近些年当传统遗传研究在精神疾病的研究中困难重重时，外遗传与精神疾病尤其是DNA甲基化与精神分裂症的关系，引起了研究者的重视。虽然目前还处于假说阶段，但不少研究已提示DNA甲基化参与了精神分裂症的发生。二组蛋白修饰、染色质重塑与疾病染色质重塑复合物、组蛋白修饰酶的突变均与转录调控、DNA甲基化、DNA重组、细胞周期、DNA复制和修复的异常相关，这些异常可以引起生长发育畸形，智力发育迟缓，甚至导致癌症。三 基因组印记与疾病基因组印记是指来自父方和母方的等位基因在通过精子和卵子传递给子代时发生了修饰，使带有亲代印记的等位基因具有不同的表达特性，这种修饰常为DNA甲基化修饰，也包括组蛋白乙酰化、甲基化等修饰。四 。X染色体失活与疾病女性有两条X染色体，男性只有一条X染色体，为保持平衡，女性一条X染色体被永久失活“剂量补偿”效应。 X染色体随机失活是X失活中心(X inactivation center, Xic)调控的。 X染色体失活相关疾病多是由X染色体不对称失活使携带有突变等位基因的X染色体在多数细胞中具有活性所致。五非编码RNA与疾病ncRNA对细胞自身稳定和发育起着重要作用，而它们在肿瘤发生过程中的作用机制正在逐渐被认识。其中miRNA能够调控那些与发育、增殖、凋亡及应激反应相关基因的表达，而且它们的表达异常是人类恶性肿瘤的一个共同特征。第四节 表观遗传学研究技术人们对于表观遗传过程的关注程度日益增强，以DNA甲基化和组蛋白修饰为靶向的治疗方法也初露端倪；在表观遗传修饰分析技术发展的基础之上，我们可以进一步了解表观遗传过程的机制并设计出针对这一过程的治疗性干预手段。.DNA甲基化的检测 基因组整体水平的甲基化分析A高效液相色谱柱相关方法 B.SssI甲基转移酶法 C.氯乙醛法 基因特异位点的甲基化分析A甲基化敏感性限制性内切酶-PCR/Southern法 B直接测序法 C甲基化特异性的PCR法 D甲基化敏感性单核苷酸引物延伸法E结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法F甲基化敏感性单链构象分析G甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳H甲基化敏感性解链曲线分析IMethylight JDNA微阵列法 K.甲基化敏感性斑点分析 L. MS-MLPA 新甲基化位点的筛查A限制性标记基因组扫描B.MBD柱层法C.COMPARE-第三章 人类基因组学一.Human genome Projecto 1986年Dulbecco提出肿瘤问题有待人类基因组测序o 1991年人类基因组测序启动15年、30 亿美元 、3109 碱基对生物医学领域的阿波罗登月计划，遗传学革命o 2001年2月完成人类基因组94草图o 2004年10月人类基因组完成测序，覆盖了99的常染色质区域，错误率小于1/10 万二.人类基因组的结构特征：o 2万2.5 万个编码基因，不到线虫和果蝇的两倍o 许多特征在基因组上分布不均一：基因、转座子、GC含量、CpG 岛和重组率等o 大部分转座子活性明显下降，但是长散在核元件（LI