瑞舒伐他汀对乳鼠心脏成纤维细胞增殖和凋亡的影响.doc

KKME-专业医学搜索引擎/瑞舒伐他汀对乳鼠心脏成纤维细胞增殖和凋亡的影响作者：王倩 崔炜 张海林 李亚 作者单位：河北医科大学第二医院 河北省心脑血管病研究所心内科，河北 石家庄 050000 【摘要】目的 研究瑞舒伐他汀(Ros)对SD乳鼠心脏成纤维细胞(CFs)增殖的抑制作用，探讨其诱导CFs凋亡的作用机制。方法 采用新生SD大鼠CFs进行体外培养，单独给予10-5，10-6，10-7，10-8mol/L Ros或与10-5mol/L焦磷酸法尼酯(FPP)联合进行干预，应用MTT比色、BrdU比色、瑞氏吉姆萨染色倒置生物显微镜、Hochest 33258染色荧光显微镜、流式细胞分析技术等方法观察Ros对CFs增殖的抑制作用和其对CFs凋亡的诱导作用。结果 Ros不仅可明显抑制新生SD大鼠CFs增殖和DNA合成，且可诱导CFs凋亡。10-5mol/L FPP可部分逆转此作用。结论 Ros为有效的抗心脏纤维化药物，不仅可明显抑制纤维化进程，还可逆转已出现的纤维化。 【关键词】 大鼠;成纤维细胞;细胞增殖;凋亡;瑞舒伐他汀;焦磷酸法尼酯 他汀类药物因其安全可靠的降脂作用和心血管保护作用，在临床上广为应用。然而，目前他汀类药物的应用范围主要局限于高脂血症者及冠心病患者，对于心衰患者是否应用及其利弊一直存在着争议。本文主要观察新型降脂药瑞舒伐他汀(Ros)对SD乳鼠心脏成纤维细胞(CFs)的增殖抑制作用，和对CFs凋亡的诱导作用，为他汀类药物在心衰患者应用的可行性提供参考。 1 材料与方法 1.1 主要仪器及试剂 CO2培养箱(Heal Force);生物安全柜(Heal Force);倒置生物显微镜(Olympus 171);相机(Canon DS126181);倒置荧光显微镜(Nikon Ellipse TE2000S);酶标仪(Fluostar);离心机(Anke TDL802C);恒温振荡器(富华SHZ82);Ros(石药集团中奇制药技术有限公司，批号：20081201，规格：原料药);焦磷酸法尼酯(FPP)(瑞士Enzo life sciences公司);DMEMF12培养基(美国Gibco公司);胎牛血清(奥地利PAA);胰蛋白酶(美国Gibco公司);噻唑蓝(MTT)(美国Biosharp公司);二甲基亚砜(DMSO)(美国Amersco公司);溴脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)试剂盒(德国Roche公司);瑞氏吉姆萨染液(珠海贝索生物技术有限公司);细胞凋亡检测试剂盒(Hochest 33258，美国Biosharp公司)。 1.2 实验动物及CFs的培养和鉴定 取23天龄的SD大鼠(河北医科大学实验动物中心提供,许可证号：1001007)。无菌开胸，剪取心室，用DHanks液清洗，剪碎。0.125%胰蛋白酶+0.01%乙二胺四乙酸(EDTA)消化液反复消化，分别收集各次消化细胞悬液，加入10%胎牛血清的DMEMF12培养基，离心，弃上清液。再加10%胎牛血清的DMEMF12培养基，制成细胞悬液，置37、5% CO2培养箱内培养。根据CFs比心肌细胞贴壁速度快的特点，差速贴壁60 min，倾去上层未贴壁细胞，剩余的即为CFs，加入10%胎牛血清的DMEMF12培养液继续培养。经倒置显微镜观察，免疫组化波形蛋白单克隆抗体阳性，鉴定为所需要的CFs，细胞纯度达98%。待CFs生长接近融合时以12传代，实验用24代细胞。 1.3 实验分组 实验共分9组，空白对照组;10-5mol/L Ros组;10-6mol/L Ros组;10-7mol/L Ros组;10-8mol/L Ros组;10-5mol/L Ros+10-5 mol/L FPP组;10-6 mol/L Ros+10-5 mol/L FPP组;10-7 mol/L Ros+10-5 mol/L FPP组;10-8 mol/L Ros+10-5 mol/L FPP组。 1.4 MTT法测定细胞增殖 取对数生长期CFs 5107/L接种于96孔板中，37 、5% CO2及饱和湿度下培养24 h后，吸弃各孔培养基，分别加不同浓度的药物，继续培养24 h，每组设8个复孔。各组于药物刺激结束前4 h，每孔加入5 mg/ml MTT 10 l，37 继续培养4 h后终止培养，吸弃上清液，每孔加入150 l DMSO，振荡混匀，在酶标仪上选取490 nm波长测定吸光度值(A490值)。 1.5 BrdU法测定细胞DNA合成 取对数生长期CFs 5107/L接种于96孔板中，37 、5% CO2及饱和湿度下培养24 h后，吸弃各孔培养基，分别加不同浓度的药物，继续培养24 h，每组设8个复孔。严格按照Brdu试剂盒说明进行操作。各组于药物刺激结束前8 h，每孔加入BrdU标记液 10 l，37 继续培养8 h后终止培养，吸弃上清液，每孔加入固定液200 l，室温孵育30 min，彻底去除固定液，每孔加入抗BrdUPOD工作液100 l，室温孵育90 min，弃去抗BrdUPOD工作液，每孔用200 l洗脱液洗涤3遍，弃去洗脱液，每孔加入显色液100 l，室温孵育15 min，每孔加入1 mol/L H2SO4 25 l，摇床摇1 min，在酶联免疫检测仪上430 nm处测定吸光度值(A430值) 。 1.6 凋亡检测 1.6.1 瑞氏吉姆萨染色，倒置生物显微镜观察 取对数生长期CFs 1108/L接种于24孔板中，37、5% CO2及饱和湿度下培养24 h后，吸弃各孔培养基，分别加不同浓度的药物，继续培养24 h。吸弃各孔培养基，无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗1遍，滴加瑞氏吉姆萨A溶液，使染液覆盖各孔细胞，染色1 min，将瑞氏吉姆萨B溶液滴加于A液上面，以洗耳球轻吹液面，使两液充分混合，染色10 min，吸弃各孔染液，无菌PBS洗3遍，倒置显微镜观察，拍照。 1.6.2 Hochest 33258染色，荧光显微镜观察 将无菌的盖玻片置于24孔板内，以1108/L细胞接种，37、5% CO2及饱和湿度下培养24 h后，吸弃各孔培养基，分别加不同浓度的药物，继续培养24 h。吸弃各孔培养基，无菌PBS洗3遍，甲醇/冰醋酸(31)于4 固定 10 min，无菌PBS洗3遍，每孔加Hochest 33258染液(10 mg/L)500 l，避光染色30 min，荧光显微镜观察，拍照(激发波长340 nm，发射波长420 nm)。 1.6.3 流式细胞仪检测断裂DNA 取对数生长期CFs，分别加不同浓度的药物，继续培养24 h。收集培养的细胞，悬浮于4预冷的70%乙醇中。检测前用生理盐水洗涤细胞2次，调整细胞浓度为1109/L ，取200 l细胞悬液，加100 l核糖核酸酶(RNase) 37 中孵育15 min，加200 l碘化丙啶，室温下避光5 min，300目尼龙网过滤后，流式细胞仪检测亚二倍体率。 1.7 统计学分析 采用SPSS13.0软件，计量数据用xs表示。随机单因素方差分析LSD法进行组间的两两比较。 2 结 果 2.1 CFs增殖测定 对MTT测定结果进行单因素方差分析，10-510-7 mol/L的Ros与空白对照组相比，差异显著，即10-510-7 mol/L的Ros可抑制新生大鼠CFs增殖。10-8 mol/L的Ros与空白对照组相比差异不显著，即此浓度不能抑制新生大鼠CFs增殖。10-5 mol/L FPP可明显减轻各浓度Ros对CFs的抑制作用。见表1。 2.2 CFs DNA合成测定 对BrdU测定结果进行随机单因素方差分析，10-510-7 mol/L的Ros与空白对照组相比差异显著，即10-510-7 mol/L的Ros可抑制新生大鼠CFs DNA合成。 10-8 mol/L的Ros与空白对照组相比，差异不显著，即此浓度不能抑制新生大鼠CFs DNA合成。10-5 mol/L FPP可明显降低各浓度Ros对CFs DNA合成的抑制作用。见表1。表1 Ros对CFs增殖和DNA合成的影响(略) 2.3 瑞氏吉姆萨染色，倒置生物显微镜观察细胞 10-5 mol/L Ros处理组的CFs，死亡细胞数目较对照组明显增加。10-5mol/L Ros+10-5 mol/L FPP组死亡细胞数目明显减少，但仍多于对照组，即10-5mol/L FPP可部分逆转10-5mol/L Ros作用。见图1。 2.4 Hochest 33258染色观察细胞凋亡形态学变化 正常CFs Hochest 33258染色胞核形状规则;10-5 mol/L Ros组CFs Hochest 33258染色可见细胞凋亡的形态学改变：核固缩、核碎裂，出现大小不一碎片及凋亡小体;10-5mol/L Ros +10-5mol/L FPP组CFs Hochest 33258染色，异常胞核明显少于10-5 mol/L Ros组。见图2。 2.5 流式细胞仪检测结果 10-510-7 mol/L Ros组细胞有亚二倍体峰出现，随药物浓度增加，CFs凋亡率增加。10-5 mol/L FPP可明显抑制CFs凋亡，降低CFs凋亡率。见表2。表2 Ros对CFs凋亡的影响(略) 3 讨论 他汀类药物除了降脂外，尚有改善血管内皮功能，抑制血管平滑肌增殖，抑制心脏纤维化，抗炎，抗栓，抑制血小板聚集，降压，抗心律失常，调节免疫，抑制肿瘤等与降脂无关的作用。其共同的机制在于他汀类药物可通过抑制羟甲基戊二酰辅酶A(HMGCoA)向 L甲羟戊酸的转变，进而抑制重要的类异戊二烯——FPP和牛儿基牛儿基焦磷酸(GGPP)的合成。这两种焦磷酸酯是许多蛋白翻译后修饰的重要脂质载体。异戊二烯化多发生在C末端包含CaaX基序的蛋白(C为半胱氨酸，a为一脂肪族氨基酸，X为任意氨基酸)，Ras 和 Rho GTP 酶家族成员就属此类蛋白。异戊二烯化的小G蛋白可以锚定于细胞膜上调节细胞骨架伸缩和胞内信号转导。 由于他汀类药物可通过抑制小G蛋白抑制细胞增殖的信号转导通路，国内外许多学者将他汀类药与抗肿瘤药联用，减少化疗药物抵抗，抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，改善肿瘤患者的生活质量。Aberg等1的研究表明辛伐他汀可以通过抑制核转录因子(NFB)通路，诱导乳腺癌细胞凋亡。Sutter等2的研究也表明他汀可以使肝癌细胞发生细胞周期阻滞和凋亡。Ahn等3研究发现，他汀类药物可以通过抑制肿瘤坏死因子(TNF)诱导的NFB表达，降低髓细胞性白血病细胞对化疗药物的抵抗，并增加白血病细胞的凋亡。结果提示，他汀类药物可能具有某些化疗药物的特性，即抑制可增殖细胞存活，并诱导其凋亡。 无论何种原因导致的心衰进程中，均伴有心脏CFs增殖和心肌重构，抑制心脏内的CFs增殖对于改善心功能有益。许多国内外研究均证实，他汀类药物可以抑制心脏纤维化，改善心脏舒张功能，延缓心衰进程，且无不良反应47。 本文体外实验结果表明，Ros不但可以抑制CFs增殖，而且可以诱导CFs凋亡，借此推断他汀类药物不仅可以抑制心脏纤维化进展，还可能逆转已经发生的纤维化，这对于心衰患者，尤其早期心衰患者是有益的。 【参考文献】 1 Aberg M，Wickstrom M，Siegbahn A.Simvastatin induces apoptosis in human breast cancer cells in a NF kappaBdependent manner and abolishes the antiapoptotic signaling of TF/FVIIa and TF/FVIIa/FXaJ.Thromb Res，2008;122(2):191202. 2 Sutter AP，Maaser K，Hopfner M,et al.Cell cycle arrest and apoptosis induction in hepatocellular carcinoma cells by HMGCoA reductase inhibitors.Synergistic antiproliferative action with ligands of the peripheral benzodiazepine receptorJ.J Hepatol，2005;43(3):80816. 3 Ahn KS，Sethi G，Aggarwal BB.Reversal of chemoresistance and enhancement of apoptosis by statins through downregulation of the NFkappaB pathwayJ.Biochem Pharmacol，2008;75(4):90713. 4 Chang SA，Kim YJ，Lee HW,et al.Effect of rosuvastatin on cardiac remodeling，function，and progression to heart failure in hypertensive heart with established left ventr