毕业论文——柠檬酸钠修饰的纳米硒抗氧化活性测定

JIANGXI AGRICULTURAL UNIVERSITY本 科 毕 业 论 文题 目：柠檬酸钠修饰的纳米硒抗氧化活性测定学 院： 食品科学与工程学院 姓 名： 学 号： 专 业： 班 级： 食安 指导教师： 职 称： 二O一七 年 五 月目录摘 要IAbstractII1 绪论12 抗氧化性的测定22.1 材料和方法22.1.1 试剂22.1.2 仪器22.1.3 实验方法22.2 实验结果52.2.1 清除羟基自由基52.2.2 清除超氧阴离子自由基52.2.3 清除DPPH自由基62.2.4 还原力测定72.3 实验小结8参考文献9致谢11柠檬酸钠修饰的纳米硒抗氧化活性测定摘 要抗氧化剂能够清除人体内的自由基而具有延缓衰老、预防疾病的作用。因此，筛选高效、稳定、低毒的抗氧化剂具有极其重要的意义。本试验选用柠檬酸钠修饰的纳米硒（CitSeNPs）为研究对象，利用邻苯三酚自氧化法、清除羟基自由基法、DPPH自由基法、总还原力法测定CitSeNPs溶胶的抗氧化性。结果显示CitSeNPs具有很强的清除自由基的能力，其清除能力与浓度呈正相关。其中，CitSeNPs清除羟基自由基的能力明显大于抗坏血酸；当浓度大于0.4 mg/mL时，CitSeNPs清除超氧阴离子自由基的能力强于抗坏血酸。说明CitSeNPs有望成为一种高活性的纳米材料类抗氧化剂。关键词 ： 纳米硒；柠檬酸钠；抗坏血酸；抗氧化性IAbstractAntioxidants can remove free radicals in the human body and have the effect of deferringorganism aging andpreventingdiseases. Therefore, screening efficient, stable, and low toxicity antioxidants has an extremely important significance. In this study, sodium citrate which modified nano-selenium was used as the object of study. The pyreparens self-oxidation method, the hydroxyl radical scavenging method, the DPPH radical method and the total reducing force method were used to determine the antioxidant activity. The results showed that Cit SeNPs had a strong ability to scavenge free radicals, and their scavenging ability was positively correlated with the liquid concentration. The ability of Cit SeNPs to scavenge hydroxyl radicals was significantly higher than that of ascorbic acid. When the concentration was over 0.4 mg/mL, Cit SeNPs has a stronger ability of scavenging superoxide anion radicals than ascorbic acid. All of these results prove that Cit SeNPs is expected to be a kind of highly active antioxidant of nanometers material.Key words : nano-selenium ; sodium citrate ; ascorbic acid ; oxidative stabilityII1 绪论人体在日常代谢过程中会不断产生自由基，包括羟基自由基(OH)、过氧化自由基和超氧阴离子自由基(O2-)等1。这些自由基会造成氧化性的损伤，破坏人体各个器官的正常功能。通过维持各游离自由基在体内的平衡，能有效预防机体细胞免疫力下降、细胞衰老、心血管病变、细胞癌变等众多疾病2。因此，适量摄入一些具有抗氧化活性的保健品和药品有利于增强机体的抗氧化能力3-4 。当今市面上常见的抗氧化剂有:丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、特丁基对苯二酚（TBHQ）等。但是，这些抗氧化剂热稳定性差、抗氧化效率较低、有效浓度范围比较狭窄，寻找一种高效低毒的抗氧化剂成为目前亟待解决的问题。硒是人体必不可少的微量元素，与人体内多种酶的作用密切相关，在生命过程中起着极其重要的作用。硒制品（如硒旺胶囊）在保健食品和医药品中占有重要的地位。夏弈明教授在2009年的中国硒资源开发与利用研讨会（恩施）上指出：目前硒的摄入量标准是根据满足谷胱甘肽过氧化物酶的活性而制定的，要想真正满足对硒的活性需求，人体还是要靠硒营养品的摄入。然而，作为国际四大抗氧化剂的硒抗氧化效果强，但营养剂量和毒性之间范围比较窄。纳米硒的出现，解决了硒元素的这一应用难题。纳米硒既没有破坏硒元素在人体内的活性，又确保了硒的高安全性。硒旺胶囊的问世，实现了纳米硒在人体当中的应用。为了筛选出具有抗氧化活性的纳米硒，进一步实现纳米硒作为抗氧化剂的应用，本实验选用以柠檬酸钠修饰的CitSeNPs溶胶作为研究对象5-6，通过清除羟基自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基的能力、还原力测定这四种方法来评价其抗氧化能力。2 抗氧化性的测定2.1 材料和方法2.1.1 试剂2.1.2 仪器仪器生产厂家FA2104型电子天平奥豪斯国际贸易（上海）有限公司分光光度计上海元析仪器有限公司JW-1042低速离心机上海安亭科学仪器厂超声波清洗机宁波新芝生物科技股份有限公司数显恒温搅拌循环水箱常州国华电器有限公司2.1.3 实验方法（1）羟基自由基清除能力的测定1）原理：Fe2+与H2O2反应生成羟基自由基（OH），由于OH化学性质很活跃，存在的时间短，水杨酸可作为OH捕捉剂，水杨酸与被捕获的羟基自由基反应生成两种有色的物质。通过测定这两种羟基化合物在510 nm处的吸光度，可以间接得出样品清除羟基自由基能力的强弱7-9。2）方法：借鉴Zhong等人的方法10。测定前用蒸馏水将放置在冰箱中保存的3 mg/mL的CitSeNPs溶液稀释成不同浓度:分别为0.025 mg/mL、0.05 mg/mL、0.10mg/mL、0.20 mg/mL、0.40 mg/mL。各取1.0 mL上述配好的样液于5支试管中，按照先后顺序加入6 mmol/L的FeSO4 1.0 mL、 6 mmol/L的H2O2 1.0 mL，混匀后静放10 min。再加入6 mmol/L的水杨酸溶液1.0 mL，混匀后静置30 min，最后在510 nm处测其吸光度值Ai。其他处理一样的情况下，把1.0 mL的水杨酸换成蒸馏水，测得吸光度Aj；把1.0 mL的CitSeNPs溶液换成蒸馏水，测得吸光度A0。以维生素C和柠檬酸钠作为阳性对照。把各组重复三次的吸光度值取平均值计算清除率： h E=（A0-Ai+Aj）/A0样品浓度为横坐标，羟自由基清除率为纵坐标，运用办公软件Excel 2010作出平均值标准差的曲线并对曲线进行分析。（2） 超氧阴离子清除能力的测定 1）原理：在溶液呈碱性的环境下，邻苯三酚会发生氧化成半醌自由基，然后半醌自由基再氧化成醌的反应，这两步反应都会生成超氧自由基11。溶液呈弱碱性时，邻苯三酚自氧化速率随着O2-浓度的增大而增大，因此通过测定波长为420 nm处溶液的吸光度值可间接得出超氧阴离子（O2-）的清除量12。2）方法：借鉴Zhang等人的方法13。将CitSeNPs溶液稀释成和实验（1）相同浓度的样液。在5支试管中各加入2.25 mL的Tris-HCl（50 mmol/L pH=8.2）溶液，加入1 mL的蒸馏水后在25 oC下水浴20 min，20 min后先往试管中加入1mL上述配好的待测CitSeNPs溶液，再加入浓度为25 mmoL的邻苯三酚溶液0.25 mL，充分摇匀后放在25 oC的水浴箱中反应 6 min，将其取出后加入0.5 mL 10 mmol/L的HCl。最后于320 nm 下测吸光度值Ai。其他处理不变的情况下，0.5 mL的邻苯三酚换成蒸馏水，测吸光度Aj；1.0 mL的CitSeNPs溶液换成蒸馏水，测吸光度A0，以维生素C和柠檬酸钠作为阳性对照。各组重复三次取平均值。超氧阴离子自由基（O2-）的清除率： S=（A0-Ai+Aj）/A0样品浓度为横坐标，超氧阴离子自由基清除率为纵坐标，运用办公软件Excel 2010作出平均值标准差的曲线并对曲线进行分析。（3） DPPH自由基清除能力的测定 1）原理：DPPH自由基是一种稳定的含氮自由基，其醇溶液显紫色，在517 nm处有最大吸收峰。当加入抗氧化剂时，N上的单电子与其配对，溶液的颜色就会变浅。在517 nm处的吸光度就会呈一定的线性关系下降。抗氧化能力用清除率来表示，清除率越大，抗氧化性越强。2）方法：借鉴南等人的方法14。测定前将放置在冰箱中保存的3 mg/mL的CitSeNPs溶液取出，用蒸馏水将其稀释成不同浓度:分别为 0.00125 mg/mL、0.0025 mg/mL、0.005 mg/mL、0.01 mg/mL、0.02 mg/mL。取1.0 mL上述已配好的不同浓度的CitSeNPs溶液于洁净干燥的试管中，加入1.0 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液，充分摇匀后避光反应20 min，于517 nm处测吸光度Ai，把1.0 mL的DPPH换成无水乙醇，其他处理一样的情况下测吸光度值Aj；把1.0 mL的CitSeNPs溶液换成蒸馏水，其他处理不变的条件下测吸光度值A0。以维生素C和柠檬酸钠作为阳性对照。各组重复三次取平均值计算清除率：I =（A0-Ai+Aj）/ A0样品浓度为横坐标，DPPH自由基清除率为纵坐标，作出平均值标准差的曲线并对曲线进行分析。（4） 还原力的测定 1）原理：待测样品的抗氧化性将K3Fe(CN)6还原K4Fe(CN)6，K4Fe(CN)6再和FeCl3反应，生成在700 nm处有最大吸收峰的普鲁士蓝(Fe4Fe(CN)63)。一般来说，溶液的吸光度越大，表明还原能力也越强，因此可以通过反应后的溶液在700 nm处吸光度值的大小来间接得出该抗氧化剂还原力的大小。2）方法：借鉴顾彩琴等人的方法15-16。测定前将放在冰箱中保存的3 mg/mL的CitSeNPs溶液取出，稀释成和实验（1）相同浓度的样液。准确移取1.0 mL上述已配好的不同浓度的CitSeNPs溶液于洁净干燥的试管中，加入0.2 mol/L磷酸盐缓冲液1.25 mL (pH=6.6)和1%的铁氰化钾溶液1.25 mL，充分摇匀后放置在温度为50 oC的恒温水浴箱中保温20min，接着取出用流动的自来水使其快速冷却，加入1.0 mL 10%的三氯乙酸，3000 r/min的转速离心10 min，取0.5 mL上清液，加入0.1%的三氯化铁溶液0.25 mL，再移取1.75 mL的蒸馏水，充分混匀后在吸光度为700 nm处测定其吸光度A。以维生素C和柠檬酸钠作为对照，各组均按上述方法重复测量三次，记录吸光度值为A。作出。最后运用办公软件Excel 2010画出吸光度与浓度之间的关系曲线，结果用平均值标准差表示，并对曲线进行分析。2.2 实验结果2.2.1 清除羟基自由基维生素C、柠檬酸钠、CitSeNPs对超氧阴离子自由基清除效果如图1所示。结果显示，三者的清除率均随样液浓度的增大而增大。特别的是CitSeNPs的清除效果明显高于其他两者，当浓度达到0.4 mg/mL时，CitSeNPs的清除率可达到96.85%，而维生素C和柠檬酸钠分别为78.45%和61.18%。说明CitSeNPs清除羟基自由基的能力强于维生素C和修饰剂柠檬酸钠。图1 维生素C、柠檬酸钠、CitSeNPs对羟自由基的清除率比较2.2.2 清除超氧阴离子自由基维生素C、柠檬酸钠、CitSeNPs对超氧阴离子自由基清除效果如图2所示。结果显示，维生素C和CitSeNPs对自由基的清除率与浓度呈正相关，柠檬酸钠清除自由基的能力几乎不随浓度的变化而变化。此外，当浓度大于0.4 mg/mL时，CitSeNPs对超氧阴离子的清除率的能力与维生素C基本相同，分别为97.49%和97.27%，而柠檬酸钠的清除率基本都保持在4%左右。图2 维生素C、柠檬酸钠、CitSeNPs对超氧阴离子自由基清除率比较2.2.3 清除DPPH自由基维生素C、柠檬酸钠、CitSeNPs对DPPH自由基的清除效果如图3所示。结果显示，维生素C和CitSeNPs对自由基的清除率与浓度呈正相关，且在样液的浓度很低时就体现出较好的清除能力，而柠檬酸钠基本没有清除DPPH自由基的能力。当溶液浓度为0.02 mg/mL时，CitSeNPs对DPPH自由基的清除率为74.03%，维生素C为93.56%。图3 维生素C、柠檬酸钠、CitSeNPs对DPPH自由基清除率比较2.2.4 还原力测定维生素C、柠檬酸钠、CitSeNPs的总还原力如图4所示。结果显示，维生素C和CitSeNPs的还原力随浓度的增大而增大,而柠檬酸钠的还原力与浓度无关，且还原力基本接近于0。图4 维生素C、柠檬酸钠、CitSeNPs的还原力大小比较2.3 实验小结通过清除羟基自由基、超氧阴离子自由基DPPH自由基和还原力的测定得知：在实验浓度范围内,CitSeNPs清除羟基自由基的能力要强于维生素C和柠檬酸钠，且在浓度很低时，清除效果就很明显，体现了CitSeNPs清除自由基的高效性。10参考文献1 Valko M, Leibfritz D, Moncol J, et al. 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