角膜内皮细胞新的分子标记及人胚胎干细胞向角膜内皮细胞分化的研究——博士论文

博士学位论文角膜内皮细胞新的分子标记及人胚胎干细胞向角膜内皮细胞分化的研究姓名：学号：所在院系：生命科学与技术学院学科门类：理学学科专业：生物化学与分子生物学指导教师： 教授 年 月二一二年十二月二一二年九月 同济大学博士学位论文摘要摘要目的(1) 建立人类胎儿和成人角膜内皮细胞（corneal endothelial cells, CEC）mRNA转录组表达谱。比较角膜内皮细胞在胎儿及成人阶段不同的表达模式，找出角膜内皮细胞组织特异性基因表达谱和若干角膜内皮细胞新的分子标记。 (2) 建立一套有效的的从人胚胎干细胞和可诱导的多能干细胞分化为角膜内皮细胞的方法，为组织工程化角膜内皮细胞治疗角膜内皮损伤提供实验依据。方法(1) 提取胎儿及成人角膜内皮细胞RNA，运用RNA-Seq技术建立人类胎儿和成人角膜内皮细胞转录组表达谱。从GEO数据库中收集97个不同样品的RNA-Seq数据，代表其他12种不同组织细胞类型。通过比较基因组学，绘制层次聚类图和三维散点图找出胎儿及成人CEC与其他组织细胞类型的关系。运用生物信息学，找出CEC组织特异性基因表达谱和阶段特异性基因表达谱，用David在线生物信息分析系统对CEC特异性基因列表进行基因本体分析（Gene Ontology, GO）和KEGG通路分析。应用免疫组织荧光化学染色对筛选出的若干新的CEC标记分子进行蛋白水平验证。(2) 运用人胚胎干细胞（human embryonic stem cells, hESCs）或可诱导的多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）作为种子细胞，遵循角膜内皮细胞生长发育规律，将诱导过程分为两个阶段：第一阶段为hESCs或iPSCs向神经嵴细胞（Neural Crest cells, NCC）分化，该阶段我们尝试了短期诱导法（4天）和长期诱导法（2周），所用的化学因子包括Noggin和小分子化合物SB431542。第二阶段为神经嵴细胞向CEC转化，我们对比应用了添加特定化学因子组合的方法和利用牛角膜内皮细胞条件培养基进行诱导的方法，所添加的化学因子组合包括:转化生长因子-（Transforming growth factor-beta, TGF-）, 血小板衍生生长因子（Platelet-derived growth factor，PDGF）和Dickkopf 2 (DKK2)。诱导期间，通过对各阶段细胞形态学观察，RT-PCR，免疫组织化学染色检测标记分子，建立一套从hESCs或iPSCs向角膜内皮细胞诱导的最佳方法。将此方法得到的CEC样细胞做基因转录表达谱分析，找出和其他组织细胞类型的关系。(3) 建立牛角膜内皮细胞培养体系，准备去细胞的牛角膜后弹力层作为细胞载体。建立兔角膜后弹力膜机械损伤模型，移植入以牛角膜后弹力膜为载体的牛角膜内皮细胞。通过术后不同时期兔角膜透明度和厚度的恢复程度来判断移植物对于兔角膜机械损伤的修复效果。实验结束，将兔处死后固定角膜组织，通过HE染色判断细胞在受体中存活能力及对角膜结构修复能力的大小。 结果(1) 通过和12种其他类型的细胞和组织比较，在层次聚类图中我们发现胎儿的角膜内皮细胞表达谱更加接近于一些未成熟的细胞而成人的角膜内皮细胞聚类于一些终末分化的体细胞或组织。通过比较基因组学分析，找出284个成人CEC和245个胎儿CEC组织相关性表达基因。GO分析表明284个成人CEC高表达基因主要参与了其功能相关的无机阴离子跨膜转运活动，转录因子和细胞周期依赖性蛋白激酶抑制剂的活性调控。而245个胎儿CEC特异性基因则主要参与构建细胞外基质结构成分，与血小板衍生因子及其他生长因子结合的活性。进一步比较胎儿及成人CEC阶段特异性基因表达时，分别得到了518个成人和668个胎儿相对高表达基因。GO和KEGG通路分析显示，一些代谢相关的基因在成人CEC中呈相对较高的表达水平，而金属肽酶的活性，细胞外结构调节及TGF-信号通路则在胎儿CEC中相对活跃。免疫组织荧光化学检测若干标记性分子蛋白表达水平显示胎儿（17-18周）及成人CEC（37岁）均表达紧密链接蛋白ZO-1，但与CEC泵功能相关的蛋白Na+-K+-ATPase，仅在成人CEC中有表达。参与Wnt信号通路的Axin2和Beta-catenin在胎儿及成人CEC中均被检测到，但Wnt5a只在胎儿CEC中表达。S100蛋白家族的S100A4和S100A6只表达于成人CEC。此外，我们还发现即早反应蛋白IER3在胎儿CEC和成人CEC转录水平上都呈高表达水平，但在细胞中的定位有明显的区别，IER3表达在胎儿CEC细胞核，却表达于成人CEC的细胞质。(2) 通过分组诱导，我们发现在hESCs或iPSCs向神经嵴细胞诱导阶段，短期诱导法和长期诱导法都可以获得同时表达神经嵴细胞标记物P75和HNK-1的细胞，但长期诱导法可以观察到典型的神经玫瑰花状结构，表明其可能产生更为成熟的神经嵴细胞。而在神经嵴细胞向CEC样细胞诱导阶段，添加特定细胞因子诱导法可以在一周看到类似内皮细胞样形态的细胞。RT-PCR显示，该细胞可以表达AQP-1, Colleagen VIII等角膜内皮细胞特异性标记分子。免疫组织化学检测，该细胞表达ZO-1, Vimentin, Wnt5a。但10-14天以后，细胞逐渐失去内皮样形态，部分细胞甚至死亡。而牛角膜内皮细胞条件培养基的方法显示，当条件培养基添加后1至2周即可见到内皮细胞样细胞并且随着诱导时间的延长，该细胞可以缓慢扩增，形态上也逐渐成熟。三个月后仍可保持角膜内皮细胞样形态。免疫荧光化学染色表明其可以表达ZO-1标记分子。提取该细胞RNA，通过RNA-Seq测序技术显示，经诱导的hESCs来源的内皮细胞样细胞基因表达谱聚类于胎儿角膜内皮细胞。(3) 运用酶解法得到原代牛角膜内皮细胞，一周后细胞形成紧密连接，维持典型的多角形内皮样结构，增殖能力强，适合连续传代，所得的牛角膜后弹力膜经去细胞处理后可以作为很好的移植载体。而收集每次培养所得的培养基又可为CEC样细胞的诱导提供必须的生长因子。(4) 通过部分后弹力膜剥除术，我们成功建立了兔角膜内皮机械损伤模型。结论(1) 通过建立胎儿及成人CEC转录组表达谱，我们分别找出了245个胎儿CEC和 284个成人CEC组织特异性基因，以及518个成人CEC和668个胎儿CEC阶段特异性基因。并通过对胎儿及成人CEC角膜组织的免疫荧光化学染色，在蛋白水平上验证了Wnt5a, S100A4, S100A6 和IER3四个CEC新的分子标记。(2) 运用分阶段诱导法，我们成功得到了hESCs及iPSCs来源的角膜内皮细胞样细胞。关键词: 角膜内皮细胞, RNA-Seq, 人胚胎干细胞, 可诱导多能干细胞，诱导, 分化69Tongji University Doctor of Philosophy AbstractABSTRACTObjectives (1) Set up human fetal and adult corneal endothelial cell mRNA transcript expression patterns. Compare stage specific gene expression patterns in fetal and adult corneal endothelial cells. Identify corneal endothelial cell tissue-specific gene expression profiles as well as discover new molecular markers of corneal endothelial cells.(2) Establish an effective method of differentiating human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells into corneal endothelial cells in vitro; provide evidence of applying tissue engineered corneal endothelial cells in the treatment of CEC deficiency model.Methods and Materials (1) Extract RNA from the fetal and adult corneal endothelial tissue, using RNA-Seq technology to build up human fetal and adult corneal endothelial cell transcriptome expression profiling. We procured 97 samples RNA-Seq data from the GEO database representing 12 different types of cells and tissues. Through comparative genomics, we drew hierarchical clustering and three-dimensional scatter plot to identify the relationship between CEC and other cell types. We applied bioinformatics to identify the tissue-specific gene expression profiles and stage-specific gene expression profiles of adult and fetal CEC, used David online bioinformatics analysis system to analysis the GO and KEGG pathway of those gene lists. Finally, we identified a number of new CEC labeled molecules by immunohistochemical fluorescence staining on the basis of the RNA-Seq data.(2) In order to get hESCs or iPSCs derived CEC, we followed the developmental characteristics of corneal endothelial cells, separated the induced process into two stages. The first stage was getting neural crest cells from hESCs or iPSCs. We tried short-term induction method (4 days) and long-term (2 weeks) induction method baesd on the treatment of two important factors: Noggin and SB431542. The second stage was neural crest cells differentiate into CEC-like cells, we compared two different ways which including add define combine factors (TGF-, PDGF, and DKK2) or bovine corneal endothelial cell conditioned medium treatment. We kept on observing the morphological changes during the process as well as detecting CEC markers expression and gene expression pattern during the induction process. By comparing the different ways of induction, set up novel method of inducing corneal endothelial cells from hESCs or iPSCs. Finally, construct RNA-Seq library of these CEC-like cells, find out the similarity to the other cell types including fetal and adult CEC.(3) Establish bovine corneal endothelial cell culture system. Acellular bovine corneal descemets membrane was prepared as carrier for cell transplantation. Set up rabbit corneal endothelium injury model by peeling cornea descemets membrane. Transplanted with bovine corneal endothelial cells seeded on bovine corneal descemets membrane. The effect of transplantation will be determined by corneal transparency and thickness after surgery. One month after surgery, the rabbits were sacrificed and the corneal tissue were fixed for HE staining to determine cell vitality and repair capacity of corneal structural remodeling. Results(1) By comparing with 12 other tissue and cell types, hierarchal clustering revealed that fetal CECs cluster close to relatively immature cell types, In contrast, adult CECs cluster grouped together with other terminally differentiated somatic cell types. Through the comparative genomics analysis, we identied a total of 284 and 245 genes that are specically enriched in adult and fetal CECs, respectively. Gene ontology (GO) analysis revealed that the 284 up-regulated genes in adult CECs mainly participate in inorganic anion transmembrane transporter activity, transcription factor activity and cyclin-dependent protein kinase inhibitor activity. Genes unique to fetal CECs are involved in extracellular matrix structural constituent, platelet-derived growth factor binding and growth factor activity. We next directly compared adult and fetal CECs stage specific gene expression profile, identied 518 and 668 genes that are highly expressed in adult and fetal CECs respectively. GO and kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway analysis indicated that many genes involved in metabolic processes are up-regulated in adult CECs, whereas fetal CECs showed GO terms enriched in metallopeptidase activity, extracellular structure and TGF-signaling pathway. We also collected fetal and adult corneal tissues for protein expression level analysis. As expected, immunostaining results shown expression of tight junction protein ZO-1 in both fetal (17-18 weeks in gestation) and adult CECs (37 years old). Na+-K+-ATPase, which is one of the most important markers for the pump function in CECs, is highly expressed in adult CECs but not in fetal CECs. Wnt signaling molecules such as Axin2 and Beta-catenin were detected in both fetal and adult CECs. However, Wnt5a only expressed in fetal CECs. We also found sub-members of the S100A protein family (S100A4 and S100A6) expressed in adult CECs. In addition, Immediate Early Response 3 (IER3) can be readily detected in both fetal and adult CECs, but with a stark contrast in subcellular localization. IER3 localizes in the cytoplasm of adult CECs, whereas it is found in the nucleus of fetal CECs.(2) By comparing different ways of differentiation, we found that in the first stage, both of the cells after short-term or long-term induction treatment could express neural crest markers P75 and HNK-1. However, we only observed typical neural rosettes structure after long-term induction method, which shown that more mature neural crest cells were obtained after long-term treatment with noggin and SB431542. During the second stage, CEC-like cells were shown after 7 days treated with specific cytokines. RT-PCR results showed the expression of corneal endothelial cell-specific markers AQP-1 and Colleagen VIII. Immunohistochemistry staining detected ZO-1, Vimentin, Wnt5a expression. But 10-14 days later, the cells gradually lose their endothelial-like morphology and even death. When we using bovine corneal endothelial cell conditioned medium. The cells showed endothelial-like morphology one to two weeks after neural crest cell inducement. Followed by the extension of the induction, the percentage of the polygonal endothelial-like cell becoming more and more in the whole well. Immunofluorescence staining showed that these cells can express ZO-1. After extracting RNA from the induced CEC-like cells, we established the RNA-Seq liberary for transcriptome analysis, by comparing with 17 other cell type gene expression pattens , it shown that these hESCs derived CEC-like cells were cluster together with fetal CEC. (3) We successfully set up primary bovine CEC culture system, these cells can easily proliferated, suitable for continuous passage. Meanwhile, Acellularized bovine corneal descemets membrane can be used as a ideal carrier for cell transplantation. The culture medium could also been collected as conditional medium for CEC-like cells inducement. (4) By peeling rabbit descemets membrane, we successfully established a rabbit corneal endothelial injury model.Conclusion(1) By establishing the fetal and adult CEC transcriptome profiles, we identified 245 fetal CEC and 284 adults CEC tissue-specific genes, as well as 518 adults CEC and 668 fetal CEC stage-specific genes. By immunohistochemistry analysis of fetal and adult ocular tissues, we demonstrated Wnt5a, S100A4, of S100A6 and IER3 as four new CEC molecular markers in fetal and adult CECs at protein level. (2) The neural crest cells inducement method together with bovine corneal endothelial cells conditioned medium can get hESCs or iPSCs derived corneal endothelial-like cells.Key words: Corneal endothelial cells, RNA-Seq, human embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells, induction, differentiation同济大学博士学位论文英文缩略词索引英文缩略词缩略词英文全称中文翻译ANOVAAnalysis Of Variance方差分析Asc-2PAscorbic acid 2-phosphate抗坏血酸-2 -磷酸bFGFbasic Fibroblast Growth Factor成纤维细胞生长因子CECsCorneal endothelial cells角膜内皮细胞CHED1Congenital hereditary endothelial dystrophy 1先天性遗传性内皮营养不良1CHED2Congenital hereditary endothelial dystrophy 2先天性遗传性内皮营养不良2Cdkn1aCyclin-dependent kinase inhibitor 1A细胞周期依赖性蛋白激酶抑制剂1ACOL8A2Collagen, Type VIII, alpha 2 型胶原2CSChondroitin sulfate硫酸软骨素CDKCyclin-dependent kinase细胞周期蛋白依赖性激酶DALKDeep Anterior Lamellar Keratoplasty前部深板层角膜移植DMEKDescemets Membrane Endothelial Keratoplasty后弹力膜内皮移植术DSEKDescemets stripping with endothelial keratoplasty后弹力层剥除内皮移植术EBEmbryonic Body拟胚体ESCsEmbryonic Stem Cells胚胎干细胞EDTAEthylenediaminetetraacetic acid乙二胺四乙酸FDRFalse discovery rate错误发现率缩略词英文全称中文翻译FBSFetal Bovine Serum胎牛血清FNFibronectin纤连蛋白FECDFuchs endothelial corneal dystrophyFuchs角膜内皮营养不良GEOGene Expression Omnibus基因表达数据库GOGene Ontology基因本体分析hESCsHuman embryonic stem cells人胚胎干细胞H&E stainingHematoxylin and Eosin staining苏木精/伊红染色HUVECHuman umbilical vein endothelial cells人脐静脉内皮细胞iPSCsinduced Pluripotent Stem Cells诱导性多潜能干细胞IER3Immediate early response 3即早反应蛋白3KEGGKyoto Encyclopedia of Genes and GenomesKyoto基因与基因组百科全书MEFMouse Embryonic Fibroblast小鼠胚胎成纤维细胞NDSNormal Donkey Serum正常驴血清NPCNeural progenitor cells神经前体细胞PBSPhosphate Buffered Saline磷酸盐缓冲液PFAParaformaldehyde多聚甲醛POPoly-L-ornithine多聚鸟氨酸PDGFPlatelet-derived growth factor血小板衍生生长因子PPCDPosterior polymorphous corneal dystrophy后部多形性角膜营养不良RPKMReads per Kilobase Per Million mapped reads每千碱基每百万映射读数缩略词英文全称中文翻译TGF-Transforming growth factor-beta转化生长因子WGCNAWeighted gene co-expression network analysis加权基因共表达网络分析XECDX-linked endothelial corneal dystrophyX-连锁角膜内皮营养不良同济大学 博士学位论文目录摘要IABSTRACTV目录1第1章 引言51.1 研究背景51.2 研究目的和意义91.3 本课题的提出及研究思路101.4 论文结构安排10第2章 通过转录组分析寻找胚胎及成人角膜内皮细胞新的分子标记122.1前言122.2 实验材料142.2.1 实验组织142.2.2 实验试剂142.2.3 实验仪器和器械152.3 实验方法162.3.1成人及胎儿CEC组织RNA-Seq文库的构建162.3.2 数据及生物信息学分析162.3.3免疫组织化学检测组织特异蛋白表达162.4实验结果182.4.1 人胚胎及成人角膜内皮细胞组织特异性基因表达182.4.2 人胚胎及成人角膜内皮细胞阶段特异性基因表达232.4.3 蛋白水平证实胚胎及成人角膜内皮细胞阶段特异性分子标记表达差异252.5讨论292.6 结论31第3章 人角膜内皮细胞诱导分化的实验研究323.1 前言323.2 实验材料343.2.1 实验细胞343.2.2实验试剂343.2.3 仪器和器械353.2.4主要溶液配制353.3 实验方法373.3.1 人胚胎干细胞的传代培养373.3.2牛角膜内皮细胞的培养及条件培养基的收集373.3.3 人胚胎干细胞向神经嵴细胞分化383.3.4 神经嵴细胞向角膜内皮细胞分化383.3.5 荧光定量PCR检测基因表达水平方法393.3.6 免疫荧光染色403.3.7 经诱导的CEC样细胞RNA-Seq文库的构建413.4 实验结果413.4.1人胚胎干细胞的培养413.4.2人胚胎干细胞向神经嵴细胞分化423.4.3 神经嵴细胞向CEC样细胞分化（利用特定的化学因子组合）443.4.4神经嵴细胞向CEC样细胞分化（利用牛角膜内皮细胞条件培养基）463.5讨论523.6 结论54第4章 牛角膜内皮细胞移植的实验研究564.1 前言564.2实验材料574.2.1 实验材料574.2.2 实验试剂574.2.3 实验仪器和器械574.3实验方法584.3.1牛角膜后弹力层去细胞化处理584.3.2 移植物的制备584.3.3诱导的角膜内皮细胞样细胞移植入角膜损伤兔584.3.4 冰冻切片594.3.5 HE 染色594.3.6 免疫组织化学染色594.4实验结果604.4.1 牛CEC植片的准备604.4.2 牛角膜内皮细胞移植入后弹力膜机械损伤兔眼前房604.5 结论61第5章全文总结与展望62致谢64附录 攻读博士期间撰写的论文与参与的课题66个人简历及在校期间研究成果68参考文献70同济大学博士学位论文第1章 引言1.1 研究背景角膜为覆盖于眼睛前壁的透明膜，由前向后依次分为5层：上皮细胞层,前弹力层、基质层、后弹力层以及内皮细胞层。角膜内皮细胞附着于后弹力层上，为一单层细胞，呈六角形与相邻细胞形成紧密连接。这一结构特征对于其维持角膜厚度及透明度起了关键作用，人角膜内皮细胞在刚出生时约为3000-4000个每平方毫米, 但随着年龄的增长，角膜内皮细胞密度也逐渐下降，成人阶段约2500个每平方毫米, 老年人则下降到2000个每平方毫米。而细胞大小也从刚出生的18-20m增长到40m以上1。与大多细胞类型不同的是，角膜内皮细胞在体内不能再生，或者说只保留了有限的再生能力，故一旦受到损伤或丢失，临近细胞会代偿性的改变原有的规则六边形态，保持内皮细胞表面积的稳定，但达到临界密度（400-700/mm2）时，角膜内皮细胞就失去了原有的功能。病人则会出现角膜混浊，视力下降等临床表现。Yang, 2013 #343各种因素均可造成角膜内皮损伤以致其功能丧失而引起角膜混浊。如：大泡性角膜病变，各种遗传性角膜内皮营养不良，糖尿病2，白内障手术3，外伤，感染4，甚至青光眼导致的眼压增高5等。由于角膜内皮细胞在体内无增殖能力，只能靠临近细胞的变形迁移来获得一定程度的修复，角膜移植术成为不二之选。但是传统的穿透性角膜移植术面临手术操作复杂，免疫排斥，创伤大及供体来源缺乏的现状。近来，有研究者提出可以将供者角膜分为上皮细胞及其基底膜，前弹力层和基质，结合前部深板层角膜移植（Deep Anterior Lamellar Keratoplasty ，DALK) 和后弹力膜内皮移植术（Descemets Membrane Endothelial Keratoplasty ，DMEK），可减少约50的角膜供体组织的需要6。即使如此，仍面临全球性的角膜供体缺乏。为了解决这一难题，人们尝试在体外扩增人的胎儿及成人角膜内皮细胞，因为在体外CECs还保留了增殖能力，特别是胎儿的CEC7。研究者认为，这可能是因为角膜内皮细胞有干细胞或前体细胞的存在。通过组织块法分别培养角膜中央和周边部分，Bednarz等8发现，角膜周边的内皮细胞在体外保有更强的增殖能力，但是细胞与细胞之间的连接没有体内紧密。相反，中央的内皮细胞几乎没有增殖能力但却一直保持了和体内类似的形态特征。后有研究者应用BrdU示踪和碱性磷酸酶染色推测角膜内皮干细胞存在于角膜内皮和小梁交界处。在内皮损伤模型时，可以参与增殖修复损伤部位，并且这种增殖能力具有年龄依赖性9。基于人角膜内皮细胞体外有限的增殖能力，人们又尝试基因工程化人角膜内皮细胞，CEC细胞周期主要受p53和pRB通路调控，人乳头瘤病毒（HPV）可以使p53和pRb途径失活，使体外培养的HCECs永生化。Kim10等即运用逆转录病毒感染HPV16 E6/E7得到了永生化的人角膜内皮细胞。但是这种方法会导入病毒癌基因，并且在功能上也未得到验证。所以Yokoi11又利用逆转录病毒载体将突变的细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）和细胞周期蛋白D1转入人角膜内皮细胞以抑制pRB通路，同时重复了Kim的方法，比较两种转基因得到的内皮细胞系，Yokoi认为其方法得到的细胞系更好地维持了角膜内皮细胞应有的形态和泵功能，但仍然没有避免癌基因的导入。Fan12等在没有掺入外来基因的前提下，连续培养人角膜细胞超过224代且无致瘤性，建立了相对安全的人角膜细胞系，但没有得到泵功能检测验证，也缺乏体内实验支持。人胚胎干细胞是来源于囊胚内细胞团的一种高度未分化细胞。具有无限增殖和发育全能性等特点。可自发分化为多种细胞，特定诱导条件下可定向分化为某一类型的细胞。目前已知hESCs可分化为神经细胞、心肌细胞、造血细胞、平滑肌细胞、软骨细胞、肝脏细胞等。2006年, Takabashi13等首次尝试在小鼠成纤维细胞内导入特定转录因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4), 重编程为具有ESCs特征的诱导多能干细胞。此后诸多研究人员将特定基因、基因产物或小分子化合物以类似方法导入不同来源的动物或人类体细胞，重编程以获得iPSCs。此类细胞在形态、表面标记物、功能等方面和ESCs相似，但避免了hESCs研究中所涉及的伦理问题, 且来源于患者的体细胞可大大降低细胞移植中可能出现的免疫排斥反应。因而, iPSCs已成为干细胞研究领域炙手可热的话题。hESCs和iPSCs在眼科学领域已经有了明显的发展优势。角膜上皮是眼球的第一保护屏障，角膜缘位于角膜与结膜、巩膜的移行区，角膜缘干细胞存在于角膜缘基底层14，负责维持正常角膜上皮细胞的稳态和损伤角膜的修复。一旦受到损伤就会导致患者出现角膜结膜化和血管化等症状，最终表现为角膜混浊、视力下降。自小鼠和人的胚胎干细胞建系以来，人们就尝试在体外诱导出角膜上皮或上皮前体细胞样细胞以代替缺损的角膜上皮细胞。2004年，Homma 15 等将小鼠的 ESCs 培养在铺有胶原的培养皿上， 8 天后成功地诱导出了角膜上皮前体细胞， 这些前体细胞能表达 K12 等特异性角膜上皮标记蛋白。将此上皮前体细胞移植于小鼠患眼， 可在患眼角膜表面形成完整的正常角膜上皮组织。2007年，Ahmad 16等又利用类似的角膜上皮细胞条件培养基诱导的方法，将人的胚胎干细胞成功诱导为角膜上皮样细胞。 干细胞研究在眼科学的另一项突破性进展就是利用干细胞来源的视网膜色素上皮细胞治疗老年性黄斑变性。视网膜色素上皮细胞是位于神经视网膜和脉络膜之间的单层色素上皮细胞，其主要作用是维护光感受器。和CEC类似的是，它在体内无再生能力，也是靠临近细胞的变形迁移来填补受损后的缺损部位。自从1994年，Algvere17首次将人RPE细胞移植于老年性黄斑变性患者视网膜下腔，为视网膜变性或老年性黄斑变性的治疗带来了曙光。但随后的供体缺乏及免疫排斥等问题也随之而来。再生医学的发展，使干细胞治疗逐渐受到了关注。目前，人们已经建立了较为成熟的hESCs及iPSCs诱导分化为RPE细胞的方法18,19。伴随着体外实验的进展，体内实验也在如火如荼的进行着。2011年1月3日，再生医学领域的领导者：先进细胞技术公司（Advanced Cell Technology，ACT）宣布将开展临床多中心应用人胚胎干细胞来源的RPE治疗干性视网膜黄斑变性的研究。这也预示着干细胞移植走向了一个崭新的为人们所认同的细胞治疗时代。鉴于ESCs和iPSCs以上优点，研究者们自然想到了以ESCs或iPSCs为种子细胞，诱导分化为具有功能的角膜内皮细胞，以解决诸如安全性，免疫排斥反应，细胞来源，长期扩增和连续培养等问题。当然，将ESCs或iPSCs作为种子细胞也具有风险，如果经诱导CEC中混有未分化的细胞，可能会有致瘤性。而如今为了提高iPSCs生成效率，人们还是偏向于使用逆转录病毒转染，这也无形中增加了癌基因的掺入。尽管如此，随着H9细胞这一标准化的hESCs细胞株在日本、美国加州等临床基地在视网膜黄斑变性临床研究，一定可以为胚胎干细胞及可诱导多能干细胞来源的CEC治疗角膜疾病的临床应用带来参考价值。 从胚胎干细胞向CEC的发展大致经过了2个阶段：胚胎干细胞向神经嵴细胞分化阶段和神经嵴细胞分化为CEC。神经嵴是脊椎动物胚胎发育中的一种过渡性结构，是在神经管建成时位于神经管和表皮之间的一条纵向的细胞带。神经嵴的细胞具有很强的迁移能力，它们逐渐地迁移到胚胎一定部位，分化为各种特定的细胞和组织20。在眼前房的发育过程中，神经嵴细胞可分化为角膜基质细胞21、角膜内皮细胞22以及睫状体23。如今，已经建立了多种人胚胎干细胞向神经嵴细胞分化的方法24,25，其中较为公认的方法有两种：和MS5细胞共培养方式或应用BMP-4抑制剂Noggin和TGF-抑制剂SB431542相组合的方式。在神经嵴细胞向CEC发育的过程中，微环境对于CEC的诱导起着决定作用，所以对现阶段的内皮细胞培养体系应有所了解。角膜内皮细胞的培养涉及到基础培养基添加物基质及载体的选择，在基础培养基的选择上，F99 Hams F12&M199(1:1)DMEMOpti-MEM-1Hams F12&DMEM等均经过尝试， Peh等26通过比较发现在这些常用的基础培养基中，F99和Opti-MEM更适合于CEC形态及功能的维持。添加物的种类及浓度的选择则更具多样性，但在已知的添加物中，抗坏血酸-2-磷酸（A