三种防霉剂对食品污染根霉的抑制效果研究——毕业论文

湖 南 农 业 大 学全日制普通本科生毕业论文三种防霉剂对食品污染根霉的抑制效果研究THE EFFECT OF THREE KINDS OF FUNGICIDES ON RHIZOPUS 学生姓名： 学 号： 年级专业及班级： 食品质量与安全 指导老师及职称： 学 院：食品科学技术学院湖南长沙提交日期： 年 月 目 录 摘要1 关键词11前言2 2材料与方法3 2.1试验材料 3 2.2主要仪器32.3试验方法32.3.1根霉接种物的制备3 2.3.2三种防霉剂对根霉的抑菌效果 4 2.3.3不同防霉剂及其浓度对根霉菌丝生长抑制试验4 2.3.4不同防霉剂及其浓度对根霉菌孢子萌发抑制试验5 3结果与分析5 3.1根霉接种物的制备5 3.2不同防霉剂对根霉抑菌效果的比较5 3.3不同防霉剂及其浓度对根霉菌丝生长抑制的影响6 3.4三种防霉剂及其浓度对根霉孢子萌发抑制的影响 8 4结论与讨论9 参考文献 10致谢11附录11 1三种防霉剂对食品污染根霉的抑制效果研究 摘 要：本试验研究以脱氢乙酸钠、山梨酸钾、丙酸钠三种食品防霉剂为抑菌剂对食品污染根霉的抑菌效果，以期筛选出对根霉抑制效果最佳的防霉剂。采用牛津杯法、琼脂稀释法、二倍稀释法进行三种防霉剂对根霉菌丝生长速率影响的试验、三种防霉剂对根霉孢子萌发影响的试验。试验结果表明，在添加浓度为1g/L的条件下，脱氢乙酸钠、山梨酸钾、丙酸钠三种防霉剂对根霉菌丝生长抑制率分别为87.67%、27.81%、0%。其中脱氢乙酸钠对根霉菌丝生长和孢子萌发的抑制效果最强。由此可以得出结论，脱氢乙酸钠是三种防霉剂中最适合用于抑制根霉的食品防霉剂。 关键词：防霉剂；脱氢乙酸钠；山梨酸钾；丙酸钠 The Effect of Three Kinds of Fungicides On RhizopusAbstract:This experiment studied the antibacterial effect of three detergents such as sodium dehydroacetate, potassium sorbate, and sodium propionate as the bacteriostatic agent on the food-contaminated Rhizopus in order to screen out the best antifungal agent against Rhizopus. . Oxford Cup method, agar dilution method and double dilution method were used to test the effects of three kinds of antifungal agents on the growth rate of mycelia, and the effects of three kinds of antifungal agents on the germination of Rhizopus spores. The experimental results show that under the conditions of the addition of 1g/L concentration, the inhibition rates of three kinds of antifungal agents such as sodium dehydroacetate, potassium sorbate, and sodium propionate are 87.67%, 27.81%, and 0%, respectively. Among them, sodium dehydroacetate had the strongest inhibitory effect on mycelia growth and spore germination. From this it can be concluded that sodium dehydroacetate is the best of the three fungicides for inhibiting Rhizopus.Key words: Fungicide；Sodium dehydroacetate；Potassium sorbate；Sodium propionate1 前言防霉剂是指为防止霉菌滋生的一种添加剂。食品、农产品、饲料等在使用及存放期间，易遭霉菌污染，使成品变质。为了防止霉菌滋生，需在产品中加入防霉剂。食品防霉剂是食品防腐剂的一种，也属于食品添加剂。根据GB 2760-2014，脱氢乙酸钠在糕点、面包中的最大添加量为0.5g/L，山梨酸钾在糕点、面包中的最大添加量为1.0g/L，丙酸钠在糕点、面包中的最大添加量为2.5g/L。本试验拟以实验室分离保存的食品污染菌根霉作为指示菌，分别比较不同浓度的脱氢乙酸钠、山梨酸钾、丙酸钠对根霉菌丝生长和孢子萌发的影响，从中选出抑制根霉生长的最佳防霉剂，为其在食品生产中的应用提供理论依据。常见的食源性致病菌种类繁多，其中包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。目前水产品中的主要防腐剂有山梨酸钾，山梨酸，二氧化氯水溶液等1。山梨酸钾作为一种不饱和脂肪酸，可在体内参与新陈代谢，最终被分解成二氧化碳和水，而几乎没有毒性2，目前山梨酸钾已成为一种在全球范围使用广泛的化学防腐剂3。近年来，我国主要的防腐剂的生产不但满足国内市场，而且都重视开发国际市场，我国防腐剂的出口量在世界占有重要地位。我们可以看见：在以前，人们还认为山梨酸钾价格高，因而用量少。但今年随着人们环保意识的增加和渴望绿色食品的要求，加上山梨酸钾生产技术的改进，使得生产成本大幅度下降，促成了山梨酸钾的大发展和大量使用。山梨酸钾是安全的，可作为食品、药品、饲料等领域的防腐剂，商业前景十分广泛4。山梨酸钾具有很强的抑菌活性，如今已经是食品上常用的防腐剂5。我国是一个人口大国，据估计，我国每年有20%30%的食物因腐败而白白损失6。随着食品工业的发展，延长货架寿命、防止食品腐败变质成为了食品行业中重要的问题，由此防腐剂在食品生产过程中得到广泛应用7。未来的防霉剂研究和开发应朝着优质高效、低成本的方向发展8。一些因含有对人体及动物有害物质、或在应用中存在潜在危害的防霉剂已经或将被禁用9。脱氢乙酸钠作为一种安全性很好的食品防霉剂，对于不同的微生物表现出不同的影响，复配使用时，抗菌效果可以互补，有协同作用10。食品防霉剂作为食品防腐剂的一大类，将是发展热点。双乙酸钠无残留,无任何毒副作用,无致癌因素，是高效霉菌与细菌的抑制剂11。双乙酸钠的防腐效果优于目前广泛使用的丙酸盐类、山梨酸及其盐类。而其添加量比丙酸盐低,价格也低于丙酸盐、山梨酸及其盐类,被认为是高效低价、高性价比的防腐剂12。双乙酸钠还有极强的金属螯合作用,可抑制食品中多种酶的活性,延缓脂类氧化和蛋白质分解,起到延长食品货架期和改善风味的双重作用13。作为一种高效的粮食、饲料防霉剂和优质的畜牧水产饲料营养添加剂,双乙酸钠已经具有良好的使用效果14,但还没有广泛应用于食品中。因此本试验采用与双乙酸钠成分相似的脱氢乙酸钠作为试验用的防霉剂。 经过多年实验及应用表明,霉菌产生抗药性的问题很少发生,只要选用合适的防霉剂。生产中按照一定的配方加入合适的分量，注意防霉剂的理化特性，基本上能防治霉菌15。 而要得到合适的防霉剂以及配方和特点，需要进行抑菌试验。首先，要判断一个防霉剂是否能防治霉菌，需要用牛津杯法做定性试验16。牛津杯法又称管蝶法17,是抑菌试验中常用的方法。另外，菌饼法也可以做定性试验。2 材料与方法2.1 试验材料根霉（Rhizopus stolonifer）：由湖南农业大学食品科学技术学院实验室提供。孟加拉红培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）从北京陆桥技术股份有限公司购买。 山梨酸钾、丙酸钠以及脱氢乙酸钠分别从河南恩苗食品有限公司和青岛九泰生物科技有限公司购买，均为食品级。2.2 主要仪器SPX-250B型恒温培养箱天津市泰斯特仪器有限公司SW-CJ-1FD型无菌操作台苏州净化设备有限公司CX23LEDRFS1C型生物显微镜奥林巴斯（广州）工业有限公司LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂XB-K-25型血球计数板国营上海医用光学仪器厂DGYF-200型移液枪北京雅安达生物技术有限公司DGYF-1000型移液枪北京雅安达生物技术有限公司AUY220型电子天平日本岛津制作所2.3 试验方法2.3.1 根霉接种物的制备 根霉斜面菌种的活化:取冰箱保存的根霉试管斜面划线接种于PDA固体培养基上，置于30 恒温培养箱中培养24-36 h，如此反复培养菌种3代，制得活化的根霉菌种。根霉菌悬液的制备:向活化的根霉试管斜面中加入适量无菌生理盐水刮取菌丝，倒入带玻璃珠的无菌三角瓶中，充分振摇打断菌丝制备菌悬液，备用。根霉菌饼的制备 取制备的根霉菌悬液0.1 mL涂布接种到孟加拉红固体培养基上，置于28 恒温培养箱中培养，等到根霉菌丝长满平板表面后，采用直径6 mm的打孔器制备菌饼，备用。根霉孢子悬液18的制备:将制备的根霉菌悬液0.1 mL涂布接种到PDA固体培养基平板上，倒置于28 恒温培养箱中培养48 h，由于根霉的菌丝较长，长出的孢子部分落到培养皿盖内。用无菌生理盐水冲落培养皿盖内附着的孢子，轻轻摇匀后，再用移液管吸取1mL放入无菌的200 mL三角瓶内，并进行逐级稀释，同时采用血球计数板对每个梯度的孢子悬液进行计数，直至获得合适稀释度的孢子悬液（孢子悬液浓度：4.0104 CFU/mL、2.5106 CFU/mL），备用。2.3.2. 三种防霉剂对根霉的抑菌效果试验牛津杯法：取制备的根霉孢子悬液0.1 mL涂布接种孟加拉红培养基平板，共接种平板12个，各平板中央放入1个牛津杯，然后将平板分为4组，每组3个平行。第1组（水）分别向牛津杯中添加200 l无菌生理盐水、第2组（山）分别向牛津杯中添加5.0 g/L 的山梨酸钾溶液200l、第3组（丙）分别向牛津杯中添加5.0 g/L 的丙酸钠溶液200l、第4组（脱）分别向牛津杯中添加5.0 g/L 的脱氢乙酸钠溶液200l，在28温度条件下培养38 h后，测定并计算各皿抑菌圈大小，比较不同防霉剂对根霉的抑菌效果。抑菌圈19大小测定：取出培养好的试验平板，采用十字交叉法用游标卡尺测量抑菌圈直径，以直径表示抑菌圈的大小，记录并分析结果。菌饼法：取配制的孟加拉红固体培养基3瓶（50 mL/瓶）分别添加脱氢乙酸钠、山梨酸钾和丙酸钠，使其浓度为1g/L，分别制备平板（各3个平板），随后每个平板中央接种一个根霉菌饼（6mm），菌饼长满菌丝的一面朝下，在28条件下恒温培养38 h，采用十字交叉法用游标卡尺测量并比较各菌落直径大小、生长量和抑制率。2.3.3 不同防霉剂及其浓度对根霉菌丝生长抑制试验将配制好的13瓶（50 mL/瓶）孟加拉红固体培养基分为3组，第1组5瓶分别标记为CK、脱1、脱2、脱3、脱4，并分别添加脱氢乙酸钠0 g、0.025 g、0.050 g、0.100 g、0.200 g，即除空白对照CK为0外，其他培养基中脱氢乙酸钠浓度以二倍递增，分别为0.5 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L、4.0 g/L；第2组4瓶分别标记为山1、山2、山3、山4，并分别添加山梨酸钾0.050 g、0.100 g、0.200 g、0.400 g，即各培养基中山梨酸钾浓度以二倍递增，分别为1.0 g/L、2.0 g/L、4.0 g/L、8.0 g/L；第3组4瓶分别标记为丙1、丙2、丙3、丙4，并分别添加丙酸钠0.125 g、0.250 g、0.500 g、1.000 g，即各培养基中山梨酸钾浓度以二倍递增分别2.5 g/L、5.0 g/L、10.0 g/L、20.0 g/L。随后每瓶培养基制备3个平板，并作相应的标记，上述每个孟加拉红平板中央接种一个根霉菌饼（6mm），菌饼长满菌丝的一面朝下，在28条件下恒温培养，当CK对照组长满菌丝时，采用十字交叉法测定各个平板菌落的直径，并按以下公式计算抑制率：生长量（mm）=菌落平均直径-菌饼直径 （对照菌落生长量-处理菌落生长量） 抑制率（%）=对照菌落生长量1002.3.4 不同防霉剂及其浓度对根霉菌孢子萌发抑制试验配制含PDA液体培养基9mL的试管45支，分为3组，每组15支，分别添加脱氢乙酸钠（0 g/L、0.5 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L、4.0 g/L）、山梨酸钾（0 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L、4.0 g/L、8.0 g/L）、丙酸钠（0 g/L、2.5 g/L、5.0 g/L、10.0 g/L、20.0 g/L），每个浓度做三个平行试管，并做相应编号。在无菌操作台上，采用DGYF-1000型移液枪接种1mL浓度为4.0104 CFU/mL的根霉孢子悬液，放入恒温培养箱中在28条件下恒温培养，培养4h后每个小时都对对照组进行镜检观察，在对照组孢子萌发数目达到孢子总数的90%以上时，观察并记录其他组孢子萌发数目、生长情况等。3 结果与分析3.1 根霉接种物的制备根霉菌种经活化培养后生长良好，菌丝生长茂密，制备的菌饼均匀，孢子悬液也达到了要求的浓度，均能满足后期试验。如图1所示，采用血球计数板计数孢子数量，其孢子浓度为4.0104 CFU/mL。 图1 血球计数板计数根霉孢子数量（放大倍数40）Fig. 1 Hemocytometer Counts Number of Rhizopus Spores (40)3.2 不同防霉剂对根霉抑菌效果的比较比较浓度为5 g/L的三种防霉剂对根霉的抑菌效果，如附录中图7为恒温培养38h结果，由于根霉菌丝较长、生长蔓延较快以及试验操作的原因，牛津杯法从平板正面难观察到明显的抑菌圈，但是添加脱氢乙酸钠平板（脱）中菌丝生长很不均匀，牛津杯周围大部分区域没有菌丝生长；添加生理盐水平板（水）中菌丝生长均匀，牛津杯周围菌丝生长丰满；另外添加山梨酸钾平板（山）牛津杯周围菌丝较短，其厚度比添加丙酸钠平板（丙）薄。由此可见，虽然脱氢乙酸钠、山梨酸钾和丙酸钠均无法抑制根霉菌落生长，但浓度同为5g/L的条件下，对根霉抑菌效果较好的防霉剂是脱氢乙酸钠。 由附录中图8可知，将菌饼接种至含不同种类相同浓度防霉剂的孟加拉红平板中培养时，不同种类防霉剂对根霉菌丝生长的抑制效果有明显差别，导致菌落直径大小不同，含脱氢乙酸钠平板（脱）中根霉菌落直径最小为16.36mm、含山梨酸钾平板（山）中根霉菌落直径为66.64mm、而含丙酸钠平板（丙）中根霉菌落直径几乎与平板直径相同。由此说明，在添加剂浓度都为1.0g/L的条件下，脱氢乙酸钠对根霉的抑制作用最强。3.3 不同防霉剂及其浓度对根霉菌丝生长抑制的影响将相同直径大小（6mm）的根霉菌饼接种于不同防霉剂及浓度的孟加拉红培养基平板中恒温培养38h后，空白对照组平板中的根霉菌丝已经长满，此时观察各平板菌落大小，如图4所示，每行从左到右为添加了同种防霉剂浓度从低到高的平板，图中可知同种防霉剂浓度越高，菌丝生长受到抑制越明显，菌落直径越小。当培养基中脱氢乙酸钠浓度为0.5 g/L时，生长的根霉菌落直径为29.25mm；脱氢乙酸钠浓度为1.0 g/L时，生长的根霉菌落直径为16.36mm，脱氢乙酸钠浓度增加至2.0 g/L时，菌落直径与菌饼直径相同，没有菌体生长，直径仍为6mm；当培养基中山梨酸钾浓度为1.0 g/L时，生长的根霉菌落直径为66.64mm；达到本试验最大浓度8.0 g/L时，根霉生长抑制，菌落直径没有增大，仍是保持6mm的菌饼大小；当培养基中丙酸钠浓度为2.5 g/L时，生长的根霉菌落直径为90.00mm；丙酸钠浓度为20.0g/L时，生长的根霉菌落直径为18.20mm。记录所有平板中菌落的直径，按照方法2.3.3中的计算公式计算出菌落的生长量及抑制率，结果如图5、图6。从图中可知，随着防霉剂浓度的增加，根霉菌丝生长量下降，防霉剂抑制菌丝生长抑制率呈上升趋势。三种防霉剂浓度均为1g/L时，脱氢乙酸钠对根霉菌丝生长的抑制率为87.67%，有效的抑制了根霉菌丝的生长，山梨酸钾对根霉菌丝生长的抑制率只有27.81%，抑制效果比脱氢乙酸钠弱，而丙酸钠对根霉菌丝生长的抑制率为0%，在此浓度下，丙酸钠对根霉菌丝生长没有抑制效果。根据食品安全国家标准食品添加剂使用标准(GB2760-2014)，脱氢乙酸钠在糕点、面包中的最大添加量为0.5g/L，山梨酸钾在糕点、面包中的最大添加量为1.0g/L，丙酸钠在糕点、面包中的最大添加量为2.5g/L。为了便于观察，有效地比较各防霉剂对根霉的抑制效果，本试验以GB2760-2014规定的各防霉剂最大添加为起始浓度，随后浓度成倍递增，设计抑菌试验观察其对根霉的抑制效果（根霉孢子悬液接种浓度为4.0104 CFU/mL，远远大于食品中霉菌含量）。图2三种防霉剂作用下根霉菌落的生长量（mm）Fig 2 growth of various Rhizopus colonies under the action of three kinds of antifungal agents(mm)由图2可知，三种防霉剂在最大添加量时对根霉菌丝生长的抑制效果由强到弱分别是：脱氢乙酸钠、山梨酸钾、丙酸钠。而丙酸钠在2.5g/L浓度内对根霉菌丝生长的抑制率为0%，说明丙酸钠在此浓度无法抑制根霉菌丝生长。山梨酸钾虽然有抑菌效果，对根霉菌丝生长得抑制率却只有27.81%，比脱氢乙酸钠的抑菌效果弱了将近一倍，脱氢乙酸钠对菌丝生长的抑制率达到72.32%，抑菌效果明显。在浓度成倍增加的条件下，脱氢乙酸钠在四倍最大添加量时抑制率达到100%，山梨酸钾在二倍最大添加量时抑制效果提升明显，丙酸钠抑菌效果并不理想，在八倍最大添加量的条件下，脱氢乙酸钠和山梨酸钾对根霉菌丝的抑制率都达到100%，且丙酸钠对根霉菌丝的抑制率也达到83.85%，抑菌效果明显。根据分析以上几条可以得出脱氢乙酸钠的抑制根霉菌丝生长的效果最佳，山梨酸钾也有抑制效果，丙酸钠的抑制效果不佳。图3 三种防霉剂对根霉菌丝生长的抑制率（%）Fig3 The inhibitory effect of three fungicides on the growth of Rhizopus mycelium(%)3.4 三种防霉剂及其浓度对根霉孢子萌发抑制的影响 图4 镜检的根霉孢子（40） 图5 镜检的根霉孢子萌发情况（40） Fig 4 Rhizopus spore microscopy（40） Fig 5 Rhizopus spore germination （40）恒温培养10h后，空白对照组的根霉孢子萌发数达到90%，此时对其他组试管中的培养液进行镜检，根据观察计数结果可知，随着防霉剂的浓度增高，根霉孢子萌发数量越少，防霉剂对根霉孢子萌发的抑制率增大。图6 三种防霉剂在不同浓度下对根霉孢子的抑制率（%）Fig6 Effect of Three Kinds of Antifungal Agents on Spores in Different Concentrations（%）由图6可知，三种防霉剂在GB 2760-2014规定的糕点、面包中最大添加量时（GB 2760-2014规定在糕点、面包中，脱氢乙酸钠的最大添加量为0.5g/L，山梨酸钾的最大添加量为1.0g/L，丙酸钠在糕点、面包中的最大添加量为2.5g/L。）都有抑制根霉孢子萌发的效果，脱氢乙酸钠和山梨酸钾在此浓度是都能抑制半数孢子的萌发，丙酸钠的抑制率则只有36.36%，当浓度为二倍最大添加量的情况下，脱氢乙酸钠对根霉孢子萌发的抑制率达到91.67%，山梨酸钾对根霉孢子萌发的抑制率达到83.33%，抑菌效果明显，而丙酸钠在此浓度只有45.45%，直到四倍最大添加量时才达到81.82%，因此脱氢乙酸钠与山梨酸钾对根霉孢子萌发的抑制作用要优于丙酸钠。在八倍最大添加量的条件下，脱氢乙酸钠对根霉孢子萌发的抑制率达到100.00%，而山梨酸钾的抑制率是95.83%，不能做到完全抑制孢子的萌发，说明三种防霉剂中脱氢乙酸对根霉孢子萌发的抑制效果是最强的。4 结论与讨论综合上述三个试验的结果和数据分析，可以知道三种防霉剂中脱氢乙酸钠是对根霉抑菌效果最好的防霉剂。在牛津杯法抑菌试验中，试验结果说明脱氢乙酸钠对根霉菌丝生长和孢子萌发都有强抑制效果，在其后的使用菌饼法的抑菌试验中，菌落大小的明显差异证明了脱氢乙酸钠对根霉菌丝生长的有效抑制，与山梨酸钾和丙酸钠相比较，脱氢乙酸钠的抑菌效果更强。在最后的抑制根霉孢子萌发的试验中，脱氢乙酸钠对根霉孢子萌发的抑制效果也比山梨酸钾和丙酸钠明显，并且抑制效果优于山梨酸钾和丙酸钠。食品防霉剂的种类很多，每种防霉剂本身都有自己的特点，可能在某些方面表现出长处，而另一方面则表现出不足。实际选用时，可发挥两种或两种以上的防霉剂的协同效果，配制成复方使用；也可以是根据作用对象即被抑制霉菌的生物学特性来进行试验比较，选出最佳效果的抑菌剂使用。本试验中三种防霉剂都易溶于水，而脱氢乙酸钠还易溶于甘油和丙二醇，山梨酸钾易溶于乙醇，丙酸钠则是微溶于醇类物质。角固醇特别是麦角固醇是真菌细胞膜的重要组成部分，良好的溶解性使脱氢乙酸钠和山梨酸钾可以顺利穿透真菌细胞膜进入细胞体内，破坏各种膜系统的通透性及干扰膜其他正常生理功能，从而起到抑制真菌生长的作用。因此易溶于醇类物质的脱氢乙酸钠和山梨酸钾在抑制根霉生长繁殖方面优于丙酸钠。除了以上三个试验，脱氢乙酸钠还是联合国粮农组织和世界卫生组织批准使用的一种安全食品防腐、防霉保鲜剂，脱氢乙酸钠无毒无害，对环境也无危害，其安全性要也优于山梨酸钾和丙酸钠。参考文献1 凌关庭，唐述潮，陶民强，等.食品添加剂手册M.北京：化学工业出版社，2003:645-680.2 马玉山，梁咏梅山梨酸钾在肉制品中的应用实例J 肉类工业，2006，8(304):3-43 滕菲，郭桂萍，赵勇，等.革兰氏阳性菌和阴性菌对山梨酸钾的耐受差异性J.食品与生物技术学报，2012,(04):417-422.4 曾婷，谢逸欢，马丽.山梨酸钾的毒理学评价J.海南医学,2012,23(19):19-21.5 刘莉，刘霞，包永华.碳酸钠、碳酸氢钠和山梨酸钾对柑橘采后酸腐病菌的抑制作用J.北方园艺，2011,(23):145-147.6 徐芳.浅析食品防腐剂 J . 畜牧与饲料科学，2009(2):77-79.7 任剑豪，易灵，吴卫国.山梨酸及其盐类防腐作用的研究现状及发展趋势J.2017,(9):48-50+55.8 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