毕业论文范文——QuEChERS-液相色谱-串联质谱法 测定毛豆中32种磺酰脲类除草剂残留

闽南师范大学毕业论文（设计）QuEChERS-液相色谱-串联质谱法测定毛豆中32种磺酰脲类除草剂残留 QuEChERS - liquid chromatography - tandem mass spectrometry determination of 32 kinds of sulfonylurea herbicide residues in soybean姓 名： 学 号： 系 别： 生物科学与技术学院 专 业： 食品科学与工程 年 级： 指导教师： 年 月 日摘要建立了基于QuEChERS方法的液相色谱-串联质谱同时测定毛豆中32种磺酰脲类除草剂残留的方法。样品采用乙腈提取、无水硫酸镁及氯化钠盐析、C18分散固相萃取净化；液相色谱以CSH C18色谱柱梯度洗脱分离，质谱分析采用电喷雾负离子电离、按时间表的多反应监测模式（Scheduled MRM），以基质匹配校准曲线外标法进行定量。32种农药在毛豆中3个添加水平（10，20，100 g/kg）的回收率为86.0% 120.9%，相对标准偏差为1.4% 13.9%， 32种农药的定量限（S/N 10）为0.2g/kg 5.0 g/kg，方法简便、灵敏、环保，适用于甜玉米及毛豆中32种磺酰类除草剂残留的定性定量分析。关键词：QuEChERS；液相色谱-串联质谱；磺酰脲类除草剂；毛豆AbstractBased on QuEChERS method and liquid chromatography - tandem mass spectrometry determination of 32 kinds of sulfonylurea herbicide residues in soybean. Sample by acetonitrile extraction, anhydrous magnesium sulfate and sodium chloride salting-out, C18 dispersive solid-phase extraction and purification; Performance liquid chromatography (HPLC) with CSH C18 chromatographic column and gradient elution separation, mass spectrometry using electrospray ionization ion, according to the schedule of multiple reaction monitoring mode (Scheduled MRM), with the matrix matching method of external standard calibration curve quantitatively. 32 kinds of pesticides in the edamame added three levels (10,20,100 mu g/kg) of recovery is 86.0% 86.0%, relative standard deviation is 1.4% 1.4%, 32 kinds of pesticide quantitative limit (S/N of 10 or higher) of 0.2 mu g/kg 5.0 mu g/kg, the method is simple, sensitive, environmental protection, suitable for sweet corn and soybean in 32 kinds of sulfonyl herbicide residues of qualitative quantitative analysis. Key words: QuEChERS ; Liquid chromatography - tandem mass spectrometry; Sulfonylurea herbicides; Edamame目 录 中英文摘要 （1） 前言 （3） 1 实验部分 （3） 1.1仪器与试剂 （3） 1.1.1仪器 （3） 1.1.2试剂 （3） 1.1.3 32种农药标准溶液 （4） 1.1.4基质匹配标准溶液 （4） 1.2样品前处理 （4） 1.3色谱和质谱条件 （4）2 结果与讨论 （6） 2.1LC-MS/MS 分析参数的优化 （6） 2.2提取溶剂的选择 （7） 2.3分散吸附剂的选择 （7） 2.4方法评价 （7）3 结论（10）参考文献（10）致谢（11）前言磺酰脲类除草剂具有高效、低用量、高选择性等特点成为全球主流的除草剂品种之一，被广泛应用于防除农作物中一年生及多年生杂草，虽然其用量少、毒性低，但由于大多数属于长残效除草剂，该类除草剂可能对人类健康和环境造成毒害，并对后茬作物产生药害，国内外对该类农药均制定了残留限量标准1,2，如欧盟规定噻磺隆在鲜豆类蔬菜中的最大残留限量为0.05mg/kg2。2013年12月19日我国农业部发布第2032号公告，自2015年12月31日起禁止氯磺隆在国内销售和使用，自2017年7月1日起禁止甲磺隆和胺苯磺隆在国内销售和使用。磺酰脲类除草剂属非挥发性弱酸，极性强，热稳定性差3，测定方法主要有液相色谱法（HPLC）4,5、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）6-10、毛细管电泳法11；前处理方法有液液萃取法（LLE）4及固相萃取法（SPE）5-11，SPE使用的填料有分子印迹聚合物5,9、C186,10,11、石墨化碳黑7、HLB8。SPE及LLE溶剂消耗大，需旋蒸浓缩，操作费时。近年来随着检测仪器灵敏度的不断提高，样品前处理趋于简单化，QuEChERS前处理方法已成为农药多残留分析的首选方法12,13，并成为分散固相萃取（d-SPE）的“模板（template）”方法13，可根据分析物的物化性质及基质的种类而选择不同的分散吸附剂，但由于常用分散吸附剂N-丙基乙二胺（PSA）可吸附酸性农药，以 PSA 进行d-SPE净化的QuEChERS方法不适于酸性农药残留的测定12，采用QuEChERS方法测定毛豆中磺酰脲类农药多残留至今未见报导。本文考察了基于QuEChERS方法对毛豆基质的提取净化效果，建立了前处理操作简单、净化效果良好、快速灵敏的32种磺酰脲类除草剂多残留分析方法。1 实验部分1.1仪器与试剂1.1.1仪器API 4000 三重四极杆质谱仪（美国AB公司），配电喷雾离子源；1200 series 液相色谱仪（美国Agilent 公司）；T25 高速分散机（德国IKA公司）；Milli-Q高纯水发生器（美国Millipore公司）；Sigma 3-30K高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；XP205分析天平：感量0.01mg（瑞士Mettler公司）。1.1.2试剂PSA及 C18吸附剂：40 m（美国Agilent公司）。无水硫酸镁（MgSO4）、氯化钠（NaCl）、乙酸铵均为分析纯（上海国药集团）；甲醇、乙腈为色谱纯（德国Merck公司），甲酸为色谱纯（美国Fluka公司）。实验用水均为高纯水（经Milli-Q 超纯水器纯化）。1.1.3 32种农药标准溶液32种农药（见表1）标准品购自德国Dr. Ehrenstorfer公司（纯度97%），分别以乙腈配制浓度为100200 g/mL的各个农药标准溶液，再以乙腈配制浓度为1.0 g/mL的32种农药混合标准溶液，-18储存。1.1.4基质匹配标准溶液移取6份各0.5 mL 空白样品提取液于2 mL 离心管中，以弱氮气（N2）流吹至近干，分别加入50 g/L的32种农药混合标准溶液50、100、200、300、500 L，各补加乙腈至500 L，再各加10 mmol/L乙酸铵水溶液1.0 mL混匀，配制成1.67、3.33、6.67、10.0、16.67 g/L相应的基质匹配标准溶液，经0.2 m微孔膜过滤供LC-MS/MS分析, 基质匹配标准溶液现配现用。1.2样品前处理样品前处理基于未加缓冲盐的QuEChERS方法：称取10.00 g均质试样于50 mL具塞离心管中，加入20.0 mL乙腈、4.0 g无水MgSO4、1.0 g NaCl，高速均质1 min，于9500 r/min离心5 min，取上层溶液1.0 mL于预先加有50mg C18 及150mg无水硫酸镁的离心管（2 mL）中，涡旋30 s，以9500 r/min离心5 min，静置20 min，取0.5 mL滤液至离心管中，再加10mmol/L乙酸铵水溶液1.0 mL混匀，经0.2 m微孔膜过滤供LC-MS/MS分析。1.3色谱和质谱条件Waters XSELECTTM CSHTMC18色谱柱（2.1 mm150 mm, 3.5 m）；柱温30 ；进样体积10 L。流动相A为0.1%甲酸，流动相B为0.1%甲酸-乙腈；梯度洗脱程序：04 min，70 % A50 % A； 424 min，50 % A10 % A；2425 min，10 % A70 % A；2535 min，70 % A。流速为0.2 mL/min。电喷雾离子化，负离子模式；电喷雾电压：-4500 V；雾化气流速55 mL/min，辅助气流速55 mL/min，气帘气流速20 mL/min，离子源温度500 ，仪器工作软件为Analyst 1.5，扫描方式：按时间表的多反应监测（Scheduled MRM）,其他条件见表1。表1 32种农药的质谱参数、保留时间、定量限序号化合物监测离子对（m/z）去簇电压（V）碰撞能 (eV)保留时间 (min)定量限（g /kg）1氯磺隆Chlorsulfuron356.1/138.9*358.1/138.9-45-18-1810.510.32甲嘧磺隆Sulfometuron-methyl363.0/122.0*363.0/181.8-62-30-2110.035.03酰嘧磺隆Amidosulfuron368.1/258.9*368.1/108.9-40-17-2810.882.04甲磺隆Metsulfuron-methyl380.1/138.9*380.1/213.8-47-21-159.700.65噻磺隆Thifensulfuron-methyl386.0/138.9*386.0/219.8-44-25-169.021.46苯磺隆Tribenuron-methyl394.1/153.0*395.1/153.0-42-19-1912.382.07氟酮磺隆Flucarbazone-sodium395.1/127.9*395.1/112.8-45-18-3912.001.48丙苯磺隆Procarbazone sodium397.1/155.9*397.1/112.8-44-17-3412.550.79乙氧嘧磺隆Ethoxysulfuron397.1/258.8*397.1/153.9-55-18-3514.821.310醚苯磺隆Triasulfuron400.0/139.0*402.0/139.0-57-28-2810.300.211环氧嘧磺隆Oxasulfuron405.1/181.9*405.1/122.0-52-19-398.621.012嘧啶磺隆Flazasulfuron406.0/250.9* 406.0/179.9-51-20-1712.691.113苄嘧磺隆Bensulfuron-methyl409.2/253.9*409.2/189.9-51-16-2012.492.014胺苯磺隆Ethametsulfuron-methyl409.2/167.9*409.2/140.0-52-22-4310.843.015烟嘧磺隆Nicosulfuron409.2/153.9*409.2/228.1-55-25-206.701.416咪唑磺隆Imazosulfuron411.1/229.8*411.1/153.8-55-22-3112.693.317醚磺隆Cinosulfuron412.1/154.9*413.1/154.9-50-23-239.581.418吡嘧磺隆Pyrazosulfuron-ethyl413.1/231.9*413.1/154.0-58-23-3314.352.019氯嘧磺隆Chlorimuron-ethyl413.1/157.9*415.1/159.9-45-20-2014.923.320氟磺隆Prosulfuron418.1/139.0*418.1/251.9-60-28-2014.041.421环丙嘧磺隆Cyclosulfamuron420.2/238.9*420.2/264.9-47-16-1616.061.122四咪唑磺隆Azimsulfuron423.1/213.8*423.1/135.0-58-23-4311.412.523砜嘧磺隆Rimsulfuron430.2/185.8*430.2/274.9-63-18-2210.552.524氯吡嘧磺隆Halosulfuron-methyl433.0/251.9*435.0/253.9-57-28-2815.300.625三氟嘧啶磺隆Trifloxysulfuron436.1/280.8*436.1/153.9-75-24-2411.302.026甲酰胺磺隆Foramsulfuron451.1/295.9*451.1/267.9-64-19-328.081.327氟嘧啶磺隆Flupyrsulfuron-methyl464.1/178.9*464.1/219.9-51-18-2113.831.728甲基氟嘧磺隆Primisulfuron-methyl467.1/225.9*467.1/176.0-45-18-4415.702.029磺酰磺隆Sulfosulfuron469.1/288.0*469.1/154.0-84-26-4012.040.830氟胺磺隆Triflusulfuron-methyl491.2/235.9*491.2/195.9-59-23-4115.341.031甲磺胺磺隆Mesosulfuron-methyl502.1/346.9*502.1/266.8-54-21-3411.272.532碘甲磺隆钠盐Indosulfuron-sodium506.0/138.9*506.0/307.9-51-29-2313.210.4*：定量离子对2结果与讨论2.1LC-MS/MS 分析参数的优化磺酰脲化合物呈酸性，pKa在35之间，其酸性主要来自与磺酰基相连N原子上H的电离，在液相色谱流动相中加入0.1%甲酸，可抑制磺酰脲类化合物电离，从而改善峰形并提高分离效果，具体保留时间见表1。质谱采用电喷雾负离子电离，32个化合物均可获得丰度较高的M-H、M-Na母离子，优化的质谱参数见表1。文献4-9 采用电喷雾正离子电离，实验发现咪唑磺隆、甲基氟嘧磺隆、氟酮磺隆、丙苯磺隆、碘甲磺隆钠盐5个化合物采用正离子电离的响应值明显低于负离子电离。 应用Scheduled MRM扫描方式，可确保每个色谱峰有足够的采集数据点（每个色谱峰至少15点以上），保证色谱峰的良好峰型及重现性，并提高灵敏度，图1为按2.2节进行前处理的甜玉米加标样品的提取离子色谱图。图1 样品加标32种磺酰脲类农药（10 g /kg）的提取离子色谱图（峰号同表1）2.2 提取溶剂的选择磺酰脲化合物容易发生水解，其水解机制随化合物结构的不同和pH值的变化而变化，中性分子易水解，阴离子态分子水解较慢，酸可催化水解反应的进行3。毛豆基质加标样品（添加水平20 g /kg）采用1%乙酸-乙腈提取，苯磺隆、嘧啶磺隆、砜嘧磺隆的回收率为11.5% 39.2%，甲基氟嘧磺隆的回收率为65.1%，而采用乙腈提取，32种磺酰脲类农药的回收率为84.6% 108.2%，RSD 为1.2% 13.0%，因此本文采用未加缓冲盐的乙腈提取。2.3 分散吸附剂的选择玉米基质采用PSA进行分散固相萃取净化，32种磺酰脲类农药在3个添加水平10、20、100g /kg的回收率为038%，因此本文不选用PSA吸附剂。采用C18为分散吸附剂，32种磺酰脲化合物的回收率为回收率为86.0% 120.9%，相对标准偏差为1.4% 13.9%，所以本文采用C18为分散吸附剂。2.4方法评价 按照本文1.2节前处理并配制基质匹配标准溶液，在1.67g/L 167g/L 范围内32种化合物在毛豆基质中的基质匹配标准溶液的浓度与对应的峰面积呈良好线性关系，相关系数为0.99781.0000在毛豆基质中各添加10、20、100 g/kg的32种磺酰脲类农药混合标准溶液进行回收率试验，每个添加浓度重复测定6次，32种农药回收率为86.0 %120.9%，相对标准偏差为1.4 %13.9 %（见表2）。以10 g/kg加标样品定量离子对色谱信号3倍信噪比（S/N）确定方法检出限为0.11.8 g/kg，以S/N10确定方法定量限为0.25.0 g/kg（见表1），符合国内外残留限量要求1,2。表2 毛豆基质的加标回收率和相对标准偏差（RSD）化合物添加水平（g/kg）回收率（%）RSD( %, n = 6)氯磺隆1091.15.42098.06.410098.94.7甲嘧磺隆10101.3122098.58.210096.64.3酰嘧磺隆1092.85.52090.12.110092.93.4甲磺隆1097.72.12099.42.810098.11.6噻磺隆1094.53.82096.22.110098.91.9苯磺隆1078.85.42088.53.610096.45.0氟酮磺隆1080.04.62091.75.510095.13.5丙苯磺隆1090.03.02092.54.910096.22.6乙氧嘧磺隆1083.64.120861.910089.32.6醚苯磺隆1097.65.320101.52.310097.23.1环氧嘧磺隆1095.62.12093.73.210091.81.6嘧啶磺隆1087.64.12090.74.510092.01.8苄嘧磺隆1088.83.62093.63.110097.23.6胺苯磺隆1090.69.52095.47.2100101.43.2烟嘧磺隆1089.01.52090.41.910090.41.6咪唑磺隆1094.65.72096.83.210090.81.7醚磺隆1095.73.22099.93.710099.22.9吡嘧磺隆1092.65.32094.35.010098.12.1氯嘧磺隆L1087.23.02097.03.810096.65.0氟磺隆10101.03.42095.55.110094.64.4环丙嘧磺隆109112.32098.22.110096.62.0四咪唑磺隆10100.42.22092.54.410097.92.1砜嘧磺隆1080.76.02099.77.910090.84.6氯吡嘧磺隆1097.94.12093.42.410093.61.7三氟嘧啶磺隆1087.77.52093.74.8100100.54.6甲酰胺磺隆1088.72.52094.93.010096.42.7氟嘧啶磺隆1080.211.32087.48.810089.310.2甲基氟嘧磺隆1084.86.42091.43.810093.92.6磺酰磺隆1086.37.52094.47.7100101.94.5氟胺磺隆1089.52.72094.94.410096.43.1甲磺胺磺隆1086.46.72091.53.310097.73.3碘甲磺隆钠盐1094.03.22093.93.310095.22.03 结论采用未加缓冲盐的QuEChERS方法和C18分散吸附剂能有效去除毛豆基质中共提取基质干扰物而又不吸附磺酰脲类农药，结合液相色谱-电喷雾负离子电离-三重四极杆串联质谱检测技术，建立了毛豆中32种磺酰脲类除草剂残留的分析方法，方法简便、灵敏、准确、环保，适用于毛豆中32种磺酰脲类除草剂残留的定性定量分析。参考文献：1 GB/T 2763-2014, 食品安全国家标准食品中农药最大残留限量. 中华人民共和国国家标准2 庄无忌. 国际食品饲料中农药残留限量法规（ 卷）. 北京：化学工业出版社，20103 段 强，李 振，赵国玲，等. 农药研究与应用，2011, 15(1):13-164 Gure A, Lara F J, Moreno-Gonzlez D, et al. 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