毕业论文范文——罗氏沼虾BAC文库三维混合池的构建及性别相关基因筛选

毕业设计（论文） 题 目： 罗氏沼虾BAC文库三维混合池的构建及性别相关基因筛选 学 院：水产与生命学院 专 业：生物技术 班 级： 姓 名： 学 号： 指导教师：（教授） 年 月目录摘要1关键词1Abstract2Key words2引言3 1.材料与方法4 1.1实验材料4 1.1.1动物材料4 1.1.2BAC载体的介绍4 1.1.3实验仪器设备4 1.2实验方法5 1.2.1 PCR扩增引物设计5 1.2.2 罗氏沼虾性别决定相关基因的筛选6 1.2.2.1BAC文库的复制6 1.2.2.2一级混合池的构建6 1.2.2.3二维交叉筛选系统的构建8 1.2.2.4阳性BAC单一克隆的验证9 1.2.2.5阳性BAC克隆的鉴定11 2.实验结果11 2.1一级BAC池质粒的提取11 2.1.1 PCR筛选一级池11 2.2 二级混合池的构建与筛选13 2.2.1 构建二级池13 2.2.1 二级池混合池的筛选13 2.3 测序验证15 3.讨论15 3.1BAC文库的筛选方法15 3.2筛选库的注意事项16 3.3本研究的意义17 致谢18 参考文献192罗氏沼虾BAC文库三维混合池的构建及性别相关基因筛选 摘要：我们实验室以已经构建的罗氏沼虾的文库为基础， 通过对文库进行有序混合， 构建了混合池，通过两步三维的PCR筛选体系； 对罗氏沼虾性别决定相关的基因的序列设计特异性引物， 从文库中筛选得到单一的阳性克隆。利用FISH定位技术将包含性别决定相关基因的 克隆定位在罗氏沼虾的染色体上【1】。【实验目的】从已经构建的罗氏沼虾的BAC文库中快速筛选包含有性别决定相关基因的阳性BAC克隆。【实验方法】对已经构建成功的罗氏沼虾 BAC 文库，我们接着构建它的三维混合池。对于我们要筛选的目的基因，每个基因分别设计 1 对特异性的引物，然后进行 BAC 文库的筛选。当从BAC文库中筛选出阳性克隆时，对含有目的阳性 BAC 克隆进行末端测序，获得与罗氏沼虾性别决定相关基因的基因组 DNA 序列，并对其进行进一步的分析以及研究。【实验结果】在实验中，我们使用两步三维PCR筛选系统对BAC文库进行了筛选。首先，我们以每个384板为单位构建了522个以及混合池，通过对一块384孔的微量滴定板中的每个克隆进行接种培养并将菌体混合提取BAC质粒DNA作为一个一级混合池。对5个罗氏沼虾的相关基因设计特异性引物并以一级池为模板进行PCR扩增，筛选得到了相应的一级池的阳性克隆。筛选到IAG基因的阳性BAC克隆为11个，Dmrt基因的阳性BAC克隆为10个，E1M5基因的阳性BAC克隆为7个，E5M2基因的阳性克隆为8个，TAP基因的阳性克隆为10个。接着，我们又对每个已经筛选出来的阳性克隆构建了二级池，进行复筛。【实验结论】在我们的实验过程中，我们通过构建三维混合池快速筛选【2】包含目的基因的单个阳性 BAC 克隆，建立了罗氏沼虾目的基因克隆的辅助平台；性别相关基因组基因组中位于内含子区的反转录转座子插入导致基因长度增加，可能是影响该基因转录水平的关键变异。关键词：罗氏沼虾、BAC文库、三级混合池、性别决定相关基因、促雄性激素、IAG基因Construction of BAC library three-dimensional mixing pool and gender related gene screening；Roche spermatogenesAbstract In our laboratory has been built roche spermatogenesis of BAC library as the foundation, through to the library an orderly mixed, build a mixing pool, by two-step three-dimensional PCR screening system; Sex determination of roche spermatogenesis related gene sequence specific primer design, from a single library screening positive clones. Using FISH positioning technique will include gender related gene cloning location B A C in roche spermatogenesis of chromosomes in 1. From experimental purpose 】 【 has built roche spermatogenesis rapid screening in the BAC library contains a gender related genes of the BAC clones were positive. 【 method 】 for building a successful roche spermatogenesis BAC library, we went on to build its 3 d mixing pool. For us to screening of genes, the purpose of each gene design 1 pairs of specificity, and then to BAC library screening. When screening positive clones from the BAC library, the purpose of to contain positive BAC clones of the terminal sequencing, sex determination and roche spermatogenesis related genes of genomic DNA sequence, and carries on the further analysis and research. 【 results 】 in the experiments, we use two step 3 d PCR screening system of BAC library screening. First, we constructed in every 384 board 522 and mixing pool, based on a 384 - well microtiter plate of each clone to vaccinate training and mix bacteria to extract the BAC plasmid DNA as a primary mixing pool. Design of five roche spermatogenesis related gene specific primers and pool in as a template for PCR amplification, filter to get the corresponding primary pool of positive clones. Screening to IAG gene positive BAC clones for 11, 10 Dmrt gene positive BAC clones, E1M5 gene positive BAC clones for 7, positive E5M2 gene cloning for eight, TAP for 10 positive cloning of the genes. Then, and for each of us already filtered positive clones constructed the secondary pools, on screen. 【 conclusion 】 in the process of our experiments, we mixed by building a three-dimensional pool rapid 2 contains a single gene screening positive BAC clones, established the roche expounds the purpose gene clone of auxiliary platform; Gender related genome is in the reverse transcription of introns in the genome transposon insertion gene length increase, may be the key to influence the gene transcription level variations.Keywords: Roche spermatogenesis, BAC library, level 3 mixed pool, sex determination genes, promote the male sex hormone, Dmrt genes 引言：罗氏沼虾属于长臂虾科，沼虾属，主要分布在印度太平洋热带和亚热带地区，是世界上比较大型的淡水虾之一，生存在淡水和咸淡水水域。它具有很大的养殖经济意义，主要是因为它的个体庞大、生长较快、肉质鲜美、易于养殖等优点。随着上个世纪六七十年代人工养殖技术的兴起和发展，它被先后移养于亚洲、欧洲、美洲等地区，截止现在，已经成为世界淡水虾养殖的主要对象。而我国于上个世纪七十年代由日本引进中国，目前已经得到了大面积的推广养殖。其肉可制成高蛋白营养水产品或者海味品，营养价值极高。所以，研究罗氏沼虾性别决定机制具有重大意义。众所周知，虾是世界上最具经济效益的水生生物之一。但是最近几年，罗氏沼虾的水产养殖业已经被一下几个方面的因素所威胁，包括野性的性成熟个体和爆发性毒性与细菌性疾病几个因素【3】。因此为了这个产业的可持续性，遗传学上的改善项目被迫切的需要。目前， 关于罗氏沼虾性别决定的研究取得了一定进展：首先我们已经知道罗氏沼虾的性别决定方式为ZW/ZZ型【4】，但其性别决定具体的分子机制目前尚未阐明。已经了解一下几个基因可能与罗氏沼虾的性别决定有关，Dmrt基因家族是一类转录调控基因，我们已经在许多的生物物种中都检测Dmrt的存在【5】，了解到它通过锌指结合的方式与DNA序列特异的结合，对于性别决定和分化的调控起着重要的作用【6】；研究也已经发现，伴生在甲壳动物雄性生殖腺附近的促雄性腺，对于调控雄性的性别分化、维持第二性征以及在生殖生理中具有着重要作用，而促雄腺的作用主要是因为于它所分泌的促粗雄性激素【7】。 同时，作为一个基本的资源，基因组序列提供了更大的对虾的基本生物学的理解，并且在它们的选择育种时可以被应用。在过去的几年，虾的基因组研究已经快速的发展。大量的AFLP、SSR、SNP已经发展并且被评估，斑节对虾、日本囊对虾、南美白对虾、中国对虾的框架遗传连锁图已经被构建【8】；一个大的表达序列标签的聚集已经被做，超过186000个序列标签可以利用；几个大的工程任然在不断进行，例如斑节对虾序列标签工程和ShEST-白虾标签基因组工程；还有几百个基因被克隆；芯片和RNA干扰技术被广泛的应用在虾的基因表达中【9】。然而，关于白虾基因组的研究被阻断和分离。对功能基因、数量性状位点、物理图谱构建和大规模的基因组测序没有有效的DNA marker,而大片段的白虾细菌人工染色体被基因组分析和基因定位克隆、物理图谱构建、和十年前已经被计划的基因组测序所需要，对白虾物种而言，没有高质量的大的插入片段BAC文库被报告或者可以被大众所利用。以下几个因素有助于推动在罗氏沼虾BAC文库方面短缺的进程【10】。首先，沼虾有相对大的基因组。罗氏沼虾虾的基因组大小大约为人类基因组的三分之二，有将近两亿个碱基对。因此，构建虾的另一方面，对构建大的插入片段的白虾BAC文库有许多不为人知理由，这也是非常困难的。尽管有许多研究组做了大量的努力，有一个55kb的插入片段的BAC文库和两个F末端库已经被构建。但是任然没有一个可以利用的虾的BAC文库。基于文库较大的克隆片段，所以更少的克隆被需要去代表全部的基因组序列，更少的重叠部分被需要去做跨基因组物理图谱；这些小的片段文库并不适合物理图谱的构建和基因的阳性克隆。BAC文库的更加新的发展和更为有效的方法是一种迫切的需要。 这里，我们报告了大的插入片段BAC文库的构建和对已经构建成功的BAC文库进行筛选，并且利用这个文库去分离一系列包括性别相关的基因。这个BAC文库将提供一个有力的工具，对虾或者其他相关物种高级的遗传学和基因组的研究有很大的促进作用。本研究在罗氏沼虾BAC文库中筛选出含有性别决定基因序列的单一阳性克隆，并通过BAC-FISH技术成功将此基因定位到罗氏沼虾有丝分裂中期分裂相中【11】，为这些基因的后续进一步深入研究打下了坚实的基础，同时对该生物的染色体鉴别工作起到了推动作用。 在之前的研究中，已经有学者对部分罗氏沼虾的性别决定相关基因进行了克隆和表达的研究，而对这些基因在染色体上的定位将会有助于促进对这些基因功能更加深入的研究，而荧光原位杂交技术（FISH）是对于基因在虾的染色体上定位最直接有效、快捷的方法。而我们已经构建了高质量的罗氏沼虾BAC文库， 使得以BAC质粒为探针的FISH技术大量应用变成了现实，为单和低拷贝功能基因的染色体定位提供可靠的探针来源。BAC文库筛选系统是获取单一阳性 克隆的必备工具， 通过对文库进行有序混合， 构建文库两步PCR筛选系统【12】，可以实现单一阳性 克隆在文库中准确、 高效的筛选， 这不仅可为染色体定位提供探针， 同时对于物理作图、 图位克隆、 分子标记发掘等工作有重要的作用。（2）已经构建的罗氏沼虾的BAC文库的基本情况：我们已经构建的罗氏沼虾的BAC文库中大约包含有20万个克隆，每个BAC克隆的差诶片段大小分布在50260kb之间（如图1所示），平均片段大小分布在130kb左右，文库大约包含有5个沼虾的基因组大小。图1：BAC 文库插入片段大小分布情况1、材料与方法 1.1 实验材料1.1.1 动物材料实验用的性成熟的雌雄罗氏沼虾给60只，购买于上海市芦潮港的海鲜市场，其长度大约为11-13cm，重约为21-29g。购买带回到实验室后，再饲养三天，然后开始采样。通过在其第一腹窦使用改良的阿氏等体积作为抗凝剂进行血细胞采样；然后血液细胞通过在4oC中离心，800g 大约5分钟，在MAS清洗两次，然后再次悬浮在1倍的HB buffer之中。样品被立刻保存于液氮中，然后保存于80oC冰箱知道再次使用。然后使用该样品进行BAC文库的构建。此工作已经与2015年2月完成。已经构建完成的BAC文库保存于522个384孔的冻存板上。插入片段约为150kb左右，覆盖罗氏沼虾的基因组大约5倍。 1.1.2 BAC载体的介绍 pECBAC1载体被用来构建BAC 文库。载体DNA 通过碱裂解的方法被分开。通过两轮的氯化铯 梯度的纯化离心，用Hind3 酶全部消化，用牛小肠碱性磷酸酶去磷酸化。这个消化的载体被沉淀、用TE溶解成10ng/ul,并且保存在-20冰箱中。 1.1.3 实验仪器与器材：双人单面超净工作台：苏州净化设备有限公司 全自动加样工作站：美国PerkinElmer公司 384柱微柱复制器：美国 Bio-Rad 公司 384-well冻存盘：美国 Bio-Rad 公司 96-well深孔板：美国 Bio-Rad 公司 81000L电动移液器：美国Thermo公司 810L移液器：美国Thermo公司 -80超低温冰箱：日本Sanyo公司 制冰机：日本Sanyo 公司 全温振荡器：哈尔滨东联电子技术公司 37恒温培养箱：日本Sanyo 公司 台式高速冷冻离心机：德国Heraeus公司 冷冻离心机：美国Beckman公司 ELITE 300电泳仪：美国Wealtec公司 Milli-Q超纯水系统：美国Millipore公司 恒温水浴锅：德国Huber公司 BS-25透气封板膜：美国AeraSeal公司 旋涡混合器（Vortex-Genie® Mixer）： BS-25透气封板膜：美国AeraSeal film公司1.2 实验方法 1.2.1 pcr扩增引物设计 在这个实验中，我们主要针对罗氏沼虾6个相别决定相关基因设计特异性扩增引物，用以阳性BAC克隆的筛选。引物均由上海美吉生物科技有限公司合成。引物序列如下表所示：引物名称 引物序列 Tm 片段大小（bp）IAGR, 5_CTTCCCGCTGCTTTAGTA _358420R, 5_AGATGTTGTTGCGTGTAA _3DmrtF, 5_ CAAAATGTTCCGTCGAAGCAG_362354R, 5_CTGT AGAAC ACAAGCCCCTCC_3E1M5F, 5_CTCATACCTTTCCTCACGTATA _358200R,5ACCGAGAGAGATTGTGGGAGAA_3E5M2F, 5_CGCCACCCAAAATAGTAA _352420R, 5_ AGTTCACGAAAGATGCCA_3TAPF, 5_ TCTGAGTGACCAAGAAACGA_357394R, 5_ GAACCTAACTACGGGGGACC_3表1:罗氏沼虾6对引物序列信息情况1.2.2罗氏沼虾性别决定相关基因的筛选 BAC 文库为单克隆，并保存于 384 孔板中，根据最小二乘法原理计算可知，进行 BAC 文库三维混合池筛选的最少筛选次数为 160 次。为便于操作，按照设计好的混合模式，进行混合池构建，最终获得层池（FP）48 个，行池（RP）64 个，列池（CP）48 个。其中， FP 和 CP 的每个混合池各代表 3 072 个单克隆，RP 的每个混合池代表 2 304 个单克隆。采用一步法PCR 对 160 个混合池进行筛选， 即可实现对整个 BAC文库的筛选，从而实现候选阳性克隆的三点快速定位（图 2） 。 单克隆 BAC 文库经扩繁后用 Genetix QPix2系统进行混池操作。 图2：罗氏沼虾BAC文库三维混合池构建以及三点定位模型图 1.2.2.1 BAC文库的复制 使用全自动加样工作台，向384-孔冻存盘每孔中加入60L细菌冻存培养基（含氯霉素12.5g/mL），置于超净工作台上待用。-80超低温冰箱中取出罗氏沼虾BAC文库原盘，常温解冻。取出384柱微柱复制器，分别在70%、100%乙醇中消毒处理，然后酒精灯外焰灼烧2min，冷却后与文库原盘每孔一一对应插入，小心搅动数次移出，再与加有60L细菌冻存培养基（含氯霉素12.5g/mL）的384-孔冻存盘每孔一一对应插入，小心搅动数次移出。编号P1，37恒温培养箱中培养过夜，-80超低温冰箱中保存。后续521盘，同样方法复制，分别编号P2、P3、P521。 1.2.2.2 一级混合池的构建和筛选（1）一级混合池的混合：一块384-well冻存盘中全部克隆混合在一起，作为一个一级池（即 384 盘池）。具体构建方法如下： 用81,000L电动移液器向96-well深孔板，每孔中加入870 L LB培养基（含氯霉素12.5 g/mL）。 取出一块384-well冻存盘，常温解冻，用810 L移液器将384-well冻存盘的每4个孔接种到96-well深孔板中，每孔接种菌液5 L。 透气封板膜将培养盘封好，恒温振荡培养箱中， 250rpm、37培养24 h。 用12300 L移液器从96-well深孔板中，每孔吸取800 l菌液混合在一起，共计76.8mL。 将混合菌液分装于2个50mL离心管中，分别标号Px（x为相应384-well冻存盘编号），每管38.4mL，5,000 rpm，离心10min。 去除上清，保留少许培养基，用移液器吹打沉淀，后转移至2个新的1.5mL离心管中（标号与50mL离心管相同），5,000 rpm，离心10min。 去除上清，超净工作台上晾干，-80保存备用。 后续521盘，同样方法构建一级池，并对应标号。（2）一级池BAC质粒的提取使用碱裂解法提取一级池BAC质粒DNA，具体方法如下：从-80超低温冰箱中取出混合好的一级池的其中一份，在4冰箱中解冻，加入无菌水至1mL，震荡混匀，取100L转移至新的1.5mL离心管中，剩余菌液4保存。 将加有100L混合菌液的1.5mL离心管，5,000rpm离心10min，去除上清，尽量不留有液体。加入200L溶液P1，移液器吹打，再充分涡旋混匀，并在冰上孵育5min。加入400L溶液P2，立即上下轻轻颠倒混匀，在冰上孵育5min，可见溶液澄清。加入300L溶液P3，立即上下轻轻颠倒混匀，并冻结在 - 80 15min。在室温下解冻，然后12,000rpm离心15min，离心管底可见白色沉淀。吸取750L的上清液转移到新的1.5mL离心管中，加入450L的异丙醇，混匀，12,000rpm离心5min，沉淀BAC质粒DNA。 去除上清，用70乙醇洗涤沉淀，在每个离心管中加入1mL 70%的乙醇，然后以12,000 rpm离心2min，并去除乙醇上清液。注意，去除乙醇上清液时，动作要小心，因为离心管壁上的DNA沉淀颗粒很容易脱落，而造成失去。将离心管置于超净工作台上，干燥DNA沉淀（15 30min），加入40L TE（pH=8.0），溶解DNA。可在65水浴中孵育10min，以促进DNA溶解于TE中。 1%琼脂糖电泳，检测一级池BAC质粒DNA提取情况。（3）一级池PCR的筛选 以一级池混合 BAC 质粒DNA 为模板，以设计的特异性引物进行PCR 扩增筛选。PCR 反应体系： 模板1.0l；正向和反向引物（10mM）各0.5 L； Taq DNA聚合酶（5U/L）0.2 L； 10PCR Buffer 1.5 L； dNTP（各2.5 mM） 1.5 L；加去离子水至10L，如下表所示。1%琼脂糖电泳检测，筛选出阳性一级池。其pcr程序如下图3示： 表2： 试剂名称 加入量 反应条件2Power Taq PCR MasterMix 5ul 95 5min F 0.5ul 95 30s R 0.5ul 55 30s 30循环 72 90s DNA模板 1ul ddH2O 3ul 72 15min 4保存 图3：PCR反应程序图 1.2.2.3 二维交叉筛选系统 （1）二级混合池的构建1 取4块96-well深孔板中，编号为A1、A2、B1、B2，用81,000L电动移液器分别向其每孔中加入870 L LB培养基（含氯霉素12.5 g/mL）。2 取出一块筛选得到的阳性384-well冻存盘，常温解冻，用810 L移液器将384-well冻存盘的每个孔接种到4块96-well深孔板相应的每孔中（按图2-1中所示规则）每孔接种菌液5 L。3 透气封板膜将培养盘封好，恒温振荡培养箱中， 250rpm、37培养24 h。4 用12300 L移液器吸取A1和A2 96-well深孔板中第A行的菌液（即384-well冻存盘中对应第A，行），每孔400 L，共计9.6mL，混合后装入15mL离心管中，编号为R-a；相同方法混合B1和B2 96-well深孔板中第A行的菌液（即384-well冻存盘中对应第B行），编号为R-b；384-well冻存盘中对应第C行至第P行分别编号记为R-c至R-p，共计16个二级行混合池。5 用12300 L移液器吸取A1和B1 96-well深孔板中第1列的菌液（即384-well冻存盘中对应第1列），每孔400 L，共计6.4mL，混合后装入15mL离心管中，编号为L-1；相同方法混合A2和B2 96-well深孔板中第1列的菌液（即384-well冻存盘中对应第2列），编号为L-2；384-well冻存盘中对应第3列至第24列分别编号记为L-3至L-24，共计24个二级列混合池。6 以上行、列共40个二级池，5,000rpm离心10min。7 去除上清，保留少许培养基，用移液器吹打沉淀，后转移至新的1.5mL离心管中（标号与15mL离心管相同），5,000 rpm，离心10min。8 去除上清，尽量不留有液体，4暂时保存。 （2）二级池BAC质粒的提取：方法与一级池的质粒提取方法基本相同。 （3）二级池PCR筛选： 以40个二级池混合 BAC 质粒DNA 为模板，雌、雄半滑舌鳎基因组DNA和灭菌超纯水为模板作为对照，以特异性引物进行PCR 扩增筛选。PCR 反应体系： 模板1.0l；正向和反向引物（10mM）各0.5 L； Taq DNA聚合酶（5U/L）0.2 L； 10PCR Buffer 1.5 L； dNTP（各2.5 mM） 1.5 L；加去离子水至15 L。PCR反应程序：Tm为引物退火温度。1%琼脂糖电泳检测，筛选出阳性单一克隆。1.2.2.4 阳性BAC单一克隆的验证为了进一步验证筛选到的克隆含有目的基因，以阳性 BAC单克隆提取的质粒DNA为模板，以特异性引物进行PCR 扩增筛选。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后按照胶回收试剂盒(Zymocleam Gel DNA Recovery KitTM，TING GEN)回收，纯化后的片段连接到pMD18-T 载体，转化到E. coli 菌株上。利用M13通用引物进行PCR 扩增检测，取阳性克隆测序。（1）PCR产物的纯化1 PCR产物经1%琼脂糖电泳。2 切下目的条带于1.5mL离心管中，向其中加入3倍体积的ADB buffer。3 在60（55）条件下水浴，孵育10min溶胶。4 将溶解好的液体全部转移至吸附柱中，12,000rpm离心30s。5 向吸附柱中加入200L DNA Washing buffer，12,000rpm离心30s。6 重复步骤5一次。7 取出吸附柱，放入新的1.5mL离心管中（不用晾干）。8 加入10L 灭菌超纯水，室温溶解2min，12,000rpm离心30s。9 取3L，1%琼脂糖电泳检测纯化效果 （2）目的片段与载体的连接以及转化回收得到的纯化目的片段连接到pMD18-T 载体上。 反应体系：模板1.0L；Solution 5.0L；pMD18-T 载体0.3L；加去离子水至10L。16水浴连接2h，4暂存备用。（3）重组DNA的转化a) 将感受态细胞（100L/管，可转化连个重组DNA）从-80超低温冰箱中取出，冰上解冻。b) 取出50L加入到新的1.5mL离心管中，动作要小心，将连接产物10L加入其中，轻轻混匀（均在冰上进行）。c) 在冰上静置20mind) 42水浴热激90s，迅速置于冰上静置2min。e) 向离心管中加入600L LB液体培养基（不加抗生素）。f) 37恒温震荡培养箱中，200rpm培养50min1h。g) 取含有amp的固体培养基平板1个，向其中加入50L摇动产物。 h） 涂抹均匀，将平板倒置于37恒温培养箱中，培养过夜（1016h） （4）挑克隆检测1. 在1.5mL离心管中加入1mL LB液体培养基（含有amp）2. 超净工作台上，用10L 枪头挑取单菌落，置于离心管中。图3：接种示意图3. 37恒温震荡培养箱中，250rpm培养23h。4. 以摇动产物为模板，做菌液PCR，反应体系：模板1.0l；M13通用引物正、反向（10mM）各0.5 L； Taq DNA聚合酶（5U/L）0.2 L； 10PCR Buffer 1.5 L； dNTP各2.5 mM） 1.5 L；加去离子水至15 L。5. 1%琼脂糖电泳检测扩增产物。（4） 菌液测序选取电泳检测阳性结果，菌液送美生物公司测序，与基因组序列比对，以确定筛选到的阳性BAC克隆是否含有目的基因序列。1.2.2.5 阳性BAC克隆的鉴定 当我们已经完成了BAC文库的构建工作时，我们需要对已经构建的文库的质量进行评价。而我们进行评价的标准是以文库插入片段的大小、文库中克隆的数量、细胞器DNA的含量、以及假阳性克隆的含量【13】的鉴定。具体的鉴定方法和步骤如下：从已经构建的文库中随机挑选一定量的BAC克隆，裂解细菌细胞、提取质粒DNA，然后进行酶切，使用脉冲电泳检查其插入片段的大小。最后以Southern杂交来检验BAC克隆插入片段是否来源于原材料。检验库中的假阳性克隆，以确保证库的质量【14】。检验BAC文库的质量主要依据以下几个方面：（1）BAC克隆的稳定性鉴定在我们已经构建的文库中挑选几个较大的BAC克隆（分子量分别为150kb和250kb），分别将其接种在培养基上，连续继代培养后，分别提取第0代和第100代BAC克隆的质粒DNA，酶切后用脉冲电泳检查BAC克隆中外源DNA在继代培养中是否存在和发生突变。（2）检查BAC文库是否含有细胞器DNA的污染细胞核DNA文库混杂细胞器DNA的污染，不仅会降低实际库容量，还可能会误导染色体步查走向错误方向。采用脉冲电泳纯化法【15】制备高纯度大分子量DNA，进行BAC文库的构建，可以从根本上避免细胞器DNA的污染。同时以线粒体基因为探针与BAC克隆进行菌落原位杂交，检验BAC克隆有无细胞器DNA的污染。2 实验结果 2.1 一级BAC池质粒的提取本实验共构建一级池混合池522个，从以下两个方面可以说明我们已经构建的BAC文库是可以进行筛选的。（1）提取BAC质粒DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示522个质粒均有条带，说明已经构建的BAC一级库无空池，进一步说明构建的BAC文库的空载率很低，完全符合进一步的筛选条件。（2）我们也对522个以及混合池进行了质粒提取，并且对已经提取的每一个BAC质粒进行了浓度检测，结果发现，522个质粒DNA的浓度都在2000ng/ul以上，完全满足筛选条件。 2.1.1 PCR 筛选一级池 以一级混合池BAC质粒DNA为模板，筛选罗氏沼虾性别决定相关的功能基因，为确保一级池能够多次使用，我们不仅在筛选中严格防止质粒被污染，而且对模板浓度进行了多次探索，结果显示稀释4倍后扩增条带最为理想，并且在之前我们对每个BAC克隆所提取的质粒DNA进行了浓度检测。（1）对于所选择的罗氏沼虾的5个基因，设计引物进行筛选，各基因筛选得到阳性一级池结果统计见表4.结果发现，除了Dmrt基因未能够筛选出阳性克隆之外，其他四个基因都筛选除了阳性克隆。表格4罗氏沼虾一级库性别相关基因的筛选结果表达序列 筛选的上游引物 下游引物 片段大小 退火温度 BAC 克隆数 （oC） IAG11 F, 5_ CTTCCCGCTGCTTTAGTA3_3 420 58R, 5_AGATGTTGTTGCGTGTAA_3TAP10F, 5_ TCTGAGTGACCAAGAAACGA_331059R, 5_ GAACCTAACTACGGGGGACC_3E5M28F, 5_ CGCCACCCAAAATAGTAA_31020 58R, 5_AGTTCACGAAAGATGCCA _3E1M57F, 5_CTCATACCTTTCCTCACGTATA_3260 61R,5_ACCGAGAGAGATTGTGGGAGAA_3Dmrt0F, 5_ CAAAATGTTCCGTCGAAGCAG_3170 62R, 5_CTGT AGAAC ACAAGCCCCTCC_3表4：每个基因阳性一级筛选克隆表达序列阳性编号 IAG35 56 199 208 280 310 333 335 345 453 516TAP 32 176 196 212 217 223 244 330 399 433 E1M523 85 152 194 243 321 378 E5M218 50 175 253 319 367 403 521Dmrt无 2.2 二级池的构建及筛选2.2.1二级混合池的构建 在对6个基因的一级池筛选完成之后，我们进一步着手二级池的筛选。由于时间有限，加之复筛的工作量比较大，所以不可能同时在很短的时间内对6个基因同时进行复筛。故我先对罗氏沼虾的IAG基因进行了复筛。首先，我选取IAG基因的阳性一级池共11个，用于构建二级横竖混合库，其中每个一级池可以构建行池16个，列池24个。 2.2.2二级混合池的筛选 在对IAG基因复筛的过程中，我们构建了11个二级库，总共用了两周时间筛选结束。结果发现在11个一级阳性克隆中，仅有三个一级阳性克隆所构建的二级库出现了阳性信号，所以我们可以知道，其他的8个一级阳性克隆均为假阳性信号。二级库筛选时，出现阳性信号的分别为310号、333号、516号，其每个筛选电泳图如下图所示：图1：第310号二级库IAG基因的复筛结果电泳图 图2：333号二级库IAG基因的复筛结果电泳图 图3：:516号二级库IAG基因的复筛结果电泳图二级库筛选时，出现阳性信号的分别为310号、333号、516号，其每个筛选电泳图如下图所示：由以上的电泳结果图顺序我们可以得知，每一个二级横纵库的筛选结果如下表5所示：表5：二级库筛选结果二级库编号纵库筛选结果横库筛选结果31012J33322H51613K 这样，我们就可以将每个阳性信号具体的定位到每一个384孔微量滴定板的一个具体的位点上，从而确定了对应的阳性BAC克隆。2.3 测序验证 在前面已经将二级库出现的三个阳性信号分别定位到对应的三个384孔的具体的三个位点之上。而在接下来的实验我们要将那三个BAC克隆于加有X-gal的培养基上进行过夜培养，然后分别挑选那三个位点的单克隆细菌，进行扩大培养，然后将扩大培养之后的菌液送至生物公司进行目的片段的测序。 对筛选到含有各基因的阳性克隆，以相应特异性引物进行PCR扩增，所得纯化产物。经测序分析显示，均得到预期的片段大小，经过 Blast 比对属于罗氏沼虾的各相应基因，进一步证实了筛选到的单一阳性克隆确实包含其相应基因。但由于时间紧迫，到目前为止，菌液测序结果仍然没有得到。3.讨论 罗氏沼虾(Macorbarhcuimosrnebegr),是一种重要淡水养殖虾类,与雄性生殖相关基因表达特征研究尚属空白【16】。生殖相关基因的表达特征研究尚属空白。就目前而已，关于其他物种性别决定方面的研究报道已经很多，但是在罗氏沼虾的性别决定方面的研究，特别是在IAG基因、Dmrt基因等方面的研究的确较少。即使之前有过研究，但是由于基础研究的相对薄弱，很多研究仍然处于起步阶段。但是随着生物信息学和基因组测序技术的不断发展，我们知道通过基因组BAC文库的筛选是目前对性别决定相关基因的发掘和基因结构功能解析的重要手段【17】。基因组 BAC 文库的空载率决定其基因组覆盖率效率和筛选。通过构建三维混合池对本研究所用大麦基因组 BAC 文库的空载率初步进行了评估，一方面验证了利用 PCR 方法进行混合池筛选的可行性，证明通过对 522个混合克隆池进行一轮 PCR 检测， 即可实现对整个 BAC 文库的筛选，并确定候选单克隆。关于无脊椎动物性别发育的基因水平的研究已经取得了一定的进展，sxl基因是模式生物果蝇雌性个体进行生长发育的一个十分重要的基因，与此同时，卵巢的发育和是否性成熟也与其有着密切的关联；Dmrt基因对于果蝇雌雄个体的正常发育也起着重要的作用，同时其他的昆虫和水西动物的同源基因也被认为与性别发育和生殖腺的发育密切有关。IAG即去雄性激素， 就目前而言，关于其研究主要集中在等足目和十足目两大类甲壳生物中。目前我们已经获得了其他青虾类的IAG全长的cDNA序列；对该激素做组织分布检测发现，它主要分布在促雄腺和储精囊中；并且发现其基因表达水平与该生物的成熟期交配行为相关，并且发现在交配器显著表达【18】。 3.1 BAC文库的筛选方法 目前对于BAC 文库的筛选方法，主要分为两种:杂交筛选法19和基于 PCR 的池化筛选法。杂交法使用同位素进行探针标记，敏感度高但受限于放射性危害和半衰期短等的影响20，而PCR 的池化筛选法筛选的规模大、效率高、安全无毒而被大多数人所采用。BAC文库的池化筛选方法较多，选择合适的方法成为影响实验效率的关键。本研究中采取的方法是针对制备BAC-FISH探针所需的阳性单克隆而进行优化的筛选方法。前期构建的一级池时，仅进行盘池构建，而不进行高度浓缩的一级行、列池构建，此法既可以节省建池所需时间和成本，更重要的是可以减少因浓缩程度过高而造成阳性克隆的丢失。在筛选得到阳性盘后再构建二级行、列池进行PCR筛选，可迅速确定单一阳性克隆，且最大程度避免出现假阳性的可能性。在对一、二级池进行筛选过程中均是以提取的BAC质粒DNA为模板进行扩增的，这样做可以避免菌液 PCR因含有较多的杂蛋白对PCR准确性的影响。3.2筛选文库是的注意事项：在BAC文库筛选体系构建过程中，需要注意以下几个事项： 避免对BAC文库的污染、减少误操作。在BAC文库的复制过程中，须小心谨慎，避免文库的污染，尤其是原文库，若产生污染将是难以补救的。文库混合是工作量大、操作繁琐的一个过程，易出现误操作，造成错误克隆的混合，在实验时要尽量避免漏混、错混及重复混合。发现错误操作及时记录，必要时重新接种混合。细菌培养时，避免临近克隆相互污染。96-well深孔板各孔紧密相连，在培养箱中较高速度振荡培养时，若加入培养基过多就易出现相互串样污染，故培养基加入的量不应超过深孔板容量的2/3。透气封板膜的使用既为了防止各孔之间的污染，又可以避免因液体蒸发过多而影响菌液量。一级池质粒提取前需加入适量无菌水，混匀后，取出部分用于提取质粒。这一过程中，加入的水一定要保证无菌，否则剩余部分污染，将无法使用；一级池的浓缩程度较高，混合要保证均匀，否则容易造成克隆丢失，影响阳性检出率。 BAC质粒DNA的提取时，为保证所有克隆的质粒均能提取出来，要对质粒提取方法进行改进，具体步骤参见实验方法。此外，由于BAC质粒的单低拷贝特性，要想得到较高浓度的质粒DNA，细菌的培养时间较为重要，本实验中采用的24h能保证获得较大的细菌数量；由于BAC克隆的片段较大，加入裂解液和中和液后的混合，一定要轻柔，否则易造成质粒DNA的断裂，影响回收效率。 有报道中指出文库筛选时，可直接进行菌液PCR，这样便可以省去繁琐的BAC质粒提取而是筛选工作更为简单、快捷。在本实验中，尝试对浓缩程度较低的二级混合池进行菌液PCR，效果很差，均未筛选出结果，而对同一份菌液提取BAC质粒DNA后进行扩增，得到理想的结果。由此，BAC文库的筛选，质粒提取是不可省略的步骤，这可能与BAC克隆的自身特性有关。进行筛选时，BAC质粒DNA模板很多，特别是浓缩程度高的一级池，特异性引物在PCR扩增过程中，可能会有与目的片段大小不同的非特异性片段的出现，因此，增加基因组DNA作为模板的阳性对照是保证筛选准确性的必要手段