实验一收集动物组织的活细胞—RH.ppt

实验一 收集动物组织的活 细胞并计数和测定成活率 问 题 如何知道每升血液中红细胞、白细胞、血小板 的数量？ 如何知道水样中某小型生物的数量？ 如何知道发酵液中啤酒酵母的密度？ 如何知道生物制剂生产罐中细胞的密度？ 实验目的 学习机械分离法获得动物组织的活细胞 学会使用血球计数板测定细胞悬液的细胞密度 掌握活细胞和死细胞的鉴别方法 收集动物组织的活细胞 从组织中分离单细胞的方法有多种： 对于较为柔软的组织（如肝脏、脾脏），可以采 用机械研磨的方法分离细胞，但这会造成一些细 胞的损伤而降低细胞的成活率； 对于比重差异较大的细胞，可以采用离心的方法 来分离，例如血液中各种血细胞的分离； 对于股骨中骨髓细胞的分离，则可以采取冲洗股 骨腔的方法获得。 实验材料 小鼠 小鼠的抓法： 从鼠笼内将小鼠尾部抓住并提起，放在磁盘上或报 纸上。 小鼠的处死：颈椎脱位法 右手（左手）抓住鼠尾用力向后拉，同时左手（ 右手）拇指与食指用力向下按住小鼠头部，在颅 骨基部的后侧与颈椎两侧，施加压力，使头颅和 脑一起与脊髓分离。当脊髓与脑分离时，伴有大 量的肌肉活动。经研究证明，这种方法能使实验 动物对痛觉不再敏感。 脾脏淋巴细胞悬液的制备 1.机械分离法 用镊子将脾脏置于尼龙布上，用注射器推棒轻轻 挤压组织，使细胞分散。将尼龙布置于玻璃漏斗 中，用D-Hanks 液冲洗尼龙布，收集细胞悬液于 离心管中。 2.低渗溶解红细胞（红细胞溶血） 0.87% NH4Cl 溶液 股骨骨髓细胞悬液的制备 冲洗骨髓腔 ： 用剪刀剪开股骨的一端，将注射器针头插入股骨开 口端。然后用剪刀剪开股骨的另一端，用D-Hanks 液多次冲洗骨髓腔，收集细胞悬液于离心管中。 D-HANKS液(无钙镁离子的HANKS液) 配方 NaCl 80.0克 Na2HPO42H2O 0.6克 （如为12H2O，则需1.2克 ） KCl 4.0克 KH2PO4 0.6克 双蒸水 1000毫升 原液稀释10倍即为使用液- D-Hanks液 细胞计数和细胞存活率 利用单细胞悬液进行实验研究时，通常需要确定细 胞悬液的细胞密度和活细胞的数量，这就要进行细 胞计数和细胞存活率的测定。 细胞计数一般用血球计数板，细胞存活率的测定 一般采用染色法。 细胞密度：每ml细胞悬液中的细胞数 细胞成活率：总细胞中活细胞所占的百分比 血球计数板的结构 血球计数板是特制的厚载 玻片，中央区域有四条凹 槽而形成三个平台，中间 平台较宽，它又被一短横 槽分隔为两部分，每一部 分均有一个方格网。 v每一方格网可分为 九个大方格。 v四角4个大方格分 别被分为16个中方 格。 v中央大方格分为25 个中方格，每个中 方格又可分为16个 小方格。中央大方 格共含有400个小 方格。 双线分隔双线分隔 血球计数板的原理 白细胞计数法采用四角4 个大方格的区域，适用于 细胞较大数量较少的样品 红细胞计数法采用中央大 方格的区域 血球计数板的原理 计数室大方格边长为1mm，面积为1mm2，中间平台与 盖玻片之间的距离（高）为0.1mm，所以每个大方格 的固定容积为0.1mm3。 血盖片血盖片 计数室计数室 血球计数板的计数公式1 每个大方格的总体积为0.1mm3 1 ml =1000 mm3, 0.1 mm3 = 10- 4 ml 每角大方格的细胞数10000 = 细胞数/ml 4角大方格中细胞总数 细胞密度= 104 4 稀释倍数= 细胞数/ml悬液 计数规则 v位于格线上细胞只 计上边线和左边线 上的， 即“数上不 数下，数左不数右 ” v由两个以上细胞组 成的细胞团，应按 单个细胞计算。 注意事项 v向血球计数板加样前 ，须将细胞悬液充分 摇匀； v加样过程中，应避免 将细胞悬液滴在盖玻 片（血盖片）上，避 免有气泡产生； v细胞悬液密度过大时 ，应适当稀释后再计 数 。 加样处加样处 细胞密度的结果记录 左上 角 左下 角 右上 角 右下 角 细胞 总数 稀释 倍数 细胞 密度 脾脏 淋巴 细胞 骨髓 细胞 在10的低倍镜下计数，细胞为透亮的小圆点。 细胞成活率的测定 利用染色法，判断细胞的死活； 活细胞的细胞膜具有选择通透性，不能被 台盼蓝染色，呈无色透明状； 死细胞的细胞膜通透性增大，被染成蓝色； 细胞总数死细胞数 细胞存活率= 100% 细胞总数 在载玻片上操作 注意事项 应在短时间内完成细胞存活率的测定，否则活细 胞会被染料毒死而着色，影响实验结果的准确性 ； 应在几个视野下计算死活细胞的数量，避免人为 因素的干扰； 可以在40倍的高倍镜下，计算视野中的细胞总 数和其中的死细胞数。 细胞成活率的结果记录 视野 1 视野 2 视野 3 视野 4 细胞 总数 死细 胞总 数 细胞 成活 率 脾脏 淋巴 细胞 骨髓 细胞 血球计数板的计数公式2 中央大方格的总体积为0.1mm3 中央大方格的细胞数1000 = 细胞数/ml 5个中方格中细胞总数 细胞密度= 25 104 5 稀释倍数= 细胞数/ml悬液 v每一方格网可分为 九个大方格。 v中央大方格分为25 个中方格，每个中 方格又可分为16个 小方格。中央大方 格共含有400个小 方格。 双线分隔双线分隔 实验报告 实验过程中将原始数据记录在实验讲义中； 在实验报告纸上进行实验数据的计算和结果分析 ； 回答问题； 阅读文献资料。 成 绩 每次实验报告均打分并累计为平时成绩； 如发现实验报告和作业的抄袭，抄袭者和被抄袭 者的成绩均记为0分。 显微镜的组成部分 目镜 观察筒 物镜转换台 物镜 标本夹 载物台 X,Y轴旋纽 电源开关 光强调节纽 光源 聚光镜升降旋钮 光阑调节器 调节瞳间距调 节屈光度 所需物镜、 聚焦