紫外-可见光谱仪操作使用介绍.ppt

紫外可见光谱操作使用介绍 基本知识 w电磁辐射与紫外光谱 光是一种电磁辐射，从波长极短的宇宙射线至波长 很长的无线电构成一个连续光谱。 部分电磁辐射范围 远紫外 100200 nm 近紫外 200400 nm 可见光 400800 nm 近红外 8002500 nm 远红外 25003500 nm 紫外光谱由分子外层电子在不同能级间 跃迁产生。 w朗伯比尔定律(Lambert-beer) A=吸光度 I0=入射光强度 I=入射光通过样品后的透射强度 摩尔吸光度（cm-1.m-1） C=摩尔浓度(mol) l=光程(cm) 当产生紫外吸收的物质为未知物时，其吸收强 度可 用表示: A=吸光度 c为100ml溶剂中溶质的克数 l=光程(cm) 选取溶剂需注意下列几点： 1) 当光的波长减小到一定数值时，溶剂会对它产 生强烈的吸收(即溶剂不透明)，这即是所谓“端吸收” ，样品的吸收带应处于溶剂的透明范围。透明范围 的 最短波长称透明界限。 2) 样品在溶剂中能达到必要的浓度(此浓度值决定 于样品摩尔吸收系数的大小)。 3) 要考虑溶质和溶剂分子之间的作用力。一般溶 剂分子的极性强则与溶质分子的作用强。因此应尽 量采用低极性溶剂。 4) 为与文献对比，宜采用文献中所使用的溶剂。 5) 其它如溶剂的挥发性、稳定性、精制的再现性 等。 基本原理 w 电子跃迁产生紫外可见吸收光谱 分子的总能量是其键能(电子能)、振动能和转动能 的总和，当分子从辐射的电磁波吸收能量之后，分 子会从低能级跃迁到较高的能级。吸收频率决定于 分子的能级差，其计算式为： E = h 或 E = hC / 式中 E为分于跃迁前后能级差； 、分别为所吸收的电磁波的频率及波长 C为光速； h为普朗克常数。 分子的电子状态能约为 8.38 1048.38 105 (J/mol) (4.19105相当于286nm处发生紫外吸收) 分子振动能约为4.191032.09104 (J/mol)，分子 转动能约为41941.9 (J/mol)。 虽然每项能量不同,且有一定的变化范围,但其 变化均是量子化的 。由上可见,分子从电子基态跃 迁到电子激发态的 E远大于振动能级,转动能级的 E。因此,电子跃迁所吸收的电磁波是吸收光谱中 频率最高的,即紫外可见光. w紫外吸收谱带的形状 紫外吸收谱带之所以是较宽,纯的形状,这可通 过下图加以说明。 以双原子分子为例 位能曲线上的横线表示振动能级(转动能级未表 示)。分子吸收电磁波能量后,电子从基态 s0跃迁 到激发态,其同时伴随有振动能级的跃迁,跃迁时 核间距离保持不变(Franck-Condon原理)。它们 和原能级(s0，v0 )之间的能级差分别为I、II、III 。由于此时还伴随着转动能级的跃迁,所以围绕I 、II、III,有一系列分立的转动能级跃迁谱线(图 a),这种谱只能在稀薄气态下测得,当气态压力增 大,即浓度增大时,转动能级受限制,形成连续曲 线(b)，在低极性溶剂中测定紫外吸收,还能保留 一些紫外吸收的精细结构(c),在高极性溶剂中作 图,精细结构完全消失(图d)。 w多原子分子电子能级跃迁的种类 有机化合物外层电子为:键的电子;键的 电子;未成键的孤电子对n电子,它们所可能发 生的跃迁,定性地可用下图表示。 w基本术语 a.生色团(chromophore)：产生紫外(或可见)吸 收的不饱和基团，如CC、CO、NO2等。 b.助色团(auxochrome)：其本身是饱和基团(常 含杂原子)，它连到生色团时，能使后者吸收波 长变长或吸收强度增加(或同时两者兼有)，如： OH、 NH2、Cl等。 c.深色位移(bathochromic shift) ：由于基团取 代或溶剂效应，最大吸收波长变长。深色位移 亦称为红移(red shift)。 d.浅色位移(hypsochromic shift) 由于基团取 代或溶剂效应，最大吸收波长变短。浅色位 移亦称为蓝移(blue shift)。 e.增色效应(hyperchromic effect) 使吸收强 度增加的效应。 f.减色效应(hypochromic effect) 使吸收强度 减小的效应。 各类化合物的紫外吸收 w简单分子 A.饱和的有机化合物 a.饱和的碳氢化合物 唯一可发生的跃迁为 * ，能级差很大，紫外 吸收的波长很短，属远紫外范围。如甲烷、乙烷的 最大吸收分别为125nm、135nm。 b.含杂原子的饱和化合物 杂原子具有孤电子对，一般为助色团，这样的化 合物有n *跃迁。但大多数情况，它们住近紫外 区仍无明显吸收。硫醚、二硫化物、硫醇、胺、溴 化物、碘化物在近紫外有弱吸收，但其大多数均不 明显。 B.含非共轭烯、炔基团的化合物 这些化合物都含电子，可以发生*跃迁，其 紫外吸收波长较 *为长，但乙烯吸收在 165nm、乙炔吸收在173nm。因此，它们虽名为 生色团，但若无助色团的作用，在近紫外区仍无 吸收。 C.含不饱和杂原子的化合物 在这类化合物中， *、 *属远紫外吸收 ， n *亦属远紫外吸收，不便检测，但n * 跃迁的吸收波长在紫外区，可以检测。虽然n *的跃迁为禁阻跃迁，吸收强度低，但毕竟其 吸收位置较佳，易于检测。因此，在紫外鉴定中 是不应忽视的。 w含有共轭体系的分子 A.共轭体系的形成使吸收移向长波方向 右图显示了从乙烯变 成共轭丁二烯时的电子能 级的变化。原烯基的两个 能级各自分裂为两个新的 能级，在原有*跃迁 的长波方向出现新的吸收。 一般把共轭体系的吸收带称为K带(源于 德文konjugierte)。K带对近紫外吸收是重要 的，因其出现在近紫外范围，且摩尔吸收系 数也高，一般10000。 w共轭烯吸收的计算值 注意：用上述规则进行计算时，有计算误差较大的例 外情况。当存在环张力或两个烯键不处于同一平面 而影响共扼体系的形成时，计算值都偏离实测，菠 烯即是一例： 因两个环的张力，提高了电子基态的能量。 w共轭醛、酮紫外吸收(K带)的计算 w，不饱和酸、酯 一些共轭羧酸的UV吸收： 化合物 实测值（104）计算值 CH2=CHCO2H 200（1.0） CH3CH=CHCO2H 205（1.4） =CHCO2H 220（1.4）222（2175） CH3(CH=CH)2CO2H 254（2.5）256（3018208） CH3(CH=CH)3CO2H 294（3.7）286（6018208） CH3(CH=CH)4CO2H 332（4.9）316（9018208） 芳香族化合物 w苯 苯环显示三个吸收带，它们均起源于苯环* 的跃迁，如下表所示。其中II、III为禁戒跃迁。 w烷基苯 烷基无孤电子对，但它的超共轭效应使苯环B吸收带 略有深色位移，对E吸收带效应不明显。 苯环上有CH2OH、(CH2)nOH、CH2NH2等取 代时，助色团被一个或多个CH2与苯环隔离开了，因 此它们的紫外吸收光谱与甲苯相近。 苯环上有CH2ph、CH2CHO、CH2CH=CH2等 取代基时，生色团被CH2隔开而不能和苯环形成共轭 体系，因此紫外吸收不发生红移。CH2的这种作用称 为“隔离效应”。 w助色团在苯环上取代的衍生物 助色团有孤电子对，它能与苯环电子共轭， 所以助色团在苯环上的取代使B带、E带均移 向长波方向，B带被强化，同时精细结构常消 失。 w生色团在苯环上取代的衍生物 生色团在苯环上取代后，苯环的大键和生色 团的键相连产生更大的共扼体系，这使B带产 生强烈的深色位移且在200250nm之间出现 一个K带(10000)，有时B带淹没在K带之 中。 若按对E2带深色位移的大小，生色团排列 的顺序为： NO2CHOCOCH3CO2HCOO-CN 上述生色团都是苯环的间位定位取代基。 w多取代苯环 a.对位取代 当两个取代基属相同类型时，双取代的最长吸收波 长近似为两者单取代时的最长波长。当两个取代基 类型不同时(即一个是间位定位取代基，另一个是邻 、对位定位取代基)，两个取代所产生的深色位移大 于单个取代基产生的深色位移之和。这种现象可用 共振效应来解释： w邻位或间位取代 此时两个基团产生的深色位移近似等于它们单取代时产生的 深色位移之和。 w杂芳环化合物 五员杂芳环按照呋喃、吡咯、噻吩的顺序增强 芳香性，其紫外吸收也沿此顺序逐渐接近于苯的吸 收。在上述三种杂芳环中，硫的电子较氮、氧能更 好地和二烯的电子共轭，因此噻吩的紫外吸收在 最长波长。生色团、助色团的取代，导致五员杂芳 环的紫外吸收发生较大的变化(深色位移和增色效应 )。 吡啶的共轭体系和苯环相类似，故吡啶的紫外 吸收类似于苯的紫外吸收， 吡啶在251nm处的吸收 强，2000，也显示精细结构。 紫外谱图的解析 w隔离效应与加和规律 设A为生色团，B为生色团或助色团。当A与B相连 生成AB时，若B为生色团，二者形成更大的共轭 体系；若B为助色团，助色团的孤电子对与A形成p 、共轭，相比于A，AB出现新的吸收(一般均为 强化了的吸收)。 设C为不含杂原子的饱和基团，在ACB结构中 ，C阻止了A与B之间的共轭作用，亦即C具有隔离 效应。从另一方面来看，ACB的紫外吸收就是 A、B紫外吸收之加和。这称为“加和规律”。 w紫外谱图提供的结构信息 紫外谱图提供的主要信息是有关该化合物的共轭 体系或某些碳基等的存在的信息。可以粗略地归 纳为下述几点： 化合物在220800nm内无紫外吸收，说明该 化合物是脂肪烃、脂环烃或它们的简单衍生物( 氯化物、醇、醚、羧酸等)，甚至可能是非共轭 的烯。 220250nm内显示强的吸收(近10000或更 大)，这表明K带的存在。即存在共扼的两个不饱 和键(共轭二烯或， 不饱和醛、酮)。 250290nm内显示中等强度吸收，且常显示 不同程度的精细结构，说明苯环或某些杂芳环的 存在。 250350nm内显示中、低强度的吸收，说明 碳基或共轭羰基的存在。 300nm以上的高强度吸收，说明该化合物具 有较大的共轭体系。若高强度吸收具有明显的精 细结构。说明稠环芳烃、稠环杂芳烃或其衍生物 的存在。 解析紫外谱图方法及有关注意事项 a.紫外光谱也是吸收光谱，解析谱图时，应同 时顾及吸收带的位置、强度和峰的形状三个 方面：从吸收带位置可估计产生该吸收的共 轭体系的大小；吸收强度有助于K带、B带和 R带的识别；从吸收带形状可帮助判断产生 紫外吸收的基团。如某些芳环衍生物，在峰 形上显示一定程度的精细结构。 b.立体位阻的作用常 使一些共轭体系的吸 收带发生明显的蓝移。 这是由于共轭体系的 共平面性受到破坏所 致。 C.介质的影响 在进行紫外测定时，介质常有较重要的影响 。总的说来，相对于该化合物蒸汽的紫外吸 收，低极性溶剂的溶液其紫外吸收变化小， 高极性溶剂的溶液其紫外吸收变化大，且精 细结构消失。因此一般应尽量采用低极性溶 剂。 n*跃迁，当溶剂极性增强时，有明显 的蓝移，其原因为化合物基态较激发态极性 强，它和极性溶剂形成较强烈的氢键，从而 增加了跃迁的能量，导致蓝移。 *跃迁，当溶剂极性增强时，常有红 移(不如n*跃迁溶剂极性增加时的蓝移明 显)。其原因为激发态极性较基态大，当溶剂 极性增加时，激发态因生成较强的氢键，能 量降低较多，因而有红移。 苯环E2带(204nm)的溶剂效应需视衍生物个 取代基的性质而定。取代基为邻、对位取代 基时，溶剂效应很小；取代基为间位取代基 时，随溶剂极性的增加而产生红移。 对具有酸碱性的一些有机物，如：酚、苯胺 等，溶液的PH值对其吸收位置有很明显的影 响。 最常用的标推谱图仍为萨特勒(Sadtler)紫外 谱图，因它同时有核磁共振氢谱、核磁共振 碳谱、红外谱，且有上述谱图的综合索引， 因此查阅萨特勒谱图是十分方便的，其查阅 方式和查萨特勒红外谱相似。 紫外光谱应用举例 紫外光谱在决定一系列维生素、抗菌素及一 些天然物结构曾起过重要作用，如维生素A1 、A2、B12、B1、青霉素、链霉素、土霉素、 萤火虫尾部的发光物质等。 例如：CS2CH3CHO C5H10N2S2 有两 种可能结构，利用UV谱进行判断。 NH3 (A) (B) 解：先选取两个模型化合物 max：276（2.1104） 246（8103） max：217（8000） 实测未知物（A或B）的UV数据为： 由此推测为化合物A。 max：288（1.28104） 243（8000） 松香酸 235248nm 左旋海松酸 260283nm 紫外吸收光谱用来决定双键的位置，既简单 又有效，例如： 又如： 紫罗兰酮 紫罗兰酮 紫罗兰酮由于双键共轭，其紫外吸收波长较紫罗 兰酮明显地到了长波方向。 UV-1201紫外可见分光光度计的使用 w一、整机结构 wUV-1201紫外可见分光光度计分光光度计 主 机由光源、单色器、样品室、检测系统、电机 驱动、计算机接口，电源等部分组成。 软件的启动： 启动UV-1201紫外可见分光光度计应用 程序，软件将自动进入到自检画面，自检 前请先将仪器预热至少10分钟。 基本操作： 设置换灯点： （1）在“设置-仪器”菜单栏中可以设置换灯点，建 议除特殊测量（如氘灯谱线）外不要更改。 （2）开关氘灯和钨灯： 如果长时间不用 氘灯或钨灯，可以在自检后点击“ 设置-仪器”菜单下的氘灯或钨灯键将其关闭以节省 灯的寿命。但在关闭之后需间隔最少1分钟才能重新 开启，并需要预热最少10分钟才能使仪器达到最佳的 测量效果。 光谱扫描 光谱扫描测量方式可用于样品的定性分析，它如实 地显示样品的全波长图谱，或打印出来，是化学分 析工作者的常规分析手段。 （1）启动光谱扫描功能 点击工具栏上的“光谱“项，再点击“参数”进入参数 页面；参数有两种类型：选择型和输入型。 选择型：用户将鼠标指点到相应的选项单击即可。 如测量方式、取样间隔、光谱带宽。 输入型：需输入数字量。如：波长范围、光度范围 以下几个参数在使用中应注意： A、光度范围： 此参数与测量无关。如选择不当，显示的图谱会 失真或根本看不见，但测量结束或测量过程中可 重新将其调到合适的范围。 B、取样间隔： 光谱峰谷尖锐的应选取较小的取样间隔，但间隔 越小测量所需的时间越长。同时扫描点数（波长 范围除以取样间隔）不应超过10000点。 C、扫描速度： 扫描速度的选择取决于所需要的测量精度，速度 越慢测量精度越高，但测量的时间也越长，一般 测量快速即可。 （2）测量运行 a设置好参数后，将参比和样品分别放入样池的参比位 和样品位，盖好样品室盖。按下“测量”按钮，选择好 样品所在样池，便可进行测量。早测量中途若需中断 ，可单击“停止”按钮，或直接关闭此页面（画面右上 角第二排“关闭”栏）。 B如果在参数设置的“参比测量”项中选择了“单次”，则 在波长范围和取样间隔都不改变的情况下，下一次测 量将直接测量样品；如果选择“重复”，则每次测量都 会重新测量参比。 （3）波长扫描功能下的图谱处理 单击“数据处理“下的图谱处理菜单功能项，便可 进行图谱处理。 A、标尺查数： 选择工具栏上“标尺”钮或菜单数据处理-标尺 查数“选项可显示标尺（在按隐藏），左右挪动 鼠标或按键盘方向键，可使标尺移动到要观察的 图谱点，当前标尺所在点的数据将显示在右方的 导航器中。 b峰谷检测： 峰谷检测灵敏度是进行峰谷判断的唯一标准， 灵敏度的选择应根据用户需要进行，灵敏度值过 小会导致峰谷过多，不好判断。灵敏度值过则可 能检测不到需要的峰谷。 峰谷检测最多显示100个检测数据。 单击“峰谷检测”按钮，根据需要在弹出的对话框 中输入峰谷检测灵敏度数值，单击“确定”按钮便 可检测出当前图谱的峰谷，绿“+”为峰，红“+”为 谷，同时显示检测的峰谷数值，数据后面的P代 表峰值，V代表谷值。 光度测量 此测量方法可用于多个波长的定点测量，最大 波长点数10个。 启动光度测量功能 单击工具栏上“光度”按钮，再点“参数”进行参数 设置： 测量是依次进行，输入时若按波长从大到小排 列可以加快测量速度。 测量运行 如果选择了“比色皿校正”功能，在测量前必须进 行比色皿配对测量。设置好参数后，在参比池 和样品池中都加入参比溶液，盖好样品室盖； 按下“校正”按钮，仪器自动进行校准。校正完成 后即可进行正式的样品测量（使用同一比色皿 时可多次测量而不需要重新校正）。 如果没有选择“比色皿校正”功能，则直接放入参 比和样品，单击“测量”按钮进行测量。 时间测量 用此测量方法可以观察样品随时间的变化情况 、计算样品的活性值，还可以用此功能考察仪 器的稳定性及噪声。 启动时间测量功能 单击工具栏上“时间”按钮。 进行参数设置 选择测量方式：系光度（Abs）、透过率（T%）并输 入显示光度范围、测量时间、测量波长和取样间隔。 测量运行 如果选择了“比色皿校正”功能，在测量前必须进行比 色皿配对测量，设置好参数后，在参比池和样品池中 都加入参比溶液，盖好样品室盖；按下“校正”按钮， 仪器自动进行校准。校正完成后即可进行正式的样品 测量（使用同一比色皿时可多次测量而不需要重新校 正）。 如果没有选择“比色皿校正”功能，则直接放入参比和 样品，单击“测量”按钮进行测量。 定量分析 定量分析有多中测量方式：单波长标准系数法、双 波长等吸收点法、双波长系数倍率法、三波长法。 关于双波长法与三波长法的理论与应用请参看有关 资料。 启动定量分析功能 单击工具栏上“定量”按钮 单波长标准系数法 进入定量分析功能后，点击“参数“按钮，进入参数 页面，如下图： 单波长标准系数法有两种测量方式：浓度和系数。 如果已知回归函数的系数，则采用系数法，如果用 已知标准浓度溶液来建立曲线来测量，则采用浓度 法。曲线拟合方式有两种：线性拟合和2次拟合。在 测量前首先确定测定波长值，选择好拟合方式，确 定是否需要将零点作为拟合的有效点（仅对浓度法 有效，即已知标样在宁德为零时的吸光度值也为零 ，所以直接将零点加入数据中参与最小二乘法的拟 合）。 浓度法 在定量分析参数设置对话框中，输入测量波长值，选择拟合 方式，选择是否插入零点，输入标样浓度个数，同时在浓度 标样中输入对应的浓度值。设置完毕后，按下“确定“按钮， 进入测量界面。如果用户已经知道标样的吸光度，也可直接 双击标样测量界面下对应的吸光度栏，以输入法来快速的建 立曲线（这时可跳过a2、a3和a4步骤）。 如果选择了“比色皿校正”功能，在测量前必须进行比色皿配 对测量，设置好参数后，在参比池和样品池中都加入参比溶 液，盖好样品室盖；按下“校正”按钮，仪器自动进行校准。 校正完成后即可进行正式的样品测量（使用同一比色皿时可 多次测量而不需要重新校正）。 如果没有选择“比色皿校正”功能，则直接放入参比和样品， 单击“测量”按钮进行测量。 按下标样按扭，此键将变成未知样，（此按扭用于 定量分析功能下切换标样与未知样的测量页面