浅议青霉素结合蛋白测定技术(1)

精品文档 2016 全新精品资料 全程指导写作 独家原创 1 / 3 浅议青霉素结合蛋白测定技术 (1) 【论文关键词】氘标记 青霉素结合蛋白 聚丙烯酰胺凝胶电泳 荧光放射自显影 【论文摘要】当前 ,细菌耐药性问题日趋严重 ,给临床治疗带来困难 ,对 某些菌青霉素结合蛋白改变造成的耐药性 ,是 般细菌的 前 ,细菌耐药性问题日趋严重 ,给临床治疗带来困难 ,对卜内酞胺类抗生素而言 ,某些菌青霉素结合蛋白改变造成的耐药性 ,是卜内酞胺类抗生素的特点。一般细菌的为胞浆膜上的蛋白质 ,是细菌致死的靶位。它的数目 、位置、亲和力的变化造成与卜内酞胺类抗生素不易结合而产生耐药性。人们常采用 丙烯酞胺凝胶电泳和放射自显影的方法研究 谱 ,以便了解敏感菌和耐药菌的区别。所以 ,定技术是研究压内酸胺类耐药性的重要手段l。的穿透力弱 ,用一般放射自显影法不能获得 谱 ,需采用荧光闪烁剂增效的“荧光放射自显影法”。国内有关定技术报道甚少 ,以 3H 标记者更少 ,本文介绍这一技术。 1 材料与方法 材料 菌种肺炎链球菌 31003,30301。 精品文档 2016 全新精品资料 全程指导写作 独家原创 2 / 3 仅器及药品 垂直板 凝胶电泳槽 ; l 型真空凝胶干燥器 ;a 型台式高速冷冻离心机 ;8438 一超低温冰箱 ;电泳仪 型 ;丙烯酞胺 ;甲撑双丙烯酞胺 .;N,N,N,N 一四甲基乙二胺 ;3H 标记青霉素乙酞呱陡盐 ;x 光底片 ;2,5 一二苯基嗯哇 ;月桂酞肌氨酸钠 ;十二烷基硫酸钠 ;二甲基亚矾。 方法 肺炎链球菌 品的制备将肺炎链球菌按种 c+7过夜培养 ,次日再移种新鲜培养基中 ,37培养23菌数约为个 /液分装试管 ,每管 7保温 10冰浴中加入 5 非标记青霉素 G 钠盐 20 万单位 /冻离心5000:/ ,弃去上清 ,菌体沉淀用 50 以磷酸缓冲液做成菌悬液 ,然后加入 5 一 10 拼一 20%7保温10细胞溶解 ,加入 30 协一样品缓冲液 ,煮沸 3室温备用。 聚丙烯鱿胺凝胶电泳采用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酞胺凝胶电泳方法。制备凝胶薄片 ,凝胶配方 :分离胶 :0%蒸馏水 ,真空搅拌 10 一15再加入 缩胶 :按上述配方依次 为 ,而 ,和 150。先配制分离胶 ,灌注直立式电泳槽后 ,使凝胶凝固。次日加入浓缩凝胶 ,放入加样梳 ,静置 2h。在加样槽内依精品文档 2016 全新精品资料 全程指导写作 独家原创 3 / 3 次分别加入 品。接通电流 ,第一小时维持电压在 60v,至染料前沿到达分离胶和浓缩胶交界处调高电压至 120v,走完全程约需 3 一 4h,用考马斯蓝 色 30 一 45夜脱色。 关光放射自显影方法凝胶片用二甲基亚矾处理30用新鲜 次处理 30 而 n,20%即。处理 2 一3h,l%甘油和 1%乙酸处理 凝胶片贴附在厚滤纸上 ,使用凝胶真空干燥器进行真空干燥 ,将凝胶片和 x 光底片贴紧 ,置于 x 光射线暗匣内 ,放超低温冰箱一 70使曝光 1 定影 ,冲洗得到 放射自显影图谱。 x 光底片预曝光条件 :国产 x 光底片用照相闪光灯红色滤光片 ,加 6层红色玻璃纸滤过 ,x 光底片上覆盖 6 层红色玻璃纸 ,距离50光灯闪二次 ;进